Nghiên cứu tạo β-Cyclodextrin từ dịch xử lý tinh bột với cgtase cố định

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 289 NGHIÊN CỨU TẠO Β-CYCLODEXTRIN TỪ DỊCH XỬ LÝ TINH BỘT VỚI CGTASE CỐ ĐỊNH Vương Văn Sơn*, Vũ Thanh Thảo*, Trần Hồng Ngân*, Trần Thành Đạo*, Trần Cát Đông* Mở đầu: Cyclodextrin (CD) là các oligosaccharide dạng vòng chứa 6, 7, 8 đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết α-1-4 glycosid, trong đó β-cyclodextrin (β-CD) được sử dụng nhiều nhất. CD được sản xuất nhờ xúc tác của enzym cyclodextrin glucanotransferase. Enzym này có tác dụng vòng hóa tạo CD từ các cơ chất có liên kết α-1,4-glycosid như tinh bột, amylose, amylopectin, dextrin, maltodextrin, hoặc glycogen. Mục tiêu: Trong nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu việc tạo β-CD từ dịch tinh bột xử lý với enzym cố định trên alginat. Phương pháp: Khảo sát các điều kiện tạo β-CD từ enzym cố định bao gồm: nồng độ dịch tinh bột xử lý, lượng CGTase, thời gian phản ứng. Sản xuất β-CD theo qui trình sử dụng dung môi là cyclohexan. Số lần tái sử dụng enzym sau cố định được xác định bằng số lần sử dụng enzym cho đến khi hoạt tính hay hiệu suất chuyển đổi tinh bột thành β-CD còn khoảng 50% so với ban đầu. Kết quả: Xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng tạo β-CD từ dịch xử lý tinh bột với enzym cố định là: nồng độ dịch tinh bột xử lý 26%, thời gian phản ứng 61 h, lượng enzym CGTase là 2,91 KU/L. Hiệu suất chuyển đổi từ tinh bột thành β-CD là 51%. Và enzym CGTase có khả năng tái sử dụng 5 lần trong quy trình tạo β-CD. Kết luận: Xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng vòng hóa từ dịch xử lý tinh bột bằng enzym cố định trên alginat với lượng β-CD tạo thành là 181,7 g/L. Từ khóa: β-CD; CGTase; enzym cố định; alginat, dịch tinh bột xử lý. ABTRACT INVESTIGATION ON Β-CYCLODEXTRIN PRODUCTION FROM HYDROLYZED STARCH BY IMMOBILIZED CGTASE Vuong Van Son, Vu Thanh Thao, Tran Hong Ngan,Tran Thanh Dao, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 289 - 294 Background: Cyclodextrins are cyclic oligosaccharides composed of 6, 7, or 8 α-1,4-linked glucose units, respectively classified as α, β and γ. in which β-cyclodextrin (β-CD) is used most. They are produced by the catalytic action of cyclodextrin glucanotransferase. The enzyme displays its cyclic action on substrates with α-1,4- glycosyl chain, such as starch, amylose, amylopectin, dextrins, matodextrins, or glycogen Objectives: In this study, we investigated the producing of β-CD from hydrolyzed starch with immobilized CGTase on alginate. Methods: Surveying of conditions to product β-CD with immobilizated GTase including hydrolyzed starch concentration, concentration of CGTase and reaction time. β-CD was produced by solvent process with cyclohexan. Recycling of immobilized enzyme was determined until enzymatic activity or the conversion efficiency of starch into β-CD was about 50% from baseline. Results: The result showed that the optimal conditions of β-CD production on hydrolyzed starch with immobilizated CGTase were hyrolyzed starch 26%, reaction time 