Nghiên cứu và ứng dụng mô hình 3D - Pharmacophore trên các chất ức chế allosteric của enzym rac - alpha serin /threonin protein kinase - AKT1

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 380 NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG MÔ HÌNH 3D - PHARMACOPHORE TRÊN CÁC CHẤT ỨC CHẾ ALLOSTERIC CỦA ENZYM RAC - ALPHA SERIN /THREONIN PROTEIN KINASE - AKT1 Phan Nguyễn Thị Nhàn*, Đinh Văn Toàn*, Trần Quế Hương**, Đỗ Minh Nguyệt***, Trần Thành Đạo*, Lê Minh Trí*, Thái Khắc Minh* TÓM TẮT Mở đầu và mục tiêu: Akt là một loại enzym serin/threonin protein kinase có vai trò quan trọng trong chu trình sống v| tăng sinh của tế bào. Việc ức chế vùng allosteric giúp giữ enzym ở cấu dạng bất hoạt. Nghiên cứu được xây dựng để tìm kiếm những khung cấu trúc mới có tiềm năng ức chế allosteric Akt1 từ các nguồn dữ liệu tối ưu. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Các mô hình in silico bao gồm 3D-pharmacophore, QSAR, docking được xây dựng trên các phần mềm LeadIT 2.1.8, Sybyl X 2.0 và MOE 2008.10. Kết quả: Tổng cộng 135 chất với hoạt tính ức chế AKT1 từ 5 khung chính, xây dựng và lựa chọn mô hình 3D-pharmacophore có tính chọn lọc đặc hiệu nhất. Ứng dụng sàng lọc 3D-database và dự đo{n hoạt tính bằng 2D-QSAR. Kết quả thu được mô hình pharmacophore năm điểm N2 gồm 3 điểm vòng thơm Aro, 1 điểm kỵ nước v| 1 điểm có thể liên kết kim loại và nhận liên kết hydro. Mô hình docking cho thấy Trp80 gắn kết π-π với cấu trúc vòng thơm của các chất có liên quan tới khả năng ức chế của các chất. Mô hình 2D-QSAR xây dựng từ 6 thông số có kết quả R2 = 0,81 > 0,5 và RMSE = 0,39 < 0,5 và mô hình này sử dụng để dự đo{n hoạt tính sinh học các chất. Sàng lọc trên cơ sở dữ liệu các chất hóa học thu được 44 chất, có 2 khung mới cho giá trị IC50 tốt và 2 thuốc được dự đo{n có hoạt tính. Kết luận: Với kết quả thu được, nghiên cứu đề nghị xem xét hai khung mới và 2 thuốc sàng lọc được tiến hành thực nghiệm in vitro v| in vivo x{c định hoạt tính sinh học v| được xem như những khung chính các chất ức chế allosteric Akt1. Từ khóa: AKT1, pharmacophore, allosteric, QSAR ABSTRACT 3D-PHARMACOPHORE MODELING AND ITS APPLICATION ON ALLOSTERIC INHIBITORS OF RAC SERIN/THREONIN PROTEIN KINASE AKT1 Phan Nguyen Thi Nhan, Dinh Van Toan, Tran Que Huong, Do Minh Nguyet, Tran Thanh Dao, Le Minh Tri, Thai Khac Minh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 380 - 388 Background - Objectives: Akt, a serin/threonin protein kinase, is a critical key in cell survival and proliferation. Allosteric inhibitors regulate aberrant kinase activity by stabilizing the protein in the inactive conformation. The aim of study was to discover novel scaffolds from optimal source for Akt1 inhibitors. Method: Modeling approaches namely 3D-pharmacophore, QSAR, docking were performed by LeadIT 2.18, SybylX 2.0, MOE 2008.10 software. * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Th|nh phố Hồ Chí Minh ** Đại học Kỹ Thuật Y Dƣợc Đ| Nẵng *** Trƣờng Đại học B{ch Khoa TPHCM T{c giả liên lạc: PGS. TS. Th{i Khắc Minh ĐT: 0909680385 Email: thaikhacminh@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 381 Results: A set of 135 structures from 5 key scaffolds was collected to generate and select the best 3D- pharmacophore model. 