Phân lập một số hợp chất từ dược liệu cỏ mực và mật nhân trong bài thuốc có tác dụng cai nghiện rượu của ông Lê Văn Lâm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 293 PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ DƢỢC LIỆU CỎ MỰC VÀ MẬT NHÂN TRONG BÀI THUỐC CÓ TÁC DỤNG CAI NGHIỆN RƢỢU CỦA ÔNG LÊ VĂN LÂM Huỳnh Thị Thanh Tâm*, Huỳnh Trần Quốc Dũng*, Nguyễn Ngọc Thạch*, Nguyễn Đức Hạnh*, Hồ Việt Sang***, Nguyễn Minh Đức*,***. TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Nền y học cổ truyền đã có nhiều dược liệu cũng như b|i thuốc quý gi{ để điều trị bệnh nghiện rượu cho tác dụng rất tốt v| an to|n cho người sử dụng. Trong đó, không thể không nhắc đến bài thuốc cai rượu của ông Lê Văn L}m. B|i thuốc cai rượu n|y đã được sử dụng từ l}u đời. Đề t|i được tiến h|nh để phân lập một số hợp chất từ Cỏ mực, Mật nhân (2 thành phần của bài thuốc) để có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo - xây dựng tiêu chuẩn cho bài thuốc. Phương ph{p nghiên cứu: Cỏ mực được chiết xuất với EtOH 70%, cô dịch chiết; ph}n t{n trong nước và chiết phân bố lần lượt với ete dầu, n – butanol bão hòa nước. Cao khô Mật nh}n được ph}n t{n trong nước, chiết phân bố với n-BuOH bão hòa nước. Tiến hành phân lập từ ph}n đoạn n-BuOH bằng cách kết hợp c{c phương pháp sắc ký. Các hợp chất được x{c định cấu trúc dựa vào phổ NMR. Kết quả: Từ 2 kg dược liệu khô Cỏ mực đã ph}n lập được 108 mg hợp chất eclalbasaponin I, 217 mg hợp chất echalbasaponin II. Từ 60 g cao khô Mật nh}n đã ph}n lập được 124 mg eurycomanon Kết luận: eclalbasaponin I, eclalbasaponin II, eurycomanon thu được khá tinh khiết, có thế ứng dụng vào công tác nghiên cứu, kiểm nghiệm dược liệu Cỏ mực, Mật nhân. Từ khóa: Cỏ mực, Mật nhân, eclasaponin I, eclasaponin II, eurycomanon ABSTRACT ISOLATION OF COMPOUNDS FROM HERBA ECLIPTAE AND RADIX EURYCOMAE Huynh Thi Thanh Tam, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Ngoc Thach, Nguyen Duc Hanh, Ho Viet Sang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 293 - 297 Introduction - objectives: Traditional medicine has many herbs as well as valuable remedies for alcoholism to work very well and to be safe for users. In a particular way, the remedy of Mr. Le Van which has been used for a long time was one of them. In order to achieve this long-term goal, the research was carried out with the following specific objectives: Study on the isolation of some compounds from 2 medicinal herbs (E. alba, E. longifolia) to ensure the quality of medicinal herbs and the remedy. Methods: Herba Ecliptae was refluxed with 70% ethanol. Then the ethanolic solution was evaporated under low pressure to obtain an ethanolic extract. The extract was then dispersed in water and partitioned with petroleum ether and water saturated n-butanol, consecutively. Dry extract of Radix Eurycomae was dispersed in water and partitioned with water saturated n-butanol. These n-butanol extracts were used for chromatography analysis. And the structures were identified based on NMR spectrum. Results: Herba ecliptae: 108 mg of eclalbasaponin I and 217 mg of eclalbasponin II were isolated from 2 kg of * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh ** Hội Dƣỡng sinh tâm thể tỉnh DakLak *** Khoa Dƣợc, Đại học Tôn Đức Thắng Tác giả liên lạc: GS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908988820 Email: ducng@hcm.vnn.