Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện kiểu gene Vegf và kiểu đột biến gene Egfr ứng dụng trong điều trị đích ung thư phổi

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN KIỂU GENE VEGF VÀ KIỂU ĐỘT BIẾN GENE EGFR ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ ĐÍCH UNG THƯ PHỔI Ngô Tất Trung1, Đinh Ngọc Sỹ2, Nguyễn Viết Nhung2, Đặng Văn Khiêm2, Vũ Xuân Phú2, Nguyễn Chi Lăng2, Hàn Trung Điền2, Đào Thanh Quyên1 và Lê Hữu Song1 1Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 2Bệnh Viện Phổi Trung ương TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tiên lượng hiệu quả điều trị đích UTP phải dựa vào xét nghiệm xác định đột biến gene hoặc kiểu gene đích. Mục tiêu: Xây dựng quy trình xét nghiệm phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến mất đoạn (Del19 (746-750)), đột biến điểm trên Exon21 (L858R) của gene EGFR. Vật liệu và phương pháp: Các dòng tế bào UTPKTBN mang đột biến gene EGFR được nuôi cấy trong các điều kiện chuẩn. Tính đa hình của gen VEGF được xác định bằng phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR. Đột biến gene EGFR được xác định bằng PCR đa mồi đặc hiệu allele hai hướng tích hợp công nghệ ARMS và kiểm tra lại bằng giải trình tự gene. Ngưỡng phát hiện và độ đặc hiệu của phương pháp được xác định bằng cách pha loãng nồng độ tế bào theo tỷ lệ 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 và 100:100, sau đó tiến hành tách DNA làm khuôn cho phản ứng PCR. Kết quả: Đã hoàn thiện kỹ thuật động học allele đặc hiệu real-time PCR cho phép phát hiện đồng thời 2 thể đa hình Rs833061 và Rs3025039 của gene VGFR. Công nghệ PCR đặc hiệu hai hướng allele cũng cho phép xác định được đột biến gene EGFR tại exon 19, exon 21 với ngưỡng phát hiện là 0,1%. Độ đặc hiệu kỹ thuật là 100%. Giải trình tự gene đã khẳng định kết quả của PCR đa mồi. PCR đa mồi đặc hiệu allele hai hướng tích hợp công nghệ ARMS có ngưỡng phát hiện thấp hơn so với giải trình tự gene (0,1% so với 25%). Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công phương pháp phát hiện kiểu gene VEGF và kiểu đột biến gene EGFR với ngưỡng phát hiện (độ nhạy kỹ thuật) là 0,1-1% và độ đặc hiệu là 100%. Từ khóa: UTP, UTPKTBN, EGFR, VEGF, PCR đa mồi. ESTABLISHING ASSAYS FOR GENOTYPING VEGF AND IDENTIFYING EGFR MUTATIONS APPLYING FOR TARGET THERAPY OF LUNG CANCER SUMMARY Background: Personalised target therapies are widely approved for lung cancer, however, to optimize the therapeutic regimens, patients’ genetic background (EGFR, VEGF) must be clarified. Người phản hồi: Ngô Tất Trung Email: ntatrung@yahoo.com Ngày nhận bài: 21/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 12/2013 Ngày phản biện đánh giá bài báo cáo: 11/2013 24 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925 Aims: To set-up a molecular diagnostic protocol for detecting exon 19 Del19 (746-750), exon 21 point mutation (L858R) of epithelial growth factor receptor (EGFR) and genotyping VEGF SNPs Rs3025039, RS833061. Materials and methods: Cell lines carrying mutation of EGFR were cultured by standard conditions and treated as reference for optimizing the assays. Mutations of EGFR gene were detected by bidirectional