3D-database screening and 2D-QSAR were carried out. The result was a 5-feature pharmacophore model including 3 points of aromatic, 1 point of H-bond acceptor and metal ligation, 1 point of hydrophobic feature. Docking modeling results indicated that Trp80, a crucial amino acid related to mechanism keeps the inactive conformation of Akt1, often interacts π-π stacking with aromatic feature. The 2D QSAR model with 6 descriptors, R2 = 0,81 > 0,5 and RMSE = 0,39 < 0,5 was created. During the virtual screening and 2D- QSAR, 44 novel compounds were selected with 2 novel scaffolds and 2 used drugs were showed as the hits of allosteric Akt1 inhibitors. Conclusion: With these computational studies, the results suggested the 2 novel scaffolds and 2 approval drugs could be considered as hit/lead of allosteric Akt1 inhibitors and could perform the bioassay and next its further optimization. Keyword: AKT1, pharmacophore, allosteric, QSAR MỞ ĐẦU Năm 2015, theo thống kê của hiệp hội ung thƣ Hoa Kỳ, ƣớc chừng 1,658,370 ca ung thƣ đƣợc điều trị v| 589,430 ca ung thƣ g}y tử vong ở Mỹ(29). Với hơn 100 loại ung thƣ kh{c nhau đòi hỏi nỗ lực lớn trong chẩn đo{n v| điều trị. Hiện nay, con đƣờng phát triển các thuốc điều trị ung thƣ tập trung vào các kháng thể đơn dòng v| thuốc phân tử nhỏ điều trị hƣớng mục tiêu. Con đƣờng phosphatidylinositol 3-kinase PI3K/AKT/mTOR đƣợc kích hoạt trong nhiều tuýp ung thƣ (đại trực tr|ng, vú<(9)) việc sử dụng các thuốc ức chế đích con đƣờng này tạo ra nhiều kết quả tiềm năng, hiệu quả trong điều trị ở cả khối u rắn và u máu(29). Enzym PKB hay còn đƣợc gọi là AKT, một nút báo hiệu quan trọng trong con đƣờng PI3K/AKT/mTOR, có vai trò trong sự phát triển, tăng sinh, di chuyển và sự sống của tế b|o do đó ức chế các hoạt động của AKT giúp ức chế c{c qu{ trình tăng sinh khối u, apotopsis tế b|o ung thƣ hay đảo ngƣợc khối u(37). Nhiều chất ức chế AKT đang đƣợc đ{nh giá trong các thử nghiệm lâm sàng bao gồm có nhóm tƣơng tự phosphatidylinositol (3,4,5)s – trisphosphate (Perifosine), chất ức chế allosteric (ví dụ MK-2206) và chất ức chế cạnh tranh ATP (ví dụ AZD5363 và AT13148)(23). Về khía cạnh đột biến, ARQ 092 và ARQ 751, BAY 1125976 là những chất ức chế allosteric đang đƣợc nghiên cứu ở bệnh nh}n ung thƣ có đột biến AKT1-E17K(30). Với những ƣu điểm so với các chất cạnh tranh ATP nhƣ: giảm phản ứng phụ, độ đặc hiệu cao hơn, độc tính thấp hơn, apotopsis nhiều hơn, các chất ức chế allosteric AKT đang không ngừng đƣợc khám phá phát hiện những khung cấu trúc và chất mới(15). Nghiên cứu thực hiện nghiên cứu và ứng dụng mô hình sàng lọc ảo trên các chất ức chế allosteric RAC-α- serin/threonin của protein kinase AKT1. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Enzym AKT1 là một trong ba dạng đồng hình (isoform) của enzym AKT. AKT là một chìa khóa trung gian quan trọng trong con đƣờng tín hiệu sự sống của tế bào PI3K/AKT/mTOR(5). Sự kích hoạt con đƣờng này xảy ra quá mức ở bệnh nh}n ung thƣ, g}y giảm điều tiết, tăng khuếch đại, tái sắp xếp, tăng trƣởng khối u, tăng di căn v| g}y đề kh{ng phƣơng ph{p trị liệu(11). Việc ức chế biểu hiện quá mức một trong các thành phần của con đƣờng tín hiệu nhƣ AKT l| một liệu pháp mục tiêu điều trị ung thƣ thu hút nhiều nghiên cứu(4). AKT biểu hiện ở 3 dạng đồng hình (isoform) là AKT1, AKT2, AKT3, lần lƣợt đƣợc mã hóa bởi c{c gen PKBα, PKBβ v| PKBγ. Ba dạng isoform ở động vật có vú cho cấu trúc tƣơng đồng hơn 85 % gồm: một đuôi gốc N- miền đồng đẳng (PH), một miền xúc tác trung tâm serin/threonin (CAT hay còn gọi là miền Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 382 kinase) và một đầu – C điều khiển enzym chứa các mô típ kị nƣớc (EXT)(22). Miền PH của AKT có khoảng 110 acid