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 294 crude materials. Radix erycomae: 124 mg of eurycomanone was isolated from 60 g of the crude extract. Conclutions: Isolated eclalbasaponin I, eclalbasaponin II, eurycomanon can be used in building the quality of medicinal herbs and the remedies. Keywords: Herba Eclipta, Radix Eurycomae, eclalbasaponin I, eclalbasaponin II, eurycomanone ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiện rƣợu gây ra các biến chứng về gan, tim, thần kinh,< để lại những hậu quả rất nặng nề cho bản th}n, gia đình ngƣời nghiện mà còn là một gánh nặng cho xã hội(1-4). Để khắc phục tình trạng đó, y học hiện đại chủ yếu sử dụng nhiều thuốc hóa dƣợc, tuy nhiên, các thuốc này thƣờng đi kèm với nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Nền y học cổ truyền đã có nhiều dƣợc liệu cũng nhƣ b|i thuốc quý gi{ để điều trị bệnh nghiện rƣợu cho tác dụng rất tốt và an toàn cho ngƣời sử dụng. Trong đó, không thể không nhắc đến bài thuốc cai rƣợu của ông Lê Văn L}m. Qua thực tế điều trị tại cơ sở khám chữa bệnh của bác sỹ Hồ Việt Sang đã cho thấy bài thuốc rất hiệu quả mà không ghi nhận tác dụng phụ n|o đ{ng kể. Bài thuốc gồm 5 thành phần Bình tinh, Dong riềng, Cỏ mực, Mật nhân, Cà gai leo. Cỏ mực (Herba Eclipta) l| dƣợc liệu cổ truyền của nƣớc ta, có thành phần hóa học là các saponin, alkaloid, flavonoid, coumarin, đƣợc sử dụng làm thuốc bổ toàn thân, cầm máu, chữa ứ tắc trong các bệnh phì đại về gam và lách(6,10). Mật nhân (Radix Eucomiae) với thành phần hóa học đặc trƣng l| quassinoid, alkaloid, triterpen, biphenyl neolignan v| steroid cũng cho nhiều tác dụng đ{ng quý(8,9). Do bài thuốc đƣợc bào chế bằng phƣơng pháp sắc thuốc nên nghiên cứu tập trung vào việc phân lập các hợp chất trong ph}n đoạn phân cực để làm chất đ{nh dấu cho dƣợc liệu và cao chiết từ bài thuốc. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PH[P NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Dƣợc liệu Cỏ mực đƣợc cung cấp bởi bác sĩ Hồ Việt Sang, hội Dƣỡng sinh tâm thể tỉnh Đắk Lắk. - Cao sấy phun Mật nh}n đƣợc chiết xuất bởi Ban Nghiên cứu khoa học – Thƣ viện, Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh. Trang thiết bị Hệ thống HPLC LC-8A, LC – 20AD, SPD- 20A (Shimazu – Nhật). Cột Phenomenex Luna C18, cột Discovery HS C18 với detector UV (Mỹ). Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 (Merck – Đức), đèn UV 254 nm v| 365 nm (Đức). M{y đo phổ khối LC–MS Agilent 1260 (Mỹ). M{y đo phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Brüker AVANCE 500 (Mỹ). Silica gel sắc ký cột (Kích thƣớc hạt 0,043 - 0,06 mm) (Mỹ). Tủ sấy chân không Gallentkamp (Anh). Bình chiết phân bố, hệ thống lọc chân không, m{y cô quay dƣới áp suất giảm, bếp đun cách thủy. Phƣơng ph{p nghiên cứu 2 kg Cỏ mực đƣợc chiết hồi lƣu với EtOH 70% trong 6 giờ, cô thu hồi dung