Nghiên cứu ứng dụng quy trình phát hiện SNP RS9263726 để sàng lọc alen hla-B58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP

HLA-B*58:01 là một marker khá quan trọng trong tiên lượng phản ứng thuốc thể nặng khi dùng thuốc allopurinol. Hung và CS (2005) báo cáo mối liên hệ rất chặt chẽ giữa HLA-B*58:01 và dị ứng thể nặng khi dùng thuốc allopurinol trên người Hán - Trung Hoa với độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 85% chỉ số OR:580,3 [3]. Các nghiên cứu tiếp theo trên cộng đồng người Thái, Hàn Quốc [9, 10] càng chỉ rõ điều này. Do đó, việc sàng lọc gen này trước khi chỉ định allopurinol cho BN rất cần thiết. Hiện nay, có thể trực tiếp sàng lọc HLA-B*5801 bằng các kỹ thuật như giải trình tự gen [2] hay đếm dòng chảy tế bào [8]. Tuy nhiên, các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị máy móc khá phức tạp, kỹ thật viên có trình độ cao dẫn tới giá thành xét nghiệm khá cao nên khó triển khai rộng rãi. Một số nghiên cứu 2 đã chỉ ra HLAB*58:01 liên kết với một số SNP. Trong đó, SNP rs9263726 trên gen PSORS1C1 cách gen HLA-B 215 kb, liên kết hoàn toàn với gen HLA-B*58:01 (r2 = 1; D’ = 1) 5 . Do đó, có thể gián tiếp sàng lọc HLAB*58:01 thông qua SNP này. Hiện nay, có thể sử dụng kít TaqMan SNP Genotype Assays để sàng lọc SNP rs9263726. Mặc dù sàng lọc khá hiệu quả, kít có giá thành khá cao, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại nên khó triển khai trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã hoàn thiện một quy trình sàng lọc gián tiếp gen HLA-B*58:01 thông qua SNP rs9263726 bằng phương pháp PCR-RFLP với nhiều ưu điểm như: không đòi hỏi máy móc quá hiện đại, đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp, từ đó có thể triển khai rộng rãi. Trong quá trình chọn mẫu làm chứng âm và chứng dương cho PCR-RFLP bằng phương pháp giải trình tự Sanger, chúng tôi chỉ phát hiện 2 kiểu gen SNP rs9263726 là GG và GA. Kiểu gen đồng hợp tử AA rất hiếm trong cộng đồng, chưa phát hiện thấy trong 36 mẫu nghiên cứu, 0/27 mẫu trong nghiên cứu của Kaiko [5] hay 3/200 mẫu trong nghiên cứu của Hung 3 . Do đó, trong số các mẫu dương tính, chỉ có mẫu mang kiểu gen GA để giải trình tự đối chiếu. Khi so sánh kết quả nghiên cứu với các tác giả khác, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ mang gen là 13,9%, thấp hơn so với nghiên cứu của Hung và CS trên người Hán - Trung Hoa (19,5%) 3 , điều này có thể lý giải do cỡ mẫu của chúng tôi khá nhỏ, chưa đại diện cho cộng đồng. Khi kiểm chứng quy trình bằng giải trình tự Sanger ngẫu nhiên 10% số mẫu của nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả hoàn toàn đồng nhất giữa phương pháp PCR-RFLP và sequencing. Điều đó chứng tỏ nhân gen PSORS1C1 và hoạt động cắt của enzym Fok1 hoàn toàn theo thiết kế.