allele specific PCR combined with amplification refractory mutation system, its sensitivity and specificity were monitored by titrating mutant positive cells in to mutant negative counterpart into a series from 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 and 100. On the other hand, allelic variants of VEGF was acquired by allele specific kinetics PCR with referring to Sanger sequencing. Results: Multiplex-PCR EGFR mutation assay can identify nucleotide modification at exon 19, exon 21 with sensitivity is 0,1%; 1% and 1%, respectively. Sequencing had confirmed the results of multiplex-PCR but its sensitivity is less than multiplex-PCR (>5%). The concordance was also established between our novel VEGF allelic screening assay and Sanger sequencing. Conclusion: We have successful established assays for detecting mutation of EGFR screening for allelic variants of VEGF. Key words: Lung cancer, NSCLC, EGFR, VEGF, multiplex-PCR. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư phổi (UTP) là bệnh gây tử vong cao nhất trong số các bệnh ung thư mà con người biết đến. Dựa trên hình thái tế bào người ta chia UTP thành UTP tế bào nhỏ (UTPTBN) và UTP không tế bào nhỏ (UTPKTBN). UTPTBN chiếm 15-20% ca ung thư, còn lại 80-85% số ca UTP là UTPKTBN. Do phác đồ hóa trị hoặc xạ trị tương đối có hiệu quả đối với UTPTBN nên các nghiên cứu lâm sàng tập trung nhiều vào việc chữa trị cho các bệnh nhân UTPKTBN. Một đặc điểm nổi bật của UTPKTBN là sự gia tăng mức độ biểu hiện của thụ thể biểu mô (epithelial growth factor receptor-EGFR), thụ thể này mang hoạt tính tyrosine kinase. Hoạt động của enzyme này lại phụ thuộc nhiều vào tương tác giữa EGFR với các phân tử ATP tự do trong bào tương. Một khi EGFR thu nhận được ATP, nó sẽ chuyển sang trạng thái bị kích hoạt và truyền tín hiệu sống sót tới nhân bào, hỗ trợ cho quá trình tăng sinh của tế bào đồng thời tăng khả năng di căn của tế bào ung thư tới các mô lân cận. Hiện nay trên thị trường dược phẩm tồn tại hai hợp chất có khả năng ức chế EGFR đã được cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho phép sử dụng trong điều trị UTPKTBN giai đoạn muộn là Gefitinib, Erlotinib. Việc chỉ định sử dụng các dược phẩm này phụ thuộc vào trạng thái đột biến của gene EGFR. Nghiên cứu cho thấy các cộng đồng dân cư khác nhau có tần suất xuất hiện các đột biến EGFR khác nhau: trong khi chỉ có 10-15% bệnh nhân UTPKTBN người Âu, Phi mang đột biến EGFR, thì tỷ lệ này ở châu Á là khoảng 40-60% (Takano, Fukui et al. 2008; Mok, Wu et al. 2009). Đa số các trường hợp đột biến gene EGFR xảy ra ở các exon 18 (3%), exon 19 (45-53%), exon 20 (4%), và exon 21 (45%) (Maemondo, Inoue et al. 2010). Như vậy, sẽ có tỷ lệ tương đối lớn (40–90%) bệnh nhân UTPKTBN không mang các đột biến phù hợp cho các phác đồ điều trị đích sử dụng Gefitinib hay Erlotinib. Vì vậy, việc tìm kiếm các đích phân tử mới phù hợp cho nhóm bệnh nhân này đã được tiến hành. Các nghiên cứu cho thấy tăng sinh mạch là một trong những tính chất bệnh sinh ác tính điển hình ở UTP: do nhu cầu dinh dưỡng và nhu cầu trao đổi chất cao hơn mức bình thường, do đó đòi hỏi sự hình thành nhiều hệ thống mạch máu mới và vì thế tế bào ác tính