amin, miền CAT khoảng 260 acid amin và miền EXT khoảng 70 acid amin(20). Mặc dù cấu trúc tƣơng đồng 80 % nhƣng biểu hiện v| t{c động sinh học giữa các isoform có sự khác biệt đ{ng kể(17). AKT1 biểu hiện ở nhiều mô kh{c nhau v| đƣợc nhân bản nhƣ l| một bản tƣơng đồng của gen sinh ung thƣ(24). Quá trình kích hoạt AKT1 trong cơ thể khởi nguồn từ các thụ thể tyrosin kinase, phản ứng với các yếu tố tăng trƣởng trong cơ thể tạo nên 30 polyphosphoinositid PtdIns (3,4,5) P3 và PtdIns (3,4) P2 gắn với miền PH của AKT1(36). Sự gắn kết n|y giúp t{i định vị AKT1 từ b|o tƣơng sang tế b|o m|ng l|m thay đổi cấu dạng và mở miền xúc tác kinase của enzym. AKT1 t{i định vị, phosphoryl hóa tại hai vị trí là Thr308 trong miền xúc tác và Ser473 trong vùng mô típ kỵ nƣớc(36). Sau khi phosphoryl hóa hoàn toàn, AKT1 đƣợc kích hoạt, AKT1 mất sự gắn kết với lipid, bị khóa vào cấu trúc xúc tác và dịch chuyển đến các vị trí riêng biệt trong nội bào nơi có cơ chất khƣ trú(36). Cơ chế ức chế allosteric AKT1 sử dụng các phân tử nhỏ ức chế khoang tạo bởi miền PH và miền kinase của AKT1(31) thông qua tƣơng t{c với các gốc kỵ nƣớc v| tƣơng t{c cực, các phân tử ức chế giữ miền PH ở cấu dạng đóng, ngăn ATP gắn kết với các vùng kinase, cản trở vị trí gắn phospholipid, ức chế AKT1 chuyển vị màng và kích hoạt(6,18). Ức chế allosteric là quá trình điều khiển chức năng hoạt động của một protein bằng c{ch t{c động một vị trí khác với vùng hoạt động(25). Phƣơng pháp nghiên cứu Mô hình docking Mô hình docking dự đo{n tƣơng t{c hay liên kết đƣợc dựa trên điểm số docking và các vị trí gắn kết. Điểm số docking là tổng năng lƣợng tiêu thụ khi hình th|nh c{c tƣơng t{c gắn kết giữa ligand với mục tiêu t{c động; điểm số docking càng âm biểu thị khả năng gắn kết của ligand với khoang càng tốt. Nghiên cứu sử dụng phần mềm FlexX tích hợp sẵn trong LeadIT 2.1.8(2). Khi đã có cấu trúc 3D của protein, vị trí cụ thể của vùng hoạt động và tập hợp các chất cần dock, FlexX sẽ phân tích khả năng gắn kết (dock hay non-dock) của mỗi chất với protein bằng cách xuất ra kết quả (pose) của quá trình xem xét gắn kết. Về cơ chế, FlexX chia ligand thành những mảnh cứng, các mảnh cứng đƣợc lựa chọn tự động v| đặt vào vùng cần gắn kết của protein, lắp ráp ligand lại từ các mảnh ở những cấu dạng năng lƣợng thấp. Mảnh vỡ mới ở tất cả các cấu dạng sẽ đƣợc đặt vào vị trí đã tìm thấy trƣớc đó nhƣng chỉ có vị trí tốt nhất mới đƣợc tiến h|nh bƣớc tiếp theo(28). Cấu trúc tinh thể của AKT1 đƣợc tìm kiếm và tải về từ ngân hàng Protein Databank(30). Protein 3O96 đ{p ứng điều kiện là protein có độ phân giải thấp, đồng kết tinh với chất ức chế allosteric. Chất đồng kết tinh có tên là (1- (1-(4-(7-phenyl-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin- 6yl)benzyl) piperidin-4-yl)-1H-benzo[d] imidazole- 2(3H)-one 1-{1-[4-(6-phenyl-1H- imidazo[4,5-g] quinoxalin-7-yl) benzyl] piperidin-4-yl}-1,3-dihydro-2H-benzimidazol- 2-one)(40). Protein đƣợc chuẩn bị bằng công cụ LigX, MOE 2008.10. C{c ligand đƣợc chuẩn bị bằng công cụ Sybyl-X 2.0(34). Mô hình 3D-pharmacophore và ứng dụng sàng lọc 3D-database Theo định nghĩa của IUPAC, pharmacophore là "một tập hợp các yếu tố không gian (steric) v| điện tử (electron) cần thiết để đảm bảo sự tƣơng t{c của phân tử hợp chất với cấu trúc chuyên biệt của điểm t{c động sinh học đồng thời kích thích (hay ức chế) đ{p ứng sinh học của điểm t{c động này. Pharmacophore có thể đƣợc xem nhƣ mẫu số chung lớn nhất của các các chất có hoạt tính sinh học(42). Mô hình