pdf6 trang | Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 38 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu ứng dụng quy trình phát hiện SNP RS9263726 để sàng lọc alen hla-B58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 37 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN SNP RS9263726 ĐỂ SÀNG LỌC ALEN HLA-B*58:01 BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR-RFLP Ngô Trường Giang*; Trần Văn Khoa* Nguyễn Minh Tâm*; Trần Thị Thu Huyền* TÓM TẮT Mục tiêu: ứng dụng quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP. Đối tượng và phương pháp: 36 mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại alen HLA-B được tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng PCR-RFLP xác định kiểu gen của SNP rs9263726, điện di sản phẩm trên gel agarose 2% và phân tích kết quả để kết luận kiểu gen, giải trình tự gen PSORS1C1 10% số mẫu để kiểm chứng quy trình. Kết quả: trong 36 mẫu AND, sàng lọc được 5 mẫu dương tính với HLA-B*58:01. Kết luận: đã ứng dụng được quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc gen HLA-B*58:01 bằng phương pháp PCR-RFLP. * Từ khóa: HLA-B*58:01; rs9263726; PCR-RFLP. Applying a Protocol to Detect SNP RS926726 for Screening HLA- B*58:01 Allele Using PCR-RFLP Technique Summary Objectives: Applying a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using PCR-RFLP technique. Subjects and methods: 36 blind blood samples with unknown HLA-B allelic types, total DNA was extracted, SNP rs9263726 was detected using PCR-RFLP technique, electrophoresis PCR products in 2% agarose gel and analysis, sequencing 10% samples. Result: We were able to detect HLA-B*58:01 in 5 of 36 samples. Conclusion: We have applied a protocol to detect SNP rs9263726 for screening HLA-B*58:01 gene using PCR-RFLP technique. * Key words: HLA-B*58:01; PCR-RFLP; rs9263726. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản ứng thuốc thể nặng ngày càng giảm nhờ nguyên tắc dùng thuốc được hoàn thiện theo hướng cá thể hoá. Tuy nhiên, số lượng các dược chất được đưa vào điều trị lâm sàng ngày càng tăng. Khi phản ứng thuốc nặng xảy ra, tỷ lệ bệnh nhân (BN) tử vong khá cao (30%). Do đó, dự phòng phản ứng thuốc thể nặng vẫn còn là một vấn đề rất đáng quan tâm. Hiện nay, một số kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được sử dụng như marker để phát hiện phản ứng thuốc nặng như: * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Ngô Trường Giang (legiangngo@gmail.com) Ngày nhận bài: 14/03/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 20/05/2018 Ngày bài báo được đăng: 09/06/2018 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 38 hội chứng Stevens Johnson hay nhiễm độc hoại tử. Trong các HLA này, HLA- B*58:01 là một marker di truyền có liên quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể nặng khi dùng thuốc allopurinol, đặc biệt ở cộng đồng người châu 3 . Do đó, cần sàng lọc HLA-B*58:01 trước khi dùng allopurinol để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng do thuốc. Tuy nhiên, việc phát hiện trực tiếp HLA-B*58:01 đòi hỏi máy móc hiện đại, tiêu tốn nhiều thời gian và tiền bạc. Gần đây, các nghiên cứu đã phát hiện một số SNP liên kết khá chặt với HLA-B*58:01 [2]. Trong số đó, SNP rs9263726 (110G>A) trên gen PSORS1C1 liên kết hoàn toàn với HLA-B*58:01. Do đó, có thể phát hiện HLA-B*58:01 thông qua SNP này. PCR-RFLP là một kỹ thuật đơn giản, dễ triển khai, thời gian cho kết quả nhanh, giá thành rẻ và khá hiệu quả để phát hiện SNPs. Trước thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu: Ứng dụng quy trình sàng lọc alen HLA-B*5801 thông qua marker SNP rs9263726 (110G>A) bằng kỹ thuật PCR-RFLP để dự phòng phản ứng thuốc thể nặng trên BN s dụng allopurinol. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tƣợng nghiên cứu. 36 mẫu máu chưa biết loại alen HLA- B, chống đông bằng EDTA thu thập tại Học viện Quân y. 2 mẫu ADN đã biết trước kiểu gen của SNP rs9263726 bằng phương pháp giải trình tự Sanger sử dụng làm chứng âm (GG) và chứng dương (GA). 2. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Tách chiết ADN tổng số từ 36 mẫu máu thu thập được: tách chiết bằng kít tách chiết ADN từ máu toàn phần của Qiagen. * PCR-RFLP phát hiện gen HLA- B*58:01: - Khuếch đại gen PSORS1C1: trình tự các cặp mồi tham khảo theo Kaiko và CS (2012) [5]. Thành phần phản ứng PCR nhân gen: master mix: 12,5 μl; primers (10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: 7 μl; mẫu: 5 μl, tổng thể tích 25 μl. Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 940C trong 5 phút; tiếp theo 30 chu kỳ: 940C trong 30 giây, 600C trong 60 giây, 720C trong 30 giây. Cuối cùng 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, phân tích kết quả. * X lý enzym giới hạn: - Các mẫu có kết quả nhân gen PSORS1C1 được xử lý cùng enzym Fok1. - Thành phần hỗn hợp xử lý enzym: sản phẩm nhân gen: 5 μl; enzym Fok1: 0,4 ui. - Chu trình nhiệt xử lý enzym: ủ hỗn hợp ở 37oC trong 2 giờ, bất hoạt enzym ở 65oC trong 20 phút. Sản phẩm thu được điện di trên gel agarose 2%, phân tích kết quả. * Giải trình tự Sanger: sản phẩm nhân gen PSORS1C1 được tinh sạch, giải trình tự Sanger. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 39 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Kết quả nhân gen PSORS1C1. Sản phẩm nhân gen được điện di trên gel agarose 2% trong 30 phút: Hình 1: Kết quả điện di sản phẩm nhân gen PSORS1C1. (-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp; các dải còn lại: B ng gen PSORS C có kích thước 260 bp) Kết quả cho thấy băng xuất hiện khi điện di sản phẩm nhân gen đều rõ ràng, đúng kích thước thiết kế và không xuất hiện băng phụ. Như vậy, điều kiện cho phản ứng nhân gen được tối ưu. Sản phẩm nhân gen xử lý cùng enzym cắt giới hạn. 2. Kết quả xử lý enzym cắt giới hạn để phát hiện SNP rs9263726. Sản phẩm nhân gen PSORS1C1 được xử lý cùng enzym cắt giới hạn Fok1. Sản phẩm xử lý enzym điện di trên gel agarose 2%. Hình 2: Kết quả xử lý enzym sản phẩm nhân gen PSORS1C1. (-1; -2: Chứng âm; (+): Chứng dương; M: Marker 00 bp; các dải còn lại: Sản phẩm x lý enzym mẫu nhân gen PSORS1C1) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 40 Dựa vào số vạch thu được trên điện di sản phẩm xử lý enzym Fok1, có thể kết luận được kiểu gen: - Những mẫu chỉ xuất hiện 1 băng tại vị trí 260 bp có kiểu gen SNP rs9263726 dạng đồng hợp tử GG, do đó không mang gen HLA-B*58:01. - Những mẫu xuất hiện cả 3 băng 260 bp; 141 bp và 119 bp có kiểu gen SNP rs9263726 dạng dị hợp tử GA, do đó mang gen HLA-B*58:01 ở dạng dị hợp tử. - Những mẫu chỉ xuất hiện 2 băng 141 bp và 119 bp có kiểu gen SNP rs9263726 dạng đồng hợp tử AA, do đó mang gen HLA-B*58:01 ở dạng đồng hợp tử. Như vậy, trong 36 mẫu nghiên cứu, chúng tôi phát hiện được 5 mẫu: 53; 57; 59; 70; 82 xuất hiện 3 băng. Đây là những mẫu mang kiểu gen HLA-B*58:01 ở dạng dị hợp tử. Bằng kỹ thuật này, bước đầu đã xác định được 5/36 mẫu (13,9%) nghiên cứu có kiểu alen HLA-B*58:01. 3. Kết quả giải trình tự Sanger. Nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên 36 mẫu máu chưa biết kiểu gen SNP rs9263726. Để kiểm chứng quy trình, tiến hành chọn 10% trong tổng số 36 mẫu nghiên cứu tương ứng với 4 mẫu để giải trình tự Sanger. Trong 4 mẫu, chọn 2 mẫu âm tính với SNP rs9263726 (110G>A) có kiểu gen GG và 2 mẫu dị hợp tử SNP rs9263726 (110G>A) có kiểu gen GA được xác định bằng phương pháp PCR-RFLP ở trên. Hình 3: Kết quả giải trình tự sản phẩm nhân gen PSORS1C1 của 4 mẫu 45; 52; 70 và 82. Tại vị trí 119 bp của hai mẫu 45, 52 chỉ xuất hiện 1 đỉnh G màu đen. Do đó, kiểu gen SNP rs9263726 của mẫu 45, 52 là GG. Tại vị trí 119 bp của hai mẫu 70, 82 xuất hiện 2 đỉnh: 1 đỉnh G màu đen, 1 đỉnh A màu xanh lá cây. Do đó, kiểu gen SNP rs9263726 của mẫu 70, 82 là GA. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 41 BÀN LUẬN HLA-B*58:01 là một marker khá quan trọng trong tiên lượng phản ứng thuốc thể nặng khi dùng thuốc allopurinol. Hung và CS (2005) báo cáo mối liên hệ rất chặt chẽ giữa HLA-B*58:01 và dị ứng thể nặng khi dùng thuốc allopurinol trên người Hán - Trung Hoa với độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 85% chỉ số OR:580,3 [3]. Các nghiên cứu tiếp theo trên cộng đồng người Thái, Hàn Quốc [9, 10] càng chỉ rõ điều này. Do đó, việc sàng lọc gen này trước khi chỉ định allopurinol cho BN rất cần thiết. Hiện nay, có thể trực tiếp sàng lọc HLA-B*5801 bằng các kỹ thuật như giải trình tự gen [2] hay đếm dòng chảy tế