Phân lập và khảo sát một số chủng vi nấm có hoạt tính chống oxy hóa

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 256 PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Minh Thái*, Đoàn Duy Thanh*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Phân tử oxy hoạt động liên quan đến bệnh hen suyễn, sự nhiễm trùng, viêm khớp, bệnh suy giảm thần kinh Parkinson, bệnh tim mạch và tiểu đường. Chất chống oxy hóa đóng vai trò như tác nhân đánh bắt gốc tự do, ức chế sự peroxide hóa lipid, vì vậy chúng có khả năng bảo vệ cơ thể trước nhiều bệnh tật có nguyên nhân từ gốc tự do. Gần đây, vi nấm được xem là nguồn cung cấp các chất chống oxy hóa mới. Mục tiêu: Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa (định lượng và định tính) của các chủng vi nấm phân lập được từ các mẫu đất và nước ở một số địa điểm tại miền Nam. Phương pháp: Mẫu sau khi thu thập được phân lập trên môi trường Potato Dextrose Agar hoặc Sabouraud Agar bổ sung Clororamphenicol. Định tính hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp bản mỏng DPPH, các chủng có hoạt tính chống oxy hóa tiếp tục tiến hành định lượng khả năng đánh bắt DPPH, kết hợp ion sắt II, và định lượng phenol tổng số. Kết quả: Từ 200 mẫu nước và đất ban đầu, phân lập được 48 chủng vi nấm, trong đó có 18 chủng có hoạt tính chống oxy hóa. Khả năng đánh bắt gốc tự do của các chủng trong khoảng 61,31-93,56%, khả năng tạo phức với ion sắt II, trong khoảng 51,56 % - 98,75%, lượng phenol tổng 16,71-124,18 (mg/ml). Kết luận: Thông qua việc định tính bằng phương pháp bản mỏng DPPH và một số phương pháp định lượng, nghiên cứu đã chứng minh vi nấm từ đất và nước có hoạt tính chống oxy hóa khá tốt. Cần có những hướng nghiên cứu nhằm tối ưu hóa các thông số lên men thu chất chống oxy hóa hoặc chiết chất chống oxy hóa ở các điều kiện thích hợp. Từ khóa: chống oxy hóa, vi nấm, bản mỏng DPPH, ion sắt II, phenol tổng. ABSTRACT ISOLATING AND SURVEYING ANTIOXIDANT ACTIVITY IN SOME FUNGAL STRAINS Vu Thanh Thao, Nguyen Minh Thai, Doan Duy Thanh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 256 - 260 Background: Reactive oxygen species are reported to be involved in asthma, inflammation, arthritis, neurodegeneration Parkinson disease, vascular cardiac diseases, and diabetes. Antioxidants act as radical- scavengers, inhibit lipid peroxidation and other free radical-mediated processes; therefore, they are able to protect the human from several diseases attributed to the reactions of radicals. Recently, fungi have emerged as the new sources of antioxidants in the form of their secondary metabolites. Objectives: Screening antioxidant acitivity (qualitative and quantitative) of fungi isolated from soil and water samples that collected from different regions in Southern of Vietnam. Methods: Soil and water samples were taken, and spread on Potato Dextrose Agar or Sabouraud Clororamphenicol Agar plate. Screening antioxidant with dot blot DPPH assay, potentially antioxidant strains were done further test for their DPPH, fe rrous ion scavenging activity and total phenolic content. * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS Nguyễn Minh Thái ĐT: 0986200594 Email: minhthai2511@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 257 Results: From initial 200 samples, 48 strains had been were isolated, among them 18 strains have antioxidant potential. These organisms show a good scavenging effecting on DPPH radicals (61,31-93,56 %), chelating activity with ferrous ion is 51,56 % - 98,75%, total phenolic concentration is 16,71-124,18 (mg/ml). Conclusions: By using DPPH dot blot and some method for screening and assaying antioxidant