pharmacophore giúp xử lý nhanh chóng một lƣợng lớn các cấu trúc, có sự linh hoạt về cấu dạng và là công cụ hỗ trợ trong nghiên cứu cấu trúc phân tử(26). Một mô hình pharmacophore đƣợc mô tả bằng các yếu tố nhƣ khả năng tạo liên kết hydro Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 383 (cho và nhận), điểm kỵ nƣớc, khả năng tích điện v| đƣợc x{c định bằng các nguyên tử, các vòng, c{c điểm giả định(19). Mô hình pharmacophore đƣợc xây dựng từ công cụ Pharmacophore Eclucidation trong phần mềm MOE 2008.10 (Chemical Computing Group Inc.) với mục tiêu tìm kiếm tất cả các truy vấn pharmacophore (pharmacophore query) có độ chồng phủ tốt ở hầu hết tất cả các phân tử cấu trúc có hoạt tính và tách biệt với các phân tử cấu trúc không có hoạt tính trong một nguồn dữ liệu. Mô hình đƣợc lựa chọn thông qua thang điểm chồng phủ (overlap) v| điểm chính xác (accuracy). Ngo|i ra, mô hình đƣợc đ{nh gi{ lại bằng các thông số (Sp, Se,PC,Ya,GH)(16) và tập không hoạt tính từ DecoyFinder 2.0(7,33). Mô hình tốt nhất sẽ đƣợc lựa chọn để sàng lọc qua các nguồn dữ liệu 3D-database. Bảng 1: Các thông số đ{nh gi{ mô hình pharmacophore(16) Thông số Công thức tính Ý nghĩa Độ nhạy = Tỷ lệ các chất hoạt tính thỏa mô hình trên tổng số các chất hoạt tính Độ đặc hiệu = Tỷ lệ các chất không hoạt tính không thỏa mô hình trên tổng số các chất không hoạt tính Khả năng dự đoán PC = Khả năng dự đoán các chất thỏa mô hình trên tập Hiệu suất tập hoạt tính = Tỷ lệ một phân tử bất kỳ có hoạt tính trong tập N Điểm số GH GH = ( + ) Khả năng phân loại của mô hình Với TP là số chất có hoạt tính th a mô hình pharmacophore, TN là số chất không có hoạt tính không th a mô hình pharmacophore, FN là số chất có hoạt tính không th a mô hình pharmacophore, FP là số chất không có hoạt tính th a mô hình pharmacophore(16). Tập hợp các chất ức chế allosteric AKT1 đƣợc tổng hợp từ nhiều bài báo nghiên cứu trong những năm gần đ}y. Tổng cộng 135 chất thu đƣợc từ 9 bài báo khoa học(1,12,13,21,22,32,33,41,44), những bài báo nghiên cứu có cùng phƣơng ph{p x{c định IC50 l| “Kinase assay”. Chọn lọc 14 chất có hoạt tính sinh học tốt nhất để xây dựng mô hình pharmacophore. Những chất đƣợc chọn phải có hoạt tính ức chế allosteric AKT1 mạnh và có tính đại diện cho các khung. Tổng 135 chất thu thập từ bài báo chia thành 2 tập gồm: Tập 114 chất có IC50 x{c định cụ thể trong khoảng [1- 7407 nM] (tập fit gồm những chất có hoạt tính) và tập 21 chất có IC50 không x{c định hay giá trị lớn (IC50 > 17000 nM) (tập nofit gồm những chất không hoạt tính). Mô hình tốt nhất ứng dụng sàng lọc 3D-database từ các ngân hàng dữ liệu IBScreen(14), TCM (Traditional Chinese Medicines)(35) và DrugBank. Mô hình 2D-QSAR 2D-QSAR đƣợc xây dựng dựa trên mối quan hệ định lƣợng giữa cấu trúc v| t{c động là quá trình mang tính định lƣợng mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất. Từ đó tìm ra những quy luật tƣơng quan để đ{nh gi{ hoạt tính sinh học của những hợp chất mới. Công việc của QSAR l| x{c định những tham số Co; C1; < Cn trong phƣơng trình: Hoạt tính sinh học (pIC50) = C0+ C1*P1 +<<<<+Cn*Pn Với sai số dự đo{n l| nhỏ nhất cho một tập dữ liệu có sẵn. Phƣơng ph{p đƣợc áp dụng để x{c định các tham số l| phƣơng ph{p hồi quy với thuật toán bình phƣơng tối thiểu từng phần (PLS) trong phần mềm MOE 2008.10. Dựa vào mô hình 2D-QSAR xây dựng, có thể áp dụng để dự đo{n hoạt tính sinh học của các chất có thông số mô tả phù hợp với phƣơng trình(27). Mô hình sau khi đƣợc xây dựng sẽ đƣợc đ{nh gi{ thông qua hệ số tƣơng quan R2 giữa giá trị dự đo{n v| gi{ trị thực nghiệm pIC50, sai số bình phƣơng trung bình RMSE. Ngo|i ra, mô hình còn đƣợc đ{nh gi{ chéo (LOO) trên tập huấn luyện (đ{nh gi{ nội) và tập kiểm tra (đ{nh gi{ ngoại). Từ những mô hình đƣợc xây dựng chọn lại mô hình nào hiệu quả nhất dùng cho việc dự đo{n. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 384 Đ{nh gi{ nội Đ{nh gi{ nội bằng LOO (bỏ-một-ra) tiến hành cùng với qui trình xây dựng mô hình bằng lệnh Validate trong QSAR-model của MOE. Hai thông số đ{nh gi{ LOO l| Q2 (XR2) và RMSE (XRMSE)(8). Đ{nh gi{ ngoại Kiểm tra mô hình trên tập ngoại bằng công cụ Model Evaluate của MOE. Phần lớn các giá trị dự đo{n của tập ngoại phải nằm trong khoảng tin cậy 95 % dự đo{n đúng của mô hình. Hệ số tƣơng quan của tập ngoại: R2= 1 - Trong đó: Y: giá trị thực nghiệm của các chất trong tập xây dựng mô hình. : giá trị dự đo{n của tập kiểm tra bởi mô hình đã x}y dựng. YTEST: giá trị thực nghiệm của các chất trong tập kiểm tra. : giá trị trung bình của các chất trong tập huấn luyện. Giá trị rm2 đƣợc sử dụng để đ{nh gi{ khả năng dự đo{n của mô hình với ƣu điểm tránh sai số dự đo{n do khoảng rộng của giá trị trả về(8). 2 = r2 (1- ) (1) Với trục x là giá trị hoạt tính dự đo{n Ypred và trục y là giá trị hoạt tính thực Y. 2 = 2 (1- ) (2) Với trục x là giá trị hoạt tính thực Y và trục y là giá trị hoạt tính dự đo{n Ypred. Trong đó: : hệ số x{c định. : hệ số x{c định với hệ số chặn bằng 0. Từ (1) v| (2) có c{c gi{ trị tƣơng ứng: ; Mô hình có khả năng dự đo{n tốt khi và . (đ{nh gi{ Roy) (8). Ngo|i ra, hệ số tƣơng quan phù hợp CCC thể hiện sự thống nhất giữa c{c gi{ trị thực nghiệm v| gi{ trị dự đo{n của tập ngoại(8). Mô hình đƣợc chấp nhận khi CCC > 0,85. CCC = Trong đó Yi là giá trị thực nghiệm, là giá trị thực nghiệm trung bình, là giá trị dự đo{n, là giá trị dự đo{n trung bình. (NEXT là giá trị tùy ý, n > 1) (8). Trong qu{ trình x}y dựng mô hình, phƣơng ph{p loại nhiễu bằng Z-score đƣợc sử dụng. Z- score l| độ lệch của gi{ trị hoạt tính dự đo{n so với gi{ trị hoạt tính dự đo{n trung bình của to|n tập dữ liệu. Một chất có Z-score lớn cho thấy khả năng cao chất đó nằm ngo|i đƣờng thẳng hồi quy QSAR(27). Tiến h|nh loại những chất có Z- score > 2,0 sau khi tiến h|nh khảo s{t sơ bộ QSAR trên tập x}y dựng. Công thức tính Z-score nhƣ sau: Z – score = KẾT QUẢ Mô hình docking Tiến hành docking với thông số mặc định của khoang là 6,5 Å, toàn bộ 135 chất đều dock đƣợc vào khoang gắn kết. Các chất có điểm số docking khá tốt và có 17 chất có điểm số docking tốt nhất <- 40 KJ/mol. Các chất này chủ yếu thuộc nhóm quinoxalin, pyridopyrimidin. Phân tích 10 pose / cấu trúc, những cấu trúc có IC50 tốt có c{c điểm chung sau: Liên kết kỵ nƣớc π-π giữa acid amin Trp80 với vòng thơm của cấu trúc (1). Tồn tại phân tử nƣớc (Water 455) là cầu nối giữa cấu trúc với acid amin Asn54 qua liên kết hydro (2). Có các liên kết hydro với Ser206, Tyr 272, Thr211, Glu 86, Cys296 (3). Một số cấu trúc đƣờng kính phân tử lớn có liên kết cation-π với Arg273 (4). Ở yếu tố (1), gốc Trp80 trên miền đồng đẳng PH là một đích t{c động quan trọng trong khoang giúp duy trì trạng thái không hoạt động của enzym AKT1(43). Không có mối tƣơng quan giữa hoạt tính IC50 v| điểm số docking của 135 chất (R2 < 0,5). Kết quả này có thể đƣợc giải thích vì điểm số docking không chỉ cho biết ái lực gắn kết giữa phân tử mà còn khả năng tƣơng t{c của protein, do đó nhiều Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 385 cấu