bào [8]. Tuy nhiên, các kỹ thuật này đòi hỏi trang thiết bị máy móc khá phức tạp, kỹ thật viên có trình độ cao dẫn tới giá thành xét nghiệm khá cao nên khó triển khai rộng rãi. Một số nghiên cứu 2 đã chỉ ra HLA- B*58:01 liên kết với một số SNP. Trong đó, SNP rs9263726 trên gen PSORS1C1 cách gen HLA-B 215 kb, liên kết hoàn toàn với gen HLA-B*58:01 (r2 = 1; D’ = 1) 5 . Do đó, có thể gián tiếp sàng lọc HLA- B*58:01 thông qua SNP này. Hiện nay, có thể sử dụng kít TaqMan SNP Genotype Assays để sàng lọc SNP rs9263726. Mặc dù sàng lọc khá hiệu quả, kít có giá thành khá cao, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại nên khó triển khai trong cộng đồng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã hoàn thiện một quy trình sàng lọc gián tiếp gen HLA-B*58:01 thông qua SNP rs9263726 bằng phương pháp PCR-RFLP với nhiều ưu điểm như: không đòi hỏi máy móc quá hiện đại, đơn giản, dễ thực hiện, giá thành thấp, từ đó có thể triển khai rộng rãi. Trong quá trình chọn mẫu làm chứng âm và chứng dương cho PCR-RFLP bằng phương pháp giải trình tự Sanger, chúng tôi chỉ phát hiện 2 kiểu gen SNP rs9263726 là GG và GA. Kiểu gen đồng hợp tử AA rất hiếm trong cộng đồng, chưa phát hiện thấy trong 36 mẫu nghiên cứu, 0/27 mẫu trong nghiên cứu của Kaiko [5] hay 3/200 mẫu trong nghiên cứu của Hung 3 . Do đó, trong số các mẫu dương tính, chỉ có mẫu mang kiểu gen GA để giải trình tự đối chiếu. Khi so sánh kết quả nghiên cứu với các tác giả khác, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ mang gen là 13,9%, thấp hơn so với nghiên cứu của Hung và CS trên người Hán - Trung Hoa (19,5%) 3 , điều này có thể lý giải do cỡ mẫu của chúng tôi khá nhỏ, chưa đại diện cho cộng đồng. Khi kiểm chứng quy trình bằng giải trình tự Sanger ngẫu nhiên 10% số mẫu của nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả hoàn toàn đồng nhất giữa phương pháp PCR-RFLP và sequencing. Điều đó chứng tỏ nhân gen PSORS1C1 và hoạt động cắt của enzym Fok1 hoàn toàn theo thiết kế. KẾT LUẬN Chúng tôi đã ứng dụng thành công quy trình phát hiện SNP rs9263726 để sàng lọc alen HLA-B*58:01 bằng kỹ thuật PCR- RFLP, phát hiện được 5/36 mẫu nghiên cứu mang kiểu alen HLA-B*58:01. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T. Human leukocyte antigens and drug hypersensitivity. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2007, 7, pp.317-323. TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 42 2. Tohkin M, Kaniwa N et al. A whole- genome association study of major determinants for allopurinol-relates Stevens- Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in Japanese patients. Pharmacogenomics in Press. 2011. 3. Chung W.H, Hung S.I, Chen Y.T et al. HLA-B*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse reactions caused by allopurinol. Proc Natl Acad Sci. USA. 2005, 102, pp.4134-4139. 4. Kang H.R, Jee Y.K et al. Positive and negative associations of HLA class 1 alleles with allopurinol-induce SCARs in Korean. Pharmacogenets Genomic. 2011, pp.303-307. 5. Kaiko M, Jun N et al. Developed of a rapid and inexpensive assay for detecting a surrogate genetic polymorphism of HLA- B*5801. Pharmacogenet. 2012, pp.447-450. 6 Bunce M, O’Neill C M, Barnardo M C et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR- SSP). Tissue Antigens. 1995, 46, pp.355-367. 7. Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Parham P, Marsh S.G. The IMGT/HLA database. Nucleic Acids Res. 2011, 39, pp.D1171-1176. 8. Kostenko L 1 , Kjer-Nielsen L, Nicholson I, Hudson F et al. Rapid screening for the detection of HLA-B57 and HLA-B58 in prevention of drug hypersensitivity. Tissue Antigens. 2011, 78, pp.11-20. 9. Tassaneeyakul W 1 , Jantararoungtong T, Chen P, Lin P.Y et al. Strong association between HLA-B*5801 and allopurinol-induced Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in a Thai population. Pharmacogenet/ 2009, pp.704-709. 10. Kang H.R 1 , Jee Y.K, Kim Y.S, Lee C.H, Jung J.W et al. Positive and negative associations of HLA class I alleles with allopurinol-induced SCARs in Koreans. Pharmacogenet. 2011, pp.303-307.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfnghien_cuu_ung_dung_quy_trinh_phat_hien_snp_rs9263726_de_san.pdf
Tài liệu liên quan