bài tiết ra tác nhân tăng sinh mạch (Vascular endothelial growth factor VEGF). Tuy nhiên, VEGF không bộc lộ trên bề mặt tế bào 25 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ISSN 1859 - 3925 Số 15 tháng 12/ 2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI ác tính mà tuần hoàn trong môi trường và tác động lên thụ thể đặc hiệu trên tế bào biểu mô đích từ đó cảm ứng các tế bào biểu mô biệt hóa thành các tế bào mạch máu mới. Việc loại bỏ VEGF bằng kháng thể đặc hiệu Benvacizumab sẽ gián tiếp ức chế tế bào ung thư thông qua việc ức chế quá trình tạo mạch mới nhờ đó một mặt “ngây ngạt” cho khối u, mặt khác cắt nguồn dinh dưỡng nuôi khối u gây hoại tử khối u. Một đặc điểm nổi bật của liệu pháp ức chế VGFR trong điều trị ung thư là không phải mọi bệnh nhân có biểu hiện VGFR đều đáp ứng tốt với phác đồ điều trị sử dụng Bevacizumab: các thể đa hình khác nhau sẽ định hình các kiểu gene VGFR khác nhau với các mức tiên lượng đáp ứng điều trị khác nhau. Cho đến nay người ta đã biết có ít nhất 8 thể đa hình khác nhau trên khu vực mã hóa gene VGFR. Tùy từng cộng đồng dân cư khác nhau mà tần suất các kiểu gene VGFR sẽ khác nhau đồng thời đáp ứng của các thể mang kiểu gene tương ứng với phác đồ bevacizumab cũng khác nhau. Cho đến nay, để xác định các đột biến gene EGFR cũng như VGFR người ta chủ yếu dựa vào công nghệ giải trình tự gene hoặc mua Kit thương mại dựa trên nguyên lý Real Time PCR hoặc PCR kết hợp ELISA. Do tính chất phức tạp của những đột biến gene EGFR và VGFR nên các phương pháp trên có nhiều hạn chế như: (i) giải trình tự gene là phải nhân nhiều đoạn gene, độ nhạy kỹ thuật thấp (yêu cầu tối thiểu phải có hơn 25% gene mang đột biến mới phát hiện được); (ii) các Kit thương mại có giá thành cao, đòi hỏi trang thiết bị phù hợp, phụ thuộc nhập ngoại và có hạn sử dụng ngắn. Do đó, việc tìm hiểu và thiết lập một phương pháp phát hiện kiểu gene VEGF và xác định đột biến gene EGFR không sử dụng phản ứng sequencing là điều cần thiết vì thế chúng tôi đặt ra nghiên cứu này với mục tiêu: thiết lập quy trình phát hiện kiểu gene VEGR và kiểu đột biến gene EGFR ứng dung trong điều trị bệnh nhân UTPKTBN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Các dòng tế bào UTPKTBN mang đột biến EGFR: PC9, NCI-1650, HCC827 (delE746-A750), H1975 (L858R). Các hóa chất chuẩn dùng trong realtime-PCR, gel-PCR do hãng Invitrogen inc cung cấp. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Phương pháp xác định đột biến gene EGFR: Các dòng tế bào được nuôi cấy theo phương pháp chuẩn, sau 4-7 ngày kiểm tra đạt mật độ đạt khoảng 5-8x105 tế bào/ml. Toàn bộ tế bào, DNA tổng số được tách chiết và dùng làm khuôn cho phản ứng multiplex-PCR với bộ mồi đặc hiệu cho các thể hoang dại (wild type=WT) hoặc đột biến mất đoạn trên exon 19 (delE746-A750) và đột biến điểm trên exon21 tại vị trí L858R. Trình tự mồi được chúng tôi tự thiết kế nên sẽ cung cấp nếu bạn đọc quan tâm. Mismatch signal Specific signal Hình 1: Cở sở lý thuyết của phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR Phương pháp này do Soren Germer đề xướng (Germer, Holland et al. 2000; O’Brien, Everhart et al. 2011): đầu 3’ của mồi xuôi (forward primer) bắt cặp chính