trúc có hoạt tính IC50 cao nhƣng vẫn có điểm số docking tốt là do gắn kết với nhiều acid amin khác xung quanh. Các cấu trúc này không liên kết hoặc liên kết yếu với Trp80. Mô hình 3D-pharmacophore và ứng dụng sàng lọc 3D-database Mô hình đƣợc xây dựng từ các khung cấu trúc chính là [1,2,4] triazolo [3,4-f][1,6] naphthyridin, pyridopyrimidin; 2,3,5 thế pyridin (cyanopyridin, tetrazolopyridin), quinoxalin, [1,8] napthyridin. Kết quả thu đƣợc 13 mô hình pharmacophore 5 điểm bằng công cụ Pharmacophore Elucidation. Từ kết quả đ{nh giá trình bày ở Bảng 2, theo tiêu chí của phần mềm MOE 2008.10 mô hình N2 đƣợc đ{nh gi{ l| tốt nhất do có sự gióng hàng tốt nhất thể hiện qua độ chồng phủ cao nhất là 12,010. Bên cạnh đó, mô hình N2 cho kết quả sàng tập hoạt tính cao và loại hoàn toàn các chất trong tập không hoạt tính. Mô hình N4 và N7 có độ nhạy cao tuy nhiên tính chọn lọc không tốt bằng mô hình N2. Mô hình N1 có các thông số tƣơng đƣơng N2 nhƣng độ chồng phủ không tốt bằng N2. Mô hình N2 gồm 3 điểm vòng thơm, 1 điểm kỵ nƣớc v| 1 điểm thắt kim loại nhận liên kết hydro với các thông số cụ thể về khoảng c{ch, b{n kính đều thỏa mãn yêu cầu cơ bản của một mô hình pharmacophore. Đề tài lựa chọn nghiên cứu trên mô hình N2. Bảng 2: Kết quả sàng lọc tập fit và nofit của 13 mô hình pharmacophore Tính chất mô hình F1/F2/F3/F4/F5 Kết quả sàng lọc Tập xây dựng Tập fit Tập nofit Độ chồng phủ N1 Aro/Aro/Aro/Hyd/ Acc&Ml 14/14 107/114 0/21 12,004 N2 Acc&ML/Aro/Aro/Aro/ Hyd 14/14 107/114 0/21 12,010 N3 Aro/Aro/Aro/Hyd/Acc2 14/14 113/114 8/21 10,778 N4 Aro/Aro/Hyd/Hyd/Acc2 14/14 114/114 12/21 11,982 N5 Aro/Aro/Hyd/Hyd/Acc2 14/14 113/114 9/21 11,187 N6 Aro/Aro/Hyd/Hyd/Acc2 14/14 113/114 8/21 11,442 N7 Aro/Aro/Hyd/Hyd/Acc2 14/14 114/114 7/21 11,388 N8 Aro/Aro/Hyd/Hyd/Acc2 14/14 111/114 13/21 10,541 N9 Aro/Aro/Hyd/Hyd/Acc2 14/14 112/114 11/21 10,711 N10 Aro/Aro/Hyd/Acc2/Acc2 14/14 105/114 5/21 8,710 N11 Aro/Hyd/Hyd/Acc2/Acc2 14/14 109/114 8/21 9,600 N12 Aro/Hyd/Hyd/Acc2/Acc2 14/14 110/114 5/21 10,991 N13 Aro/Hyd/Hyd/Acc2/Acc2 14/14 111/114 9/21 10,260 Bảng 3: Kết quả đ{nh gi{ mô hình N2 bằng các thông số đặc trưng Tập fit TP FN Tập nofit FP TN Se Sp PC Ya (%) GH Decoy (%) N1 114 107 7 21 0 21 0,94 1,00 0,95 79,26 0,83 1,54 N2 114 107 7 21 0 21 0,94 1,00 0,95 79,26 0,83 1,54 N3 114 113 1 21 8 13 0,90 0,62 0,93 83,70 0,54 4,62 N4 114 114 0 21 12 9 0,93 0,43 0,91 84,44 0,38 10,00 N5 114 113 1 21 9 12 0,90 0,57 0,93 83,70 0,50 13,08 N6 114 114 0 21 8 13 0,90 0,62 0,94 84,44 0,55 11,53 N7 114 114 0 21 7 14 0,89 0,67 0,95 84,44 0,59 15,38 N8 114 111 3 21 13 8 0,86 0,38 0,96 82,22 0,74 6,92 N9 114 112 2 21 11 10 0,92 0,48 0,90 82,96 0,41 6,92 N10 114 105 9 21 5 16 0,87 0,76 0,90 77,78 0,62 16,15 N11 114 109 5 21 8 13 0,89 0,62 0,90 80,74 0,52 30,00 N12 114 110 4 21 5 16 0,87 0,76 0,93 81,48 0,65 20,00 N13 114 111 3 21 9 12 0,90 0,57 0,91 82,22 0,49 28,46 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 386 Đ{nh gi{ lại mô hình N2 bằng các thông số đặc trƣng kh{c v| tập ngoại không hoạt tính cho kết quả thu đƣợc ở Bảng 3. Độ nhạy Se = 0,94 v| độ đặc hiệu Sp = 1,00 cao cho thấy mô hình N2 đ{ng tin cậy. Các thông số kh{c đều cho kết quả tốt: khả năng dự đo{n 0,95, khả năng ph}n loại tập là GH = 0,83 cao nhất. Xác suất tìm thấy chất có hoạt tính trong tập là 79,26 % không cao nhất nhƣng lại chứng tỏ mô hình có tính chọn lọc với các chất có hoạt tính. Việc s|ng lọc ngẫu nhiên một dữ liệu thƣờng chỉ tìm thấy một phần nhỏ c{c hợp chất có t{c