Nghiên cứu tổng hợp Palmitoyl Pyrazinamid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 13 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP PALMITOYL PYRAZINAMID Nguyễn Duy Phương*, Phạm Đình Duy*, Phạm Ngọc Tuấn Anh* TÓM TẮT Mở đầu: Pyrazinamid (PZA) là một thuốc được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh lao tại phổi. Hiện nay, ngày càng nhiều các ch ng vi khuẩn lao đề kháng với PZA. Vì vậy, một số dạng tiền chất là dẫn xuất ester/ amid c a PZA đ được nghiên cứu tổng hợp nhằm góp phần khắc phục tình trạng kháng thuốc. H n n a, để nâng cao hiệu quả điều trị lao bằng cách nâng cao nồng độ thuốc tại phổi, tiểu phân xốp chứa PZA phân phối đến phổi đ được nghiên cứu. Nhưng PZA có nhược điểm dễ thấm qua màng tế |o để đi v|o tuần hoàn chung, làm giảm nồng độ PZA tại phổi. Do đó, để làm giảm tính thấm c a PZA, dẫn xuất c a PZA là palmitoyl pyraziamid (PP) được nghiên cứu tổng hợp để làm hoạt chất cho bào chế tiểu phân xốp phân phối đến phổi. Mục tiêu đề tài: Nghiên cứu tổng hợp PP làm hoạt chất cho bào chế tiểu phân xốp phân phối đến phổi. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Dẫn xuất imid c a PZA đ được nghiên cứu tổng hợp với tác nhân tham gia phản ứng l| palmitoyl clori phư ng ph{p 1 . Tuy nhiên, sản phẩm thu được có hiệu xuất thấp và thời gian phản ứng kéo dài 24 giờ. Để khắc phục nhược điểm c a phư ng ph{p tổng hợp trên, một phư ng ph{p tổng hợp kh{c được đề xuất với tác nhân phản ứng l| palmitoyl clori v| natri hy ri phư ng ph{p 2 . Sản phẩm tổng hợp được x{c định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng t hạt nh}n. Sau đó x{c định độ tinh khiết c a sản phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC . Kết quả: Phư ng ph{p 2 tổng hợp thành công sản phẩm palmitoyl pyrazinamid với hiệu xuất là 70%, với thời gian phản ứng tối ưu l| 1 tiếng. Độ tinh khiết sản phẩm là 99,57%. Kết luận: Đề t|i đ tổng hợp thành công PP với độ tinh khiết cao là tiền chất tiềm năng cho |o chế dạng tiểu phân xốp phân phối đến phổi, giúp phóng thích hoạt chất PZA kéo dài. Từ khóa: pyrazinamid, bệnh lao, palmiotyl pyrazinamid ABSTRACT STUDY ON SYNTHESIS OF PALMITOYL PYRAZINAMID Nguyen Duy Phuong, Pham Dinh Duy, Pham Ngoc Tuan Anh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 13-17 Backgroud: Pyrazinamide (PZA) is a commonly used drug in the treatment of tuberculosis (TB) in the lungs. At present, more and more TB strains resistant to PZA. Thus, series of PZA ester and amide derivatives have been synthesized to overcome drug resistance. In addition, to improve the effectiveness of TB treatment by increasing the level of the drug in the lungs, PZA-containing porous particles delivered to the lungs were investigated. However, PZA showed the disadvantage since it rapidly penetrated the cell membrane to enter the circulatory system, reducing PZA level in the lungs. To reduce the permeability of PZA, palmitoyl pyrazinamide (PP), was synthesized to use as an active ingredient for the preparation of porous particles delivered to the lungs. Objectives: Synthesis of PP with high purity to use as an active ingredient for the preparation of porous particles distributed to the lungs. Materials and Methods: PZA imide derivative was synthesized by using palmitoyl chloride in anhydrous CHCl3 as described in literatue (method 1). However, the reaction time was very long (24 hours) and gave product *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phạm Ngọc Tu n Anh ĐT: 0909 704 081 Email: anhpham299@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 14 in