61h, enzym CGTase concentration 2,91 KU/L. Convertion yield to β-CD from starch was 51%. And immobilized CGTase was re-used 5 times in β-CD ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS Vương Văn Sơn ĐT: 0908747086 Email: vuongvanson@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 290 production. Conclutions: Optimum conditions of cylic reaction from hydrolyzed starch with immobilized CGTase on alginate were indentified with the yield of β-CD was 181,7 g/L. Keywords: β-CD; CGTase; immobilizated enzyme; alginate, hydrolyzed starch. ĐẶT VẤN ĐỀ Cyclodextrin (CD) là các oligosaccharide dạng vòng, không khử, chúng có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và hóa học. Trên thế giới, CD đã được ứng dụng từ rất lâu và trong nhiều lĩnh vực do cấu trúc đặc biệt của chúng. Trong công nghiệp thực phẩm CD được dùng để che giấu mùi, vị khó chịu, để ổn định và bảo vệ các thành phần chức năng như acid amin, vitamin trong thực phẩm, làm phụ gia độn, tạo độ nhớt,Đối với ngành dược CD là một tá dược quan trọng giúp tăng độ tan của các dược chất không tan trong nước, giúp tăng độ hấp thu và sinh khả dụng hoặc kiểm soát tốc độ phóng thích thuốc, ngoài ra nó còn giúp che dấu mùi, vị khó chịu của nhiều hoạt chất (3,10). Tuy nhiên, tá dược này hiện nay phải nhập ngoại hoàn toàn. Việc sản xuất được β- cyclodextrin trong nước sẽ giúp tự chủ được nguồn nguyên liệu làm thuốc và tạo điều kiện để công nghiệp dược phẩm trong nước ứng dụng bào chế các chế phẩm có chất lượng cao, cạnh tranh được với các sản phẩm ngoại nhập. Mặt khác nguyên liệu để sản xuất β-cyclodextrin từ tinh bột giúp tạo ra giá trị gia tăng mới cho tinh bột, qua đó thúc đẩy sự phát triển ngành công nghiệp chế biến nông sản. Sản xuất CD chỉ có một con đường duy nhất là bằng công nghệ enzym sử dụng cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase) với nguyên liệu là tinh bột hoặc dextrin (1,6). Nhưng enzym CGTase có hoạt tính cắt mạch tinh bột yếu hơn so với hoạt tính chuyển nhóm glucan và phản ứng tạo vòng, nếu sử dụng nồng độ tinh bột cao, độ nhớt của dung dịch tăng làm giảm hoạt tính của enzym CGTase, cũng như khả năng tăng nồng độ tinh bột ban đầu nhằm thu dược lượng β-CD nhiều hơn(1). Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát việc cắt mạch tinh bột với Termamyl để thu các dextrin ngắn giúp cho quá trình thực hiện vòng hóa thu sản phẩm β-CD nhanh hơn và điều kiện của phản ứng tạo β-CD với enzym cố định trên alginat từ dịch xử lý tinh bột. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Enzym Toruzyme ® 3.0L (Novozymes, Đan Mạch) với hàm lượng protein là 5,03 mg/ml và hoạt tính là 45,25 U/mg protein; chất mang natri alginat (Xilong, Trung Quốc); enzym Termamyl 120L (Novozymes, Đan Mạch), tinh bột sắn mì (Thiêm Ký, Việt Nam); dung môi cyclohexan (Xilong, Trung Quốc). Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzym Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Bradford. Hoạt tính enzym CGTase xác định bằng phương pháp Kaneko trong đó một đơn vị hoạt tính của enzym được định nghĩa là số μmol β- CD được tạo ra trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm(2). Cố định enzym trên alginat Enzym CGTase cố định lên alginat theo phương pháp bắt giữ. Quy trình cố định như sau: chuẩn bị dung dịch alginat 4% trong đệm Tris-HCl 50 mM pH 7, thêm CGTase với lượng 300 U/10ml alginat; dùng bơm nhu động nhỏ hỗn hợp trên vào dung dịch CaCl2 0,2 M để được hạt alginat; để hạt ổn định khoảng 1 giờ cho việc trao đổi ion Ca2+ xảy ra hoàn toàn. Lọc hạt qua phễu Büchner, rửa cho hết protein với nước cất. Bảo quản CGTase cố định trên alginat ở 4oC. Hoạt tính của enzym cố định xác định theo phương pháp Kaneko là 33,16 U/g chất mang(2). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 291 Khảo sát việc tiền xử lý tinh bột với Termamyl 120L thu dịch xử lý có DE 14-15 Khảo sát tiền xử lý với Termamyl tinh bột có nồng độ: 30, 40, 50, 60% với lượng enzym là 2,4KU/L nhiệt độ 90oC, pH7 vì theo các nghiên cứu nồng độ tinh bột thường sử dụng để thu nhận maltodextrin thường từ 30% trở lên. Sau khi chọn được nồng độ tinh bột thích hợp chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lượng enzym Termamyl 120L sử dụng, thời gian dịch hóa ở pH 7, nhiệt độ 90oC; Với thời gian phản ứng khảo sát trong khoảng từ 30, 60, 90 và 120 phút; lượng enzym sử dụng là 14,4 KU/L, 19,2 KU/L và 24 KU/L tương ứng với lượng Termamyl khoảng 0,03% đến 0,05% so với lượng tinh bột sử dụng. Enzym Termamyl sau khi xử lý tinh bột sẽ được bất hoạt ở pH 3,5 bằng HCl 1N, trong 30 phút. Sau 30 phút, thêm NaOH để điều chỉnh pH của dịch tinh bột về pH 7. Tinh bột sau khi xử lý sẽ được lọc để thu dịch(7,8). Trong đó, DE của dịch xử lý tinh bột xác định bằng phương pháp Miller và hiệu suất chuyển đổi tinh bột thành maltodextrin được xác định thông qua độ Brix của dung dịch. Tối ưu hóa quy trình tạo β-CD thô từ dịch xử lý tinh bột Sau khi thu được dịch xử lý tinh bột, tiến hành tối ưu hóa các thông số của phản ứng tạo β-CD theo phương pháp bề mặt đáp ứng với phần mềm Design Expert V 7.1 (DX 7.1). Các yếu tố khảo sát gồm nồng độ dịch xử lý tinh bột, lượng enzym sử dụng và thời gian phản ứng với thể tích phản ứng 100 ml, các thông số phản ứng lựa chọn dựa trên tỉ lệ enzym cơ chất quy trình sản xuất từ tinh bột và theo nghiên cứu của Karube về quá trình sản xuất β-CD từ maltodextrin(4,6). Hình 1: Phản ứng tạo β-CD từ tinh bột với quy trình sử dụng dung môi Khảo sát khả năng tái sử dụng enzym cố định trên alginat để sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột Tiến hành sản xuất β-CD bằng enzym cố định trên alginat với 100 ml dịch xử lý tinh bột DE 14-15 với các điều kiện tối ưu đã khảo sát. Sau phản ứng lấy một lượng enzym đã cố định để xác định hoạt tính enzym theo phương pháp Kaneko. Enzym cố định được lọc và rửa nhiều lần với dung dịch đệm, tiếp tục sử dụng cho những phản ứng tiếp theo cho đến khi hoạt tính riêng còn 50% so với ban đầu. KẾT QUẢ Tiền xử lý tinh bột với Termamyl 120L Khảo sát nồng độ tinh bột để tiền xử lý với Termamyl với lượng enzym là 24 KU/L, thời gian phản ứng 120 phút. Bảng 3: Khảo sát nồng độ tinh bột của quá trình tiền xử lý Nồng độ tinh bột (%) Đương lượng Dextrose (DE) Độ Brix dung dịch Đăc điểm dịch tinh bột sau xử lý 30 41 25,6 Dịch tinh bột trong 40 32 34,5 Dịch tinh bột trong 50 18 30,4 Dịch đục, còn tinh bột 60 17 29,7 Dịch đục, còn tinh bột Dựa vết quả khảo sát nồng độ tinh bột ban đầu từ 50 đến 60%, chúng tôi thấy dịch tinh bột sau xử lý rất đục, chứng tỏ trong mẫu vẫn cón tinh bột chưa xử lý. Mặt khác ở nồng độ tinh bột quá cao sẽ làm tăng độ nhớt của dung dịch do đó enzym khó tác động lên cơ chất làm giảm hoạt tính của enzym. So sánh giữa nồng độ tinh bột 30% và 40%, có cùng hiệu suất xử lý tinh bột như nhau, do đó chúng tôi chọn nồng độ tinh bột 40% để tiền xử lý tinh bột (tạo ra 34,5g tinh bột xử lý so với 25,6 g ở nồng độ tinh bột 30%). Sau đó tiếp tục khảo sát lượng enzym và thời gian phản ứng để thu được dịch tinh bột sau xử lý có DE từ 14-15) và thời gian phản ứng (30 đến 120 phút) đến việc tiền xử lý tinh bột, với nồng độ tinh bột là 40%, pH 7, nhiệt độ 90 oC. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 292 Bảng 4: Đương lượng Dextrose của dịch tinh bột sau khi xử lý Lượng enzym Termamyl 120L (KU/L) Thời gian phản ứng (phút) 30 60 90 120 14,4 9 11 15 23 19,2 12 14 20 25 24 17 21 26 32 Bảng 5: Độ Brix của dịch tinh bột sau khi xử lý Lượng enzym Termamyl 120L (KU/L) Thời gian phản ứng (phút) 30 60 90 120 14,4 17,45 21,42 28,95 31,25 19,2 20,33 28,96 31,36 33,64 24 25,14 29,96 32,63 34,47 Khi tăng nồng độ Termamyl và thời gian phản ứng thì DE của dịch phản ứng tăng lên. Với nồng độ enzym Termamyl là 14,4 KU/L, thời gian phản ứng 90 phút và enzyme 19,2 KU/L, thời gian phản ứng 60 phút cho DE của dịch phản ứng là 15; với lượng enzym là 24 KU/L sau thời gian 30 phút, DE của dịch phản ứng là 17, do vậy cần giảm thời gian phản ứng để đạt DE 15. Bên cạnh đó so sánh hiệu quả của quá trình chuyển đổi thì thời gian phản ứng kéo dài có thể gia tăng khả năng chuyển tinh bột thành maltodextrin. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi chọn điều kiện tiền xử lý tinh bột là nồng độ enzym sử dụng là 19,2 KU/L với thời gian phản ứng là 60 phút cho hiệu suất chuyển đổi tinh bột là 72,4%. Tối ưu hóa quy trình sản xuất β-CD từ tinh bột tiền xử lý Sau quá trình xử lý tinh bột với Termamyl thu được dịch xử lý tinh bột DE 14 có nồng độ 29%, bên cạnh đó theo nghiên cứu của Isao Karube(4), lượng β-CD có thể tạo ra tối đa với nồng độ maltodextrin là 40% (kl/tt), tuy nhiên ở nồng độ 40% hiệu suất phản ứng giảm gần 1,5 so với nồng độ maltodextrin từ 20 đến 30%. Do đó chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dịch tinh bột xử lý với các nồng độ 23%, 26% và 29%. Đối với lượng enzym CGTase tự do phản ứng sử dụng tỉ lệ enzym tương tự kết quả khảo sát trên cơ chất tinh bột, với lượng enzym khảo sát là: 1400, 2800 và 4200 U/L với thời gian phản ứng là 48, 60 và 72 giờ. Các thông số phản ứng được tối ưu theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM- Response surface methodology) bằng phần mềm qui hoạch thực nghiệm Design Expert V7.1 (DX V7.1) để tìm ra mô hình thực nghiệm thích hợp. Phản ứng được thực hiện ở 25oC, tốc độ lắc 150 vòng/phút, lượng cyclohexan là 30% (tt/tt) với