xác với nucleotide tại vị trí SNP. Để kiểm tra sự có mặt của một allele tại mỗi vị trí SNP, ta thực hiện đồng thời 2 phản ứng real – time PCR (tương ứng với 2 bộ bồi allele 1 specific primer, allele 2 specific primer và nhận được 2 đường tín hiệu huỳnh quang). Trong trường hợp đồng hợp tử, sẽ xuất hiện 2 phổ huỳnh quang riêng biệt: đường sớm (specific signal) mô tả tín hiệu đặc hiệu, đường muộn mô tả tín hiệu bắt cặp lệch primer (mismatch siganl). Trong trường hợp dị hợp tử 2 đường cong tín hiệu huỳnh quang sẽ gần như trùng khít lên nhau. 2.2.2. Phương pháp phát hiện kiểu gene VEGF: Tính đa hình của gene VEGF được xác định theo 26 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925 nguyên lý động học allele đặc hiệu real-time PCR. Phương pháp này là do Søren Germer (Germer, Holland et al. 2000) thiết lập lần đầu tiên vào năm 2000. Nguyên lý của phương pháp này được tóm tắt như sau: 2 bộ mồi đặc hiệu cho từng allele được thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi (forward primer) bắt cặp chính xác với hai allele riêng biệt tại vị trí có SNP, trong khi đó mồi ngược (reverse primer) sẽ được dùng chung cho cả 2 allele. Tại mỗi một vị trí SNP, sẽ tồn tại 1 trong 3 trình tự nucleotide như sau: đồng hợp tử allele trội (homozygous major alleles), dị hợp tử (heterozygous) và đồng hợp tử allele hiếm (homozygous minor alleles). Khi tiến hành chẩn đoán SNP, ta tiến hành đồng thời 2 phản ứng real time PCR (sử dụng Sybr green I để nhận biết sản phẩm PCR) bắt cặp tương ứng với 2 allele tại vị trí nghi ngờ có SNP. Lúc đó sẽ xảy ra 2 khả năng: i) nếu mẫu DNA là đồng hợp tử, từ tín hiệu huỳnh quang (trên lý thuyết) chỉ được ghi nhận ở duy nhất 1 allele tương ứng. Tuy nhiên, trong thực hành sẽ xảy ra hiện tượng bắt cặp lệch (mismatch) của primer, do đó ngay cả khi mẫu DNA là đồng hợp tử thì tín hiệu huỳnh quang vẫn xuất hiện ở cả 2 allele trong đó tín hiệu giả sẽ chậm hơn tín hiệu thật khoảng từ 3 đến 15 chu kỳ (hình 1- panel trái) (Germer, Holland et al. 2000; O’Brien, Everhart et al. 2011). ii) trong trường hợp mẫu DNA là dị hợp tử, tín hiệu huỳnh quang sẽ có mặt đồng đều ở cả hai allele, đường cong phổ huỳnh quang của 2 allele sẽ gần trùng khít nhau hoặc chỉ khác nhau dưới 1 chu kỳ (∆Ct ≤1) – (hình 1) (Germer, Holland et al. 2000; O’Brien, Everhart et al. 2011) 2.2.3. Phương pháp đánh giá ngưỡng phát hiện (độ nhạy) và độ đặc hiệu kỹ thuật: Để xác định mật độ tối thiểu tế bào ác tính mà tại đó xét nghiệm có khả năng phát hiện được đột biến gene EGFR, chúng tôi tiến hành pha loãng các dòng tế bào mang đột biến gene vào các mẫu tế bào thể hoang dại theo các tỷ lệ: 0:100, 0.1:100, 1:100, 10:100 và 100:100. Sau đó tiến hành tách DNA tống số làm khuôn cho phản ứng PCR. 2.4. Giải trình tự gene: Các đột biến gene sau khi được phát hiện bằng các phương pháp trên sẽ được giải trình tự theo phương pháp Sanger trên hệ thống CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ) để khẳng định kết quả và so sánh độ nhạy kỹ thuật. III. KẾT QUẢ 3.1. Kết quả phát hiện đột biến gene EGFR trên exon 19 và 21 Hình 2: Kết quả sau khi chạy PCR đa mồi và điện di phát hiện đột biến gene EGFR tại exon 19 và 21. Nhận xét: Các băng điện di rõ nét cho phép xác định đột biến gene EGFR tại vị trí exon 19 (băng có mũi tên đỏ hình bên trái) và vị trí exon 21 (băng có mũi tên đỏ hình bên phải). Negative control: chứng âm, WT: thể dại, mutant: đột biến. DNA ladder: thang chuẩn. 