động với đích. Trong trƣờng hợp tập nofit chỉ có lƣợng nhỏ c{c ph}n tử không hoạt tính, việc x}y dựng một tập hợp c{c ph}n tử không hoạt tính kh{c đƣợc lựa chọn bằng thuật to{n ngẫu nhiên giúp kiểm tra lại tính tin cậy từ mô hình(38). Tập đ{nh gi{ ngoại cho kết quả thấp nhất 1,54 % chứng tỏ mô hình N2 có tính chọn lọc với các chất không hoạt tính. Sàng lọc mô hình thu đƣợc kết quả IBScreen (23/27179 chất); TCM (2/7975 chất) và DrugBank (19/7024 chất) qua mô hình N2 tiến hành chạy cấu dạng, tối thiểu hóa năng lƣợng v| docking xem xét tƣơng t{c gắn kết thu đƣợc kết quả. Đối với tập IBScreen, một số khung cấu trúc chính thu đƣợc nhƣ [1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin; purin; indol-3- carboxamid;pyrazol; furan. Đối với tập TCM, 2 chất thu đƣợc có cấu trúc của isoquinolin. Đối với tập Drugbank, có 3 thuốc đang sử dụng trên thị trƣờng và 16 chất đang thử nghiệm thỏa mô hình N2. Mô hình 2D-QSAR Chọn lọc từ 184 thông số mô tả phân tử 2D bằng phần mềm Weka 3.6(39) thu đƣợc 6 thông số mô tả đƣợc sử dụng để xây dựng mô hình. Tiếp theo,từ tập dữ liệu đã x{c định hoạt tính gồm 114 chất, loại nhiễu các chất nằm ngoài đƣờng tuyến tính có Z-score > 2,0 và sử dụng hàm Random (MOE 2008.10) chia tập dữ liệu thành 2 tập huấn luyện (56 chất) và tập kiểm tra đ{nh gi{ ngoại (14 chất). Xét các mô hình thứ cấp, mô hình QSAR (I) đạt nhiều kết quả đ{nh gi{ tốt với sai số giữa giá trị dự đo{n v| giá trị thực nghiệm của toàn tập xây dựng mô hình là RMSE = 0,39 0,5. Bảng 4: Kết quả đ{nh gi{ mô hình QSAR (I) Tập huấn luyện Tập kiểm tra Toàn bộ cơ sở dữ liệu N(số chất) 56 14 70 R 2 0,81 0,90 0,81 RMSE 0,39 0,28 0,39 Q 2 0,74 0,71 0,76 XRMSE 0,45 0,52 0,44 2 0,77 0,75 0,77 2 0,63 0,68 0,64 0,14 0,07 0,14 0,70 0,71 0,70 CCC 0,87 Rpred 2 0,79 Phƣơng trình của mô hình QSAR (I): pIC50 = -17,07440 + 35,02143*BCUT_PEOE_2 + 0,83651*PEOE_PC+ - 0,07341*PEOE_VSA-3 - 8,82036*PEOE_VSA_FPNEG + 2,02087*PEOE_VSA_FPPOS - 0,07738*SlogP. Trong đó thông số BCUT_PEOE_2 là trị riêng của ma trận kề giữa các nguyên tử, PEOE_PC+ là tổng điện tích dương, PEOE_VSA-3 là tổng diện tích bề mặt Van der Waals có điện tích trong vùng [ -0,20; -0,15), PEOE_VSA_FPNEG và PEOE_VSA_FPPOS lần lượt là Diện tích bề mặt Van der Waals có điện tích }m v| dương, SlogP l| log của hệ số phân bố octanol/nước (bao gồm cả hydro ẩn). Mô hình QSAR(I) có giá = 0,14 < 0,2 và = 0,70 > 0,5 theo đ{nh gi{ Roy(8) chứng tỏ có khả năng dự đo{n tốt. Gi{ trị dự đo{n Rpred2 = 0,79 > 0,5 cao. BÀN LUẬN Dự đo{n hoạt tính các chất sàng lọc thực hiện bằng mô hình QSAR (I) có đƣợc các giá trị pIC50 dự đo{n trong đó 32 chất có giá trị dự đo{n thuộc khoảng có hoạt tính [1,34 nM – Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 387 5954 nM] và 12 chất > 30.000 nM. Một số chất với điểm số docking rất thấp v| tƣơng t{c với acid amin yếu nhƣng vẫn đƣợc dự đoán có hoạt tính là do mô hình QSAR (I) sẽ cho kết quả tốt với các cấu trúc có tính tƣơng quan với các thông số mô tả thực hiện xây dựng mô hình. Các chất có IC50 dự đo{n tốt có cấu trúc khung chính là carboxamid, pyridin, quinolin, isoquinolin. Ngoài ra, có hai khung mới đơn giản (hình 1) v| chƣa đƣợc nghiên cứu đề cập có giá trị IC50 dự đo{n tốt. Khung 1 cho giá trị IC50 dự đo{n tốt nhất là 8,41 nM và khung 2 cho giá trị IC50 dự đo{n tốt nhất là 181 nM. Trong các chất có hoạt tính, hai thuốc là etoricoxib và rimonabant có giá trị IC50 dự đo{n lần lƣợt là 5.954 nM và 630 nM. Có thể tiến hành thực nghiệm để đ{nh gi{ tiềm năng của hai