môi đƣợc 217 g cao toàn phần. Cao toàn phần đƣợc phân tán trong nƣớc và chiết phân bô lỏng lỏng lần lƣợt với été dầu và n-BuOH bão hòa nƣớc. Ph}n đoạn n-BuOH đƣợc loại dung môi thu đƣợc 131,1 g cao. Cao này tiếp tục đƣợc tiến hành sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH (gradient) thu đƣợc 4 phân đoạn AB1 – AB4. Ph}n đoạn AB2 (7 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột C18 với hệ dung môi MeOH – H2O (gradient) thu đƣợc 217 mg hợp chất 1. Ph}n đoạn AB3 (1,02 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột C18 với hệ dung môi MeOH – H2O (gradient) thu đƣợc 108 mg hơp chất 2. Các hợp chất phân lập đƣợc xác định cấu trúc bằng phổ NMR và so sánh dữ liệu với tài liệu tham khảo. 60 g cao khô Mật nh}n đƣợc phân tán trong nƣớc và chiết phân bố với n-BuOH bão hòa nƣớc. Ph}n đoạn n-BuOH đƣợc loại dung môi thu đƣợc 37 g cao. Cao n|y đƣợc tiến hành sắc ký cột pha thuận với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH (gradient) thu đƣợc 3 phân Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 295 đoạn CB1 – CB3. Ph}n đoạn CB2 (3,4 g) đƣợc tiếp tục tinh chế bằng HPLC điều chế với hệ dung môi MeOH – H3PO4 0,01% (12 : 88) thu đƣợc 124 mg hợp chất 3. Cấu trúc đƣợc xác định dựa trên dữ liệu phổ MS và NMR phù hợp với tài liệu tham khảo. KẾT QUẢ Hợp chất 1 (Eclasaponin II) Eclalbasaponin I Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 đo ở 500 MHz trong dung môi pyridin-d5 cho các tín hiệu proton đặc trƣng sau 7 tín hiệu proton ở 0,89 ppm (3H, s); 1,02 ppm (6H, s); 1,06 ppm (3H, s); 1,09 ppm (3H, s); 1,21 ppm (3H, s); 1,33 ppm (3H, s) thể hiện cho 7 nhóm -CH3. Theo 33 tài liệu tham khảo(7) có thể gắn lần lƣợt cho các nhóm -CH3 ở vị trí 18, 21; 27; 26; 28, 29, 30 eclalbasaponin II. + Tín hiệu proton của H anomer 1’ của đƣờng tƣơng ứng với tín hiệu 4,97 ppm (1H, d, J = 7,5 Hz) nên đ}y l| đƣờng dãy β. Vùng 3,0 - 5,0 ppm mang nhiều tín hiệu có thể gán cho proton các nhóm -CH-OH- trên khung và trên chuỗi đƣờng. Các tín hiệu này bị chồng phủ nên khó x{c định chính xác. Phổ 13C-NMR của hợp chất I phân lập đo ở 125 MHz trong dung môi pyridin-d5 cho tất cả 42 tín hiệu: 1 tín hiệu ở vùng khoảng 100 ppm (107,0 ppm) chính là tín hiệu C-1’ của đƣờng glucose. Vùng 60 - 90 ppm cho 7 tín hiệu. Bảng 1: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) của hợp chất 1 và dữ liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) của eclalbasaponin II theo tài liệu tham khảo(7) Vị trí Eclalbasaponin II Hợp chất 1 δC ppm δH ppm δC ppm δH ppm 1 38,8 38,98 2 26,5 24,93 3 88,7 89,01 4 39,4 39,70 5 55,8 56,11 6 18,4 18,70 7 33,3 33,03 8 39,9 40,09 9 47,2 47,35 10 36,9 37,23 11 23,7 23,99 12 122,0 122,55 13 145,1 145,34 14 41,7 41,63 15 36 36,33 16 74,6 74,92 17 49 49,09 18 42,1 42,31 19 47,2 47,48 20 30,8 31,22 21 36,0 36,40 22 33,3 33,52 23 28,2 0,89 s 28,43 0,89 s 24 16,9 1,00 s 17,23 1,02 s 25 15,7 1,01 s 15,76 1,06 s 26 17,6 1,04 s 17,67 1,09 s 27 27,9 1,17 s 26,79 1,21 s 28 180,1 180,17 29 33,3 1,30 s 33,70 1,33 s 30 28,1 1,77 s 27,43 1,89 s Glc 1’ 106,7 4,92 d 107,04 4,97 d 2’ 75,6 75,99 3’ 78,6 78,94 4’ 71,7 72,07 