3.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu kỹ thuật xác định đột biến gene EGFR tại exon19 bằng PCR đa mồi (delE746-A750) Hình 3: Kết quả minh họa phát hiện đột biến gene EGFR theo nồng độ. Nhận xét: Mật độ băng điện di của thể đột biến (ĐB) giảm dần theo nồng độ từ cao đến thấp. Nồng độ cuối cùng 0,1% tế bào đột biến vẫn có thể nhìn thấy rõ băng điện di. Kết quả cũng chứng minh rằng ở nồng độ 0% tế bào mang gene đột biến thì không nhìn thấy băng điện di. Chứng tỏ độ nhạy của 27 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ISSN 1859 - 3925 Số 15 tháng 12/ 2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI phương pháp là 1 tế bào mang gene đột biến trong 1000 tế bào bình thường và độ đặc hiệu là 100%, không có kết quả dương tính giả. 3.3. Khẳng định kết quả của phương pháp bằng giải trình tự gene Hình 4: Kết quả giải trình tự gene EGFR theo nồng độ gene mang đột biến. Nhận xét: khi có 25% gene đột biến trong tổng số gene không đột biến thì giải trình tự gene có thể phát hiện được. Tuy nhiên, khi nồng độ gene đột biến giảm chỉ còn 5% thì bằng giải trình tự không phát hiện được. 3.4. Hình ảnh của phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR (kinetics allele specific real- time PCR) 28 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925 Hình 5: Kết quả xây dựng phương pháp động học allele đặc hiệu real-time PCR. Nhận xét: So với lý thuyết mà hình ảnh mà chúng tôi thu được hoàn toàn phù hợp và cho tín hiệu rất rõ ràng. Hình 6: Kết quả giải trình tự gene tại SNP rs3025039 và RS833061 trên các mẫu VP1 và VP2. Nhận xét: Kết quả giải trình tự gene hoàn toàn phù hợp với phương pháp động học allele đặc hiệu real- time PCR. Mẫu bệnh phẩm VP1 được chẩn đoán là đồng hợp tử C/C (hình 6 đầu mũi tên panel trái) và mẫu VP2 được chẩn đoán là dị hợp tử C/T (hình 6 đầu mũi tên panel phải) đối với SNP RS833061. IV. BÀN LUẬN UTP là một trong những bệnh ác tính có thời gian tiến triển bệnh nhanh và gây tử vong cao nhất trong số nhóm bệnh ung thư. Nếu như sử dụng phác đồ kinh điển sử dụng carboplatin–paclitaxel thì thời gian sống không bệnh và thời gian sống thêm của bệnh nhân UTPKTBN tương ứng là 5,4 tháng và 23,6 tháng. Trong khi đó, con số này ở bệnh nhân được điều trị bằng dược phẩm tyrosine kinase inhibitor (Gefitinib và Erlotinib) ức chế thụ thể biểu mô tương ứng là 10,8 và 30,5 tháng (Caicun Zhou* 2010; Maemondo, Inoue et al. 2010). Tuy nhiên, đáp ứng điều trị của bệnh nhân UTPKTBN với các dược phẩm nói trên là hoàn toàn khác nhau: i) Chỉ có các cá thể mang đột biến (delE746-A750) và (L858R) trên exon 18 và 21 mới đáp ứng tốt với phác đồ này. ii) Các bệnh nhân khác hoặc không đáp ứng điều trị (nếu mang thụ thể EGFR hoang dại) iii) Hoặc bệnh sẽ trở nên tồi tệ hơn (đối với các các thể mang đột biến trên exon 18 hoặc 20). Chính vì lẽ đó việc sàng lọc đột biến EGFR là một việc rất có ý nghĩa trong điều trị UTPKTBN. Trên thực tế văn bản mới nhất hướng dẫn