thể tích phản ứng 100 ml, gồm 15 thí nghiệm với 3 thí nghiệm trung tâm(5). Bảng 6: Thiết kế thí nghiệm đáp ứng bề mặt (RSM) của dịch xử lý tinh bột Số TN Nồng độ dịch tinh bột xử lý (%) Nồng độ enzym (KU/l) Thời gian phản ứng (giờ) Lượng β- CD (g) 1 23 1,400 60 8,02 2 29 1,400 60 8,68 3 23 4,200 60 7,24 4 29 4,200 60 9,32 5 23 2,800 48 15,71 6 29 2,800 48 9,52 7 23 2,800 72 12,04 8 29 2,800 72 11,44 9 26 1,400 48 8,38 10 26 4,200 48 10,72 11 26 1,400 72 8,86 12 26 4,200 72 14,02 13 26 2,800 60 18,10 14 26 2,800 60 18,46 15 26 2,800 60 18,16 Dựa vào phần mềm cho thấy các dữ liệu về hiệu suất của phản ứng tạo β-CD phù hợp với mô hình bậc hai (Quadratic model) với hệ số R2 của mô hình là 0,90. Ý nghĩa của mô hình sẽ được phần mềm phân tích thống kê ANOVA với giá trị P (p-value) của mô hình là 0,0468 < 0,05. Như vậy, mô hình trên có ý nghĩa thống kê. Hình 2: Tương tác thời gian và nồng độ dịch xử lý tinh bột của phản ứng tạo β-CD Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 293 Phương trình hồi qui của đáp ứng như sau: Lượng CD (g) = - 288,26 + 21,09X1 + 12,52X2 + 0,51X3 - 0,458X12 – 2,96X22 -0,013X32. Với X1, X2, X3 là các biến số đại diện lần lượt cho các yếu tố nồng độ dịch tinh bột xử lý, lượng enzym, thời gian phản ứng. Với hàm mục tiêu trong thử nghiệm này là lượng β-CD tạo ra cao nhất. Điều kiện này được xác định trong phần dự đoán điểm của phần mềm như sau: Nồng độ dịch tinh bột xử lý là 25,86%, thời gian phản ứng là 60,76 h, lượng enzym 2,91 KU/l. Với các giá trị tối ưu này, lượng β-CD được dự đoán là 18,29 g. Công thức dự đoán tối ưu này được đánh giá bằng cách lặp lại 3 lần thu được kết quả lượng β-CD là 18,17 g. Như vậy mô hình đáp ứng có tính tương thích với thực nghiệm cao (99,34%). Phương pháp sản xuất β-CD với từ tinh bột xử lý với Termamyl rút ngắn thời gian sản xuất hai lần và hiệu suất chuyển đổi cơ chất cao hơn 51%, nồng độ cơ chất sử dụng nhiều hơn 40% so phương pháp sản xuất β-CD từ tinh bột là 120 h và 39,95%, 8% theo thứ tự(2). Vậy sản xuất β-CD từ tinh bột tiền xử lý với Termamyl sẽ rút ngắn thời gian sản xuất hơn, tiết kiệm được chi phí sản xuất đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn. So sánh với các nghiên cứu khác với quy trình có sử dụng dung môi cho thấy hiệu suất tạo thành CD trong nghiên cứu này thấp hơn trong nghiên cứu của Zhekova (2009)(11) với hiệu suất là 65% với dung môi là toluen 1%, tuy nhiên nồng độ cơ chất trong nghiên cứu của Zhehova là tinh bột bắp 5%, thấp hơn trong nghiên cứu này (tinh bột sắn 40%); kết quả trong nghiên cứu này cao hơn kết quả tạo CD trong nghiên cứu của Shieh (1994)(9) là 15,5% với nồng độ cơ chất là tinh bột tan 30%, và dung môi sử dụng là cyclohexan 5%. Như vậy hiệu suất chuyển đổi của quy trình tạo CD phụ thuộc nhiều vào loại dung môi sử dụng và cơ chất ban đầu. Khả năng tái sử dụng enzym cố định trên alginat để sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột Bảng 7: Sản xuất β-CD từ dịch tinh bột xử lý với enzym cố định trên alginat Số lần tái sử dụng 0 1 2 3 4 5 6 Lượng β-CD (g) 103,5 4 100,3 0 97,68 96,38 81,52 63,44 40,22 Hiệu suất