very low yield. To overcome these disadvantages, another reaction condition using palmitoyl chloride and sodium hydride as a base in anhydrous THF was applied to synthesize PP (method 2). The structure of obtained product was determined by IR, MS and NMR spectra. The purity of product was confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC) method. Results: Method 2 successfully synthesized palmitoyl pyrazinamide in 70% yield in an optimum reaction time of 1 hour. The purity of obtained product 99.57%. Conclusion: PP that successfully synthesized from this study will be used as an active ingredient for the preparation of porous particles distributed to the lungs to release extended PZA. Keywords: pyrazinamide, tuberculosis, palmiotyl pyrazinamide MỞ ĐẦU Pyrazinamid (PZA) là một thuốc ược sử dụng phổ bi n trong iều tr bệnh lao tại phổi. Hiện nay, ngày càng nhiều các chủng vi khuẩn ao ề kháng với PZA(6). Vì vậy, một số dạng tiền ch t là dẫn xu t ester/ amid của PZA ã ược nghiên cứu tổng hợp nhằm góp ph n khắc phục tình trạng kháng thuốc(1,5) Hơn n a, ể nâng cao hiệu quả iều tr lao bằng cách nâng cao nồng ộ thuốc tại phổi, tiểu phân xốp chứa PZA phân phối n phổi ã ược nghiên cứu(2,3) Nhưng PZA có nhược iểm dễ th m qua màng t |o ể i v|o tu n hoàn chung, làm giảm nồng ộ PZA tại phổi Do ó, ể làm giảm tính th m của PZA, dẫn xu t của PZA là palmitoyl pyraziamid (PP) ược nghiên cứu tổng hợp ể làm hoạt ch t cho bào ch tiểu phân xốp phân phối n phổi. Dẫn xu t của PZA là palmitoyl pyrazinamid có công thức c u tạo như Hình 1, ược tổng hợp theo 2 phương ph{p: phướng pháp 1 dùng tác nhân pa itoy c ori v| phương ph{p 2 ng t{c nhân là palmitoyl clorid và natri hydrid. Hình 1: Công thức cấu tạo c a palmitoyl pyrazinamid ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PH[P NGHI N CỨU Phƣơn h 1 Sơ đồ 1: S đồ tổng hợp palmitoyl pyrazinamid theo phư ng ph{p 1 Tiến hành: cho 200 mL cloroform vào bình c u 3 cổ và thêm 0,25 mL acetyl clorid, khu y trong 30 ph t Sau ó, th 14 L (0,035 o ) palmitoyl clorid và 3,69 gam (0,03 mol) pyrazinamid, thực hiện trên máy khu y t trong 24 giờ. Trong suốt quá trình khu y, thêm t t t ng giọt 4,8 mL (0,06 mol) pyridin vào trong dung d ch Đợi phản ứng xảy ra hoàn toàn, làm lạnh hỗn hợp sau phản ứng và ph n pyrazinamid không phản ứng sẽ k t tinh ược loại bằng phương ph{p ọc Cô ặc dung d ch còn khoảng 20 mL trên máy cô quay. Rửa 3 l n với mỗi 15 mL dung d ch NaOH loãng lạnh, sau ó rửa lại bằng nước n khi d ch rửa trung tính với chỉ th pH a n ng D ch c oro or ược làm khan bằng Na2SO4. Cô quay loại dung môi, sau ó chạy sắc ký cột với hệ CHCl3 – ethanol (9:1) (4). Phƣơn h 2 Sơ đồ 2: Phản ứng tạo palmitoyl pyrazinamid với tác nhân NaH và palmitoyl clorid Tiến hành: Cân 1,4 g pyrazinamid hòa tan ho|n to|n trong THF ã c t loại nước trong bình c u 2 cổ. Khu y trong 10 phút. Cân 0,55 g NaH cho vào bình c u. Khu y trong 30 phút. Thêm 5 mL palmitoyl clorid vào bình c u, thời gian phản ứng tối ưu t nh t lúc bắt u cho palmitoyl clorid vào là 1 ti ng. Tinh chế sản phẩm Cho toàn bộ hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng vào bình chi t, th 300 L nước vào bình chi t, thêm t t dung d ch HCl 3,6%, lắc ều và Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 15 iều chỉnh pH của dung d ch về pH = 4. Khi y, sẽ xu t hiện tủa vàng nổi lên bề mặt dung d ch, ợi ổn nh 10 phút. Xã bỏ hoàn toàn dung d ch nước trong phễu chi t. Cho thêm ethyl acetat khoảng 100 mL, hòa tan sản phẩm, lọc bằng lọc chân không vào bình hứng. Lập lại l n 2, thêm 60 – 80 mL ethyl acetat vào phễu chi t, ể chi