thuốc này. Với các chất có giá trị dự đo{n > 30.000 nM đều có điểm số docking không tốt hay không có c{c tƣơng t{c với Trp80, acid amin đóng vai trò giữ cấu trúc AKT1 ở trạng thái bất hoạt. Hình 1: Các khung cấu trúc sàng lọc mới có giá trị IC50 dự đo{n tốt. Trong đó: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R11, R12, R13, R14: Hydro hay các nhóm thế, đóng vòng. X: Nguyên tử N, S, O. Với X = N có giá trị IC50 dự đo{n tốt, X = S hay X = O giá trị IC50 lớn. R8: Halogen F, Cl. KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng thành công mô hình 3D-pharmacophore 5 điểm từ nhiều khung cấu trúc đa dạng thu đƣợc 13 mô hình 5 điểm, trong đó mô hình N2 có tính chọn lọc tốt nhất. Ứng dụng sàng lọc chọn lọc đƣợc 44 chất trên 44.243 chất thỏa mô hình. Mô hình mô tả phân tử docking cho thấy Trp80 tƣơng t{c - với cấu trúc vòng thơm có liên quan tới khả năng ức chế AKT1 của c{c chất. Mô hình 2D - QSAR cho kết quả dự đo{n hai thuốc thể hiện khả năng gắn kết tốt và hai khung cấu trúc tiềm năng mới, nghiên cứu đề nghị thử nghiệm in vitro và in vivo xác định hoạt tính sinh học v| xem xét nhƣ khung chính trong các nghiên cứu điều trị ung thƣ. Lời cảm ơn: Nghiên cứu n|y được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-YS.05- 2015.31 (cho Thái Khắc Minh). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bilodeau MT, Balitza AE, Hoffman JM, Manley PJ, Barnett SF, Defeo-Jones D,Smith AM (2008), "Allosteric inhibitors of Akt1 and Akt2: a naphthyridinone with efficacy in an A2780 tumor xenograft model", Bioorganic & medicinal chemistry letters. 18 (11), pp. 3178-3182. 2. BioSolveIT LeadIT 2.0.2 (2012), https://www.biosolveit.de/, ngày truy cập 23/2/2017. 3. Brown JS, Banerji U (2017), Maximising the potential of AKT inhibitors as anti-cancer treatments, Pharmacology & therapeutics. 172, pp.101-115. 4. Burris III HA (2013), "Overcoming acquired resistance to anticancer therapy: focus on the PI3K/AKT/mTOR pathway", Cancer chemotherapy and pharmacology. 71 (4), pp. 829. 5. Calleja V, Laguerre M, Larijani B (2009), "3-D structure and dynamics of protein kinase B—new mechanism for the allosteric regulation of an AGC kinase", Journal of chemical biology 2.1. 2 (1), pp. 11-25. 6. Calleja V, Laguerre M, Parker PJ, Larijani B (2009), "Role of a novel PH-kinase domain interface in PKB/Akt regulation: structural mechanism for allosteric inhibition", PLoS biology. 7 (1), pp. e1000017. 7. Cereto-Massagué A, Guasch L, Valls C, Mulers M, Pujadas G, Garcia-Vallvé S (2012), "DecoyFinder: an easy-to-use python GUI application for building target-specific decoy sets", Bioinformatics. 28 (12), pp. 1661-1662. 8. Chirico N, Gramatica P (2012), "Real external predictivity of QSAR models. Part 2. New intercomparable thresholds for different validation criteria and the need for scatter plot inspection", Journal of Chemical Information and Modeling. 52 (8), pp. 2044-2058. 9. Crowell JA, Steele VE, Fay JR (2007), "Targeting the AKT protein kinase for cancer chemoprevention", Molecular Cancer Therapeutics. 6 (8), pp. 2139-2148. 10. Decoy Finder 2.0 (2017), ctns.github.io/DecoyFinder/, ngày truy cập 20/5/2017. 11. Du K, Tsichlis PN (2005), "Regulation of the Akt kinase by interacting proteins", Oncogene. 24 (50), pp. 7401-7409. 12. Fang Z, Simard JR, Plenker D, Nguyen HD, Phan T, Wolle P, Rauh D (2014), "Discovery of Inter- Novel Assay System for Allosteric Akt Inhibitors", ACS chemical biology. 10 (1), pp. 279-288. Khung 1 Khung 2