chuyển đổi (%) 51,77 50,15 48,84 48,19 46,76 31,72 20,11 Do tinh bột đã được cắt mạch tạo dịch tinh bột xử lý với Termamyl nên hiệu quả tác động của enzym cố định cao hơn so với trên cơ chất là tinh bột. Mặt khác thời gian thực hiện phản ứng rút ngắn 2 lần so với sản xuất từ tinh bột nên thời gian sử dụng enzym cố định giảm, vì vậy enzym cố định trên alginat có số lần tái sử dụng cao hơn so với sử dụng cơ chất là tinh bột. Sau 3 lần sử dụng, hiệu suất chuyển đổi giảm 10% so với lần sử dụng đầu tiên, và sau 5 lần tái sử dụng hoạt tính còn 61,27% so với lần đầu. Sau đó hoạt tính của enzym cố định giảm nhanh, chỉ còn 39% so với ban đầu. Vậy enzym cố định trên alginat có khả năng tái sử dụng 5 lần. So sánh về hiệu quả giữa việc sử dụng CGTase cố định và CGTase tự do để tạo β-CD cho thấy sử dụng enzym cố định có thể tiết kiệm 50% chi phí về enzym so với việc sử dụng enzym tự do và có thể dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm khi kết thúc phản ứng. Bên cạnh đó, sản phẩm β-CD (C6H10O5)7 tạo thành từ phản ứng sau khi được tinh chế đạt độ tinh khiết trên 98% và đạt tiêu chuẩn dược dụng. KẾT LUẬN Xác định được điều kiện tối ưu của phản ứng vòng hóa từ dịch xử lý tinh bột bằng enzym cố định trên alginat với lượng β-CD tạo thành là 181,7 g/L. Như vậy, việc ứng dụng enzym cố định trên alginat cho sản xuất β-CD từ dịch xử lý tinh bột là khả thi. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 294 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Biwer A, Antranikian G et al. (2002). Enzymatic production of cyclodextrins. Applied Microbiology and Biotechnology, 59(6):609-617. 2. Brewster ME, Loftsson T (2007). Cyclodextrins as pharmaceutical solubilizers. Adv Drug Deliv Rev, 59:645–666. 3. Cao X, Jin Z et al. (2005). A novel cyclodextrin glycosyltransferase from an alkalophilic Bacillus species: purification and characterization. Food Res Int, 38:309-314. 4. Charoenlap N, Dharmsthiti S et al. (2004). Optimization of cyclodextrin production from sago starch. Bioresour Technol., 92(1):49-54. 5. Karube I, Yoshida N. Method of producing β-cyclodextrin. 1996, Akebono Brake Industry Co.: USA. 6. Moore GRP, Rodrigues L (2005). Cassava and corn starch in maltodextrin production. Quim. Nova, 28:596-600. 7. Rendleman JA (1997). Enhancement of cyclodextrin production through use of debranching enzymes. Biotechnology and Applied Biochemistry, 26:51-61. 8. Shieh W, Hedges A. Process for producing a-cyclodextrin using cyclodextrin glucanotransferase in presence of cyclohexane. 1994. 9. Szejtli J (2004). Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure Appl. Chem., 76:1825–1845. 10. Vương Văn Sơn, Vũ Thanh Thảo và cs. (2012). Cố định cyclomaltodextrin glucanotransferase lên alginat để sản xuất beta- cyclodextrin. Tạp Chí Y Học TP.HCM, 16:166-172. 11. Zhekova B, Dobrev G et al. (2009). Approaches for yield increase of b-cyclodextrin formed by cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus megaterium. World J Microbiol Biotechnol., 25:1043-1049. Ngày nhận bài báo: 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014