điều trị UTP do mạng lưới ung thư quốc gia Mỹ ban hành năm 2013 cũng khuyên cáo thực hiện xét nghiệm sàng lọc đột biến (delE746-A750) và (L858R) trước khi cân nhắc các phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân UTPKTBN. Tuy nhiên, xét nghiệm này có giá thành rất cao nếu sử dụng các kit thương mại (mặc dù độ nhạy của các kít này cũng chỉ cho phép phát hiện các phân tử DNA đột biến khi quần thể của chúng đạt ngưỡng trên 1%). Chi phí cho một lần xét nghiệm là 5-10 triệu đồng/bệnh nhân như một số cơ sở có triển khai xét nghiêm này ở nước ta. Đây là mức giá quá cao, quá sức chịu đựng của đa số bệnh nhân. Xuất phát từ những ý nghĩa đó, Khoa sinh học phân tử, BV TƯQĐ 108 đã nghiên cứu xây dựng xét nghiệm chẩn đoán 2 dạng đột biến chính (delE746-A750) và (L858R) trên gene EGFR. Kết quả cho thấy độ nhạy kỹ thuật là 1% đến 0,1%, tức là có thể phát hiện đột biến khi có ít nhất 1 phân tử DNA mang đột biến gene EGFR tại exon 19 trong tổng số 1000 phân tử DNA bình thường và ít nhất 1 phân tử DNA mang đột biến gene EGFR tại exon 21 trong tổng số 100 phân tử DNA bình thường. Độ đặc hiệu là 100%, không có hiện tượng dương tính giả. Kết quả này là tương đương với khuyến cáo của bộ Kit thương mại sử dụng công nghệ Scopion của Qiagen. So với giải trình tự gene thì độ nhạy của phương pháp do chúng tôi xây dựng cao hơn rõ rệt (1% so với 25%). Về mặt kinh tế, theo tính toán của chúng tôi mỗi lần xét nghiệm gene EGFR bệnh nhân chỉ phải thanh toán 2 400 000 VNĐ rẻ hơn nhiều so với xét nghiệm này ở các cơ sở khác trong khu vực Hà Nội. Bevacizumab đã được cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ cấp phép điều trị UTP ( approveddrugs/ucm336763.htm). Tuy nhiên, ngoài kiểu gene VEGF, chưa có một dấu hiệu nào giúp 29 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ISSN 1859 - 3925 Số 15 tháng 12/ 2013 TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI tiên lượng đáp ứng của bệnh nhân với dược phẩm này. Vì thế, việc thiết lập một phương pháp phù hợp cho phát hiện kiểu gene VEGF là điều cần thiết. Cho đến nay Sanger sequencing vẫn được coi là phương pháp chuẩn trong phát hiện kiểu gene, tuy nhiên khi thể đa hình của một gene quá lớn và nằm rải rác cách xa nhau thì không thể thiết kế một phản ứng giải trình tự gene cho nhiều thể đa hình một lúc. Hơn nữa giải trình tự gene có chi phí lớn và thời gian cho kết quả dài. Sau khi cân nhắc các phương pháp thay thế và các trang thiết bị sẵn có chúng tôi tiến hành thiết lập phương pháp “động học allele đặc hiệu real-time PCR-kinetics allele specific real-time PCR”, Phương pháp này là do Søren Germer thiết lập lần đầu tiên vào năm 2000 (Germer, Holland et al. 2000) nguyên lý của nó được mô phỏng ở hình 1. So với các phương pháp xác định kiểu gene (genotyping) truyền thống như: cắt enzyme giới hạn (RFLP) hay đọc trình tự (Sanger sequencing) phương pháp mà chúng tôi sử dụng có các ưu thế là: (i) Quy trình xét nghiệm đơn giản: nếu như RFLP bao gồm 3 bước chính là chạy PCR, cắt enzyme và chạy điện di agarose còn đọc trình tự (Sanger sequencing) phải cần tới 2 lần chạy PCR và phân tích số liệu sau giai trình tự, thì kinetics allele specific real-time PCR chỉ có một bước chạy RT-qPCR; (ii) Rẻ tiền hơn mặc dù tính trung bình một phản ứng real time PCR sẽ có giá thành cao hơn phản ứng PCR thông thường, nhưng RFLP đòi hỏi thêm bước cắt enzyme giới hạn và chạy điện di agarose, nên thực tế phương pháp kinetics allele specific real-time PCR vẫn kinh tế hơn. Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công phương pháp xác định đột biến gene EGFR và phát hiện kiểu gene VEGF với ngưỡng phát hiện là 0,1- 1% (độ nhạy kỹ thuật) và có độ đặc hiệu 100%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alan Sandler, M. D., Robert Gray, Ph.D., Michael C. Perry, M.D., Julie Brahmer, M.D., Joan H. Schiller, M.D., Afshin Dowlati, M.D., Rogerio Lilenbaum, M.D., and David H. Johnson, M.D (2005). “Paclitaxel–Carboplatin Alone or with Bevacizumab for Non–Small-Cell Lung Cancer.” The new england journal o f medicine. 2. Caicun Zhou*, Y.-L. W., Gongyan Chen, Jifeng Feng, Xiao-Qing Liu, Changli Wang, Shucai Zhang, Jie Wang, Songwen Zhou, Shengxiang Ren, Shun Lu, Li Zhang†, Chengping Hu, Chunhong Hu, Yi Luo, Lei Chen, Ming Ye, Jianan Huang, Xiuyi Zhi, Yiping Zhang, Qin gyu Xiu, Jun Ma,Li Zhang‡, Changxuan You (2010). “Erlotinib versus chemotherapy as fi rst-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): a multicentre, open- label, randomised, phase 3 study.” Lancet Oncol 2011; 2012: 2735–2042. 3. Germer, S., M. J. Holland, et al. (2000). “High- throughput SNP allele-frequency determination in pooled DNA samples by kinetic PCR.” Genome Res 10(2): 258-266. 4. Jemal, A., R. Siegel, et al. (2009). “Cancer statistics, 2009.” CA Cancer J Clin 59(4): 225-249. 5. Klaus Podar, G. T., Martin Sattler, Yu-Tzu Tai, Steven LeGouill, Hiroshi Yasui, Kenji Ishitsuka, Shaji Kumar, Rakesh Kumar, Lini N. Pandite, Teru Hideshima, Dharminder Chauhan, and Kenneth C. Anderson (2005). “The small-molecule VEGF receptor inhibitor pazopanib (GW786034B) targets both tumor and endothelial cells in multiple myeloma.” PNAS 103. 6. Lucio Crinò, E. D., Pilar Garrido, Frank Griesinger, Janessa Laskin, Nick Pavlakis, Daniel Stroiakovski, Nick Thatcher, Chun-Ming Tsai, and C. Z. Yi-long Wu (2010). “Safety and effi cacy of fi rst-line bevacizumab-based therapy in advanced non-squamous non-small-cell lung cancer (SAiL, MO19390): a phase 4 study.” Lancet Oncol 733– 740. 7. Maemondo, M., A. Inoue, et al. (2010). “Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR.” N Engl J Med 362(25): 2380-2388. 8. Mok, T. S., Y. L. Wu, et al. (2009). “Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma.” N Engl J Med 361(10): 947-957. 9. O’Brien, T. R., J. E. Everhart, et al. (2011). “An IL28B genotype-based clinical prediction model for treatment of chronic hepatitis C.” PLoS One 6(7): e20904. 10. Takano, T., T. Fukui, et al. (2008). “EGFR mutations predict survival benefit from gefitinib in patients with advanced lung adenocarcinoma: a historical comparison of patients treated before and after gefitinib approval in Japan.” J Clin Oncol 26(34): 5589-5595. 11. WHO (2013). hepatitis/world_hepatitis_day/question_answer/en 30 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC TẠP CHÍ LAO VÀ BỆNH PHỔI Số 15 tháng 12/ 2013 ISSN 1859 - 3925