t h t ph n sản phẩm còn lại, lọc chân không vào bình hứng. Làm khan nước dung d ch ethyl acetat bằng Na2SO4 khan. Cô quay dung d ch ethyl acetat cho bay hơi h t ung ôi Thu ược sản phẩm thô. Tinh ch bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CHCl3 - hexan (2:1). Kết tinh lại Hòa tan sản phẩm sau khi chạy cột với ượng tối thiểu dung môi CHCl3 trong becher 250 mL, sau ó th ung ôi h xan với ượng g p 20 l n ượng c oro or có trong ch r Đặt becher 250 L trong nước { hoảng 15 phút, cho sản phẩm k t tinh hoàn toàn. Lọc chân không thu ph n ch t rắn k t tinh, rửa sản phẩm k t tinh với 20 mL hexan lạnh. Ti p theo, l y sản phẩm k t tinh l n 1, thực hiện k t tinh lại một l n n a như trên. S y chân không ở nhiệt ộ 45 oC thu ược sản phẩm tinh khi t. X định độ tinh khiết bằn hƣơn h HPLC Khảo s{t iều kiện sắc ý ể chọn iều kiện sắc ký tối ưu, sau ó x{c nh ộ tinh khi t của sản phẩm tinh ch bằng cách tính ph n tr diện tích pic của sản phẩm tinh ch so với tổng diện tích pic có trong phổ ồ. KẾT QUẢ Phƣơn h 1 Tính chất sản phẩm Ch t rắn màu trắng, hông tan trong nước, dễ tan trong CHCl3. Phổ MS Trong phổ khối có xu t hiện ỉnh m/z = 362,2716, tương ứng với mảnh [M+H]+ (362,2808) Điều này chứng tỏ có thể có sản phẩm mong muốn PP tạo th|nh Tuy nhi n ỉnh /z = 239,20 (3133650) | ỉnh chính trong phổ ồ, còn ỉnh /z = 362,2716 có cường ộ ỉnh 470000-490000. Vì vậy ỉnh m/z = 362,2716 chi m tỉ lệ nhỏ trong hỗn hợp sản phẩm. Phổ 1H-NMR Tinh ch sản phẩm tổng hợp th o phương pháp 1. Hòa tan mẫu trong CDCl3, o phổ 1H- NMR bằng máy Bruker với t n số 500 MHz. Trên phổ 1H-NMR, không th y xu t hiện nh ng proton ặc trưng nằm trên d vòng pyrazin và hydro của nhóm chức imid ở vùng có ộ d ch chuyển hóa học δH = 6,0 – 11,0. Vậy ch t tổng hợp ược t phương ph{p 1, hông phải là sản phẩm tổng hợp mong muốn palmitoyl pyrazinamid. Phƣơn h 2 Hiệu suất tổng hợp: 70% Tính chất sản phẩm Ch t rắn màu trắng, hông tan trong nước, dễ tan trong dung môi kém phân cực và phân cực trung ình ac tonitri , c oro or , tano Phổ MS (ESI) Mẫu sản phẩm tổng hợp cho phổ với các mảnh m/z là 362,2841; 384,2650; 400,2383 hoàn toàn phù hợp với giá tr theo tính toán [M+H]+ (362,2808), [M+Na]+ (384,2627), [M+K]+ (400,2366). Phổ NMR 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 10,06 (s, 1H, NH); 9,47 (d, 1H, J = 1,5 Hz, Hpyrazin); 8,85 (d, 1H, J = 1 Hz, Hpyrazin); 8,60 (dd, 1H, J = 2,5; 1,5 Hz, Hpyrazin); 2,98 (t, 2H, J = 7,5 Hz, CH2); 1,70-1,75 (m, 2H, CH2); 1,26-1,42 (m, 24H, 12xCH2); 0,88 (t, 3H, J = 7,0 Hz, CH3). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 174,66 (C=O); 161,50 (C=O); 148,53 (Cpyrazin); 145,23 (Cpyrazin); 143,10 (Cpyrazin); 142,70 (Cpyrazin); 14 CH2: 37,65; 31,94; 29,70; 29,67; 29,63; 29,51; 29,40; 29,37; 29,17; 24,11; 22,70; 14,1 (CH3). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 16 Phổ hồng ngoại (IR) Phổ IR của hợp ch t PP với c{c ỉnh ặc trưng cho c{c nhó chức C=O (1721, 1699 cm-1), N-H (3161cm-1), C-H pyrazin (3072 cm-1), Csp3- H(2850, 2915 cm-1), C=C và C=N (1581, 1494 cm-1). X định độ tinh khiết Khảo sát điều kiện sắc ký Sử dụng HPLC với u ò PDA ể x{c nh ộ tinh khi t của palmitoyl pyrazinamid. Thay ổi pha ộng, cột sắc ký và cố nh các y u tô khác bao gồm: nhiệt ộ cột 30 oC, thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc ộ dòng 1 mL/phút. Bảng 1: Khảo sát hệ pha động chạy HPLC P ộng khảo sát Thông số pic Cột s c ký C (ppm) RT (phút) Diện tích Chiều cao RS HSKĐ ACN – acid acetic 1% (85:15) Phenomenex 100 15,701 2846138 90694 1,04 1,48 ACN – acid acetic 1,5% (90:10) Intersil 100 23,935 2742253 66896 