activity, this study demonstrated that fungi isolated from soil and water possess good antioxidant activity. We intend to optimize physio-chemical parameters in ferment process and extract antioxidant substances with suitable solvent to apply for medicine and industry. Keywords: antioxidant, fungi, DPPH dot blot, ferrous ion, total phenolic. ĐẶT VẤN ĐỀ Các gốc tự do liên quan nhiều bệnh khác nhau ở người như xơ cứng động mạch, ung thư, đái tháo đường, tổn thương gan, viêm da, bệnh mạch vành, viêm khớp(9). Chất chống oxy hóa là yếu tố phòng thủ chống lại các gốc tự do trong cơ thể. Các chất chống oxy hóa tổng hợp như butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT) và tert butylhydroquinone-(TBHQ) thường được sử dụng làm phụ gia thực phẩm của ngành công nghiệp thực phẩm để ngăn chặn sự peroxy lipid. Tuy nhiên, ứng dụng này bị hạn chế do thành phần có thể độc hại và chất gây ung thư được hình thành trong quá trình biến đổi, vì vậy cần tìm kiếm nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên, an toàn, hiệu quả kinh tế(7). Một số thực vật và nấm bậc cao thường được biết đến như nguồn sản xuất chất chống oxy hóa, trong khi đó các nghiên cứu trên đối tượng nấm bậc thấp còn rất ít(5). Các loại nấm mốc Penicillium roquefortii, Aspergillus candidus, Mortierella, Acremonium, Colletotrichum gloeosporioides(4), Antrodia camphorata(11)Chaetomium sp., Cladosporium sp., Torula sp., Phoma sp.(5) đã được chứng minh có hoạt tính chống oxy hóa. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm trong môi trường đất và nước có khả năng sinh chất chống oxy hóa, lựa chọn ra các chủng có hoạt tính cao nhằm mở ra những nghiên cứu sâu hơn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Đối tượng nghiên cứu: 200 mẫu đất và nước thu thập từ các tỉnh phía nam. Chủng đối chứng: Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 4F có khả năng sinh acid kojic-một chất chống oxy hóa do phòng thí nghiệm vi sinh công nghệ Dược cung cấp. Hóa chất và môi trường: Môi trường Sabouraud chứa Chloramphenicol (SDA), Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar). Hóa chất: NaCl 0,85 %, chloramphenicol, DPPH (di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium), ferrozin, FeCl2, thuốc thử Folin-Ciocalteau, Na2CO3 của Merk, chất chuẩn: BHT (butylated hydroxytoluene), Vitamin C, acid gallic của Sigma. Các thử nghiệm được lặp lại 3 lần, các phương pháp định lượng đều được xây dựng đường chuẩn. Lấy mẫu và phân lập Tiến hành lấy mẫu đất, nước, cát, bùn ở các khu vực giàu ánh sáng, nhiệt độ cao. Mẫu ban đầu được đựng trong ống Falcon 50 ml, các mẫu đất, cát, bùn chiếm khoảng ¼ thể tích ống, mẫu nước chiếm đến vạch 30-40 ml. Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong suốt quá trình thử nghiệm. Pha loãng mẫu với dung dịch NaCl 0,85%, độ pha loãng từ cấp số 1 đến 5, trải 100 µl mẫu ở 3 độ pha loãng cuối lên môi trường SDA và PDA. Ủ ở 30oC từ 2 đến 3 ngày đối với SDA và 5 đến 10 ngày đối với PDA. Sau thời gian ủ, tiến hành quan sát các khóm vi nấm về hình dạng, màu sắc ở mặt trên và mặt dưới. Tách lấy các khóm vi nấm này tiếp tục làm thuần trên môi trường SDA (đối với nấm men) và PDA (đối với nấm mốc). Chuẩn bị dịch lọc vi nấm Cấy huyền dịch (106 bàotử/ml) với tỉ lệ 5% Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 258 (tt/tt) vào 30 ml môi trường PDA, ủ ở 30oC trong 7 ngày. Ly tâm dịch nuôi cấy ở 10000 g ở 4oC trong10 phút, thu dịch nổi, lọc dịch nổi với giấy lọc Whatman để loại bỏ hoàn toàn sợi nấm và bào tử. Dịch lọc thu được là mẫu thử cho thử nghiệm định tính và định lượng tiếp theo. Định tính hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp bản mỏng DPPH