5’ 78,0 78,44 6’ 62,8 63,24 Trong đó, gồm 5 carbon gắn với nhóm - OH của đƣờng (5 tín hiệu của đƣờng glucose) và 2 tín hiệu -C-O- trên khung aglycon ở các vị trí 3, 16. + Vùng có độ dịch chuyển < 60 ppm cho các tín hiệu của carbon sp3. Hợp chất I có 25 tín hiệu carbon sp3. + 1 tín hiệu ở vùng > 180 ppm (180,2 ppm) chính là tín hiệu của nhóm –COOR + 2 tín hiệu ở vùng 115-150 ppm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 296 (122,6 ppm và 145,3 ppm) cho thấy có tín hiệu nối đôi ở vị trí 12, 13. Kết quả so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 và eclasaponin II đƣợc trình bày trong Bảng 1. Hợp chất 2 (eclasaponin I) Eclalbasaponin II Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 đo ở 500 MHz trong dung môi pyridin-d5 cho các tín hiệu proton đặc trƣng sau: + 6 tín hiệu proton của nhóm -CH3. Trong đó, có 1 tín hiệu ở 1,00 ppm có tích phân 6,0 là tín hiệu của 2 nhóm -CH3 bị chập. Vậy 6 tín hiệu ở 0,89 ppm (3H, s); 1,00 37 ppm (6H, s); 1,05 ppm (3H, s); 1,13 ppm (3H, s); 1,29 ppm (3H, s); 1,85 ppm (3H, s) thể hiện cho 7 nhóm -CH3. theo tài liệu tham khảo(7) có thể gán lần lƣợt cho các nhóm -CH3 ở vị trí 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30 của eclaclbasaponin I. Vùng 3,0 - 5,0 ppm mang nhiều tín hiệu có thể gán cho proton các nhóm -CH-OH- trên khung và trên chuỗi đƣờng. Các tín hiệu này bị chồng phủ nên khó x{c định chính xác. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2 phân lập đo ở 125 MHz trong dung môi pyridin- d5 cho tất cả 41 tín hiệu: 1 tín hiệu ở vùng 106,7 ppm chính là tín hiệu C-1’ của đƣờng glucose. Ngoài ra còn có 1 tín hiệu 96,7 ppm downfield hơn do gắn với -COO-. Vùng 60 - 90 ppm cho 12 tín hiệu. Trong đó, gồm 10 carbon gắn với nhóm -OH của 2 đƣờng (5 tín hiệu của đƣờng glucose) và 2 tín hiệu -C-O- trên khung aglycon ở các vị trí 3, 16. Vùng có độ dịch chuyển < 60 ppm cho các tín hiệu của carbon sp3. Bảng 2: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) của hợp chất 2 và dữ liệu phổ NMR (pyridin-d5, 125/500 MHz) của eclalbasaponin I theo tài liệu tham khảo(7) Vị trí Hợp chất 2 Eclalbasaponin I δC ppm δH ppm δC ppm δH ppm 1 38,6 38,7 2 26,3 26,4 3 88,6 88,7 4 39,2 39,3 5 55,7 55,8 6 18,3 18,4 7 33,3 33,2 8 40 39,8 9 47 46,9 10 37 36,8 11 23,7 23,6 12 122,5 122,4 13 144,3 144,2 14 41,9 41,8 15 36 35,8 16 74,2 74 17 49 48,8 18 41,1 41 19 47 46,9 20 30,5 30,6 21 35,8 35,7 22 32 32 23 28 0,89 s 28,1 0,89 s 24 16,8 1,00 s 16,8 1,02 s 25 15,5 1,01 s 15,5 1,06 s 26 17,4 1,05 s 17,3 1,09 s 27 27,1 1,13 s 27 1,21 s 28 175,8 175,7 29 33 1,29 s 33 1,33 s 30 24,4 1,85 s 24,4 1,89 s Glc 1’ 106,7 4,94 d 106,5 4,97 d 2’ 75,6 75,4 3’ 79,2 79 4’ 71,7 71,4 5’ 78,6 78,3 6’ 62,9 62,2 Glc 1’’ 96,7 4,05 m 95,6 4,07 m 2’’ 74 73,8 3” 78,7 78,4 4” 71 70,7 5” 78,1 77,9 6’ 62,1 61,9 Có 24 tín hiệu carbon sp3. + 1 tín hiệu ở vùng 175,8 chính là tín hiệu của nhóm –COOR + 2 tín hiệu ở vùng 115-150 ppm (122,5 ppm và Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 297 144,3 ppm) cho thấy có tín hiệu nối đôi ở vị trí 12, 13. Kết quả so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 v| eclasaponin I đƣợc trình bày trong Bảng 2. Hợp chất 3 (eurycomanon) Eurycomanon Bảng 3: Bảng so sánh dữ liệu phổ 13C-NMR (pyridin- d5, 125 MHz) của hợp chất 3 và dữ liệu phổ 13C- NMR (pyridin-d5, 125 MHz) của eurycomanon theo tài liệu tham khảo(5) Vị trí Hợp chất 3 δC ppm Eurycomanon δC ppm 1 83,9 82,5 2 197,5 197,1 3 125,8 124,9 4 162,2 162,7 5 42 40,7 6 25,2 24,7 7 71,5 70,6 8 52,4 51,3 9 47,6 46,2 10 45,5 44,8 11 108,9 107,8 12 80,4 79,2 13 146,8 146 14 79,2 78 15 77,8 74,8 16 173,8 172,4 17 22,3 21 18 120,1 119 19 10,1 9,8 20 67,4 66,3 Phổ HR-MS của hợp chất 3 cho thấy ion pic [M+H]+ ở m/z 409,1160 tƣơng ứng với công thức phân tử C20H24O9 của eurycomanon. Kết quả so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất 3 và eurycomanon đƣợc trình bày trong Bảng 3. BÀN LUẬN Eclalbasaponin I, eclalbasaponin II là có thể sử dụng để chất làm đại diện cho nhóm saponin của Cỏ mực. Đồng thời, eurycoumanon cũng đƣợc sử dụng làm chất đánh dấu cho Mật nhân. Kết quả có thể ứng dụng vào kiểm nghiệm sản phẩm từ bài thuốc. KẾT LUẬN Từ 2 kg dƣợc liệu Cỏ mực khô, đề t|i đã phân lập đƣợc 2 hợp chất eclalbasaponin I (108 mg), eclalbasaponin II (217 mg). Từ 30 g cao khô Mật nh}n đã ph}n lập đƣợc 124 mg eurycomanon. Các hợp chất này có thể đƣợc sử dụng để làm chất đ{nh dấu phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dƣợc liệu Cỏ mực, Mật nhân cũng nhƣ chất đ{nh dấu cho cao chiết từ bài thuốc cai rƣợu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Burns MJ, Price JB, Lekawa ME (2015). Delirium tremens (DTs). Medscape Drugs & Diseases. 2. Carrilho PE, Santos MB, Piasecki L, Jorge AC (2013), “Marchiafava-Bignami disease: a rare entity with a poor outcome”, Rev Bras Ter Intensiva, 25(1), pp. 68-72. 3. Chris D. Meletis, N.D. and Jason E. Barker, N.D (2004), Herbs and Nutrients for the Mind, Praeger Publishers, USA, pp. 17. 4. Cremers I, Ribeiro S (2014), “Management of variceal and nonvariceal upper gastrointestinal bleeding in patients with cirrhosis”, Therap Adv Gastroenterol, 7(5), pp. 206-216. 5. Leonardus B.S. Kardono et al (1991), “Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia”, Journal of Natural Products, 54(5), pp. 1360- 1367. 6. Mithun et al (2011), “Eclipta alba (L.) A Review on its Phytochemical and Pharmacological Profile”, Pharmacologyonline, 1, pp. 345-357. 7. Ning Ding, Shoji Yahara, and Toshihiro Nohara (1994), "Oleanane Glycosides from Eclipta alba", Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42(6), pp. 1336–1338. 8. Rajeev Bhat, A.A. Karim (2010), “Tongkat ali (Eurycoma longifolia Jack): A review on its ethnobotany and pharmacological importance”, Fitoterapia, 81, pp. 669-679. 9. Shaheed UR Rehman et al (2016), “ Review on a traditional herbal medicine, Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali): Its traditional uses, chemistry, evidence – based pharmacology and toxicology”, Molecules, 21(331), pp. 1–31. 10. Viện dƣợc liệu (2006), Cây thuốc v| động vật làm thuốc ở Việt nam, Tập I, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 800-807. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018