2,41 1,23 ACN 100% Intersil 100 9,651 2996673 272963 9,94 1,11 MeOH-H2O (95:5) Intersil 99,6 14,644 3961137 209545 5,74 1,12 Nhận xét: chọn pha ộng là acetonitril 100% và cột sắc ký Int rsi ể ti n hành khảo s{t ộ tinh khi t của palmitoyl pyrazinamid. Sắc ký đồ Bảng 2: X{c định độ tinh khiết c a palmitoyl pyrazinamid Tên chất RT S %S H Purityl Angle Purityl Thresold K Rs N HSKĐ Peak1 5,525 4095 0,10 608 5,026 5,942 0,48 - 16350 1,21 Peak2 7,143 10,955 0,26 1246 2,605 3,052 0,91 8,12 15246 1,21 Peak3 8,246 3251 0,08 363 7,444 8,699 1,20 4,71 21584 1,13 PP 153ppm 9,590 4271800 99,57 388050 0,058 0,237 1,56 5,10 18253 1,25 Hình 2: Kết quả sắc ký đồ HPLC c a PP Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 17 Nhận xét: Trên sắc ý ồ (Hình 2), pic palmitoyl pyrazinamid tinh khi t, chỉ có một pic duy nh t trên phổ ồ 3D, ph n tr iện tích pic của palmitoyl pyrazinamid ở Bảng 2 là 99,57%. Điều này chứng tỏ ộ tinh khi t của palmitoyl pyrazinamid là 99,57%. BÀN LUẬN PP tan ược trong dung môi kém phân cực và phân cực trung bình, nhưng PP lại bị phân hủy một phần khoảng 10% khi hòa tan PP trong ung ôi tano ặt trong bể siêu âm, trong khi các dung môi khác như etanol, acetonitril thì PP lại không bị phân hủy. Điều n|y ược phát hiện qua phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC. Tổng hợp PP theo phương ph{p 2 ã cải thiện ược hiệu xuất tổng hợp sản phẩm là 70% và rút ngắn thời gian phản ứng là 1 tiếng. Tuy nhiên, ở giai oạn tinh chế sản phẩm thô chứa PP, thì acid palmitic lẫn vào sản phẩm PP do palmtoyl clorid dư phản ứng với nước. Vì vậy ể ược sản phẩm PP tinh khiết phải qua 2 lần kết tinh lại ể loại bỏ hoàn toàn acid palmitic. Và trong sắc ký lỏng cao áp HPLC, dùng pha ộng là acetonitril 100%, cho peak có thống số tốt hơn c{c pha ộng h{c ã hảo s{t Tuy nhi n, hi ng pha ộng acetonitril lâu dài, sẽ làm cho bào mòn C18 của pha tĩnh, từ ó | giảm tuổi thọ của cột sắc ký. Bằng chứng là hệ số o uôi của p a an ầu chạy là 1,11 nhưng khi càng chạy lâu thì hệ số kéo uôi c|ng ớn 1,25, từ ó | giả ộ chính xác của phép phân tích HPLC. KẾT LUẬN Đề t|i ã tổng hợp thành công palmitoyl pyrazinamid với hiệu su t tổng hợp 70%, thời gian phản ứng tối ưu | 1 giờ. Sản phẩm thu ược ạt ộ tinh khi t cao 99,57 , {p ứng ược yêu c u làm hoạt ch t cho nghiên cứu bào ch tiểu phân xốp xốp phân phối n phổi Đ}y | phương ph{p tổng hợp mới ã khắc phục ược nhược iểm thời gian phản ứng kéo dài và hiệu su t th p của phương ph{p ã công ố trước }y TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cynamon MH, Gimi R et al. (1995). Pyrazinoic Acid Esters with Broad Spectrum in Vitro Antimycobacterial Activity. Journal of Medicinal Chemistry, 38, 3902-3907. 2. Pham DD, Fattal E et al. (2013). Formulation of pyrazinamide- loaded large porous particles for the pulmonary route: avoiding crystal growth using excipients. International Journal of Pharmaceutics, 454, 668-677. 3. Pham DD, Grégoire N et al. (2015). Pulmonary delivery of pyrazinamide-loaded large porous particles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 94, 241-250. 4. Schreier H, Gonzalez-Rothi RJ (1991). Lipophilic acylpyrazinamide prodrugs, Patent WO 1991005771 A1, May 2, 1991. 5. Simoes MF, Valente E et al. (2009). Lipophilic pyrazinoic acid amide and ester prodrugs stability, activation and activity against M. tuberculosis. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 37, 257-263. 6. Zhang Y, Shi W et al. (2013). Mechanisms of Pyrazinamide Action and Resistance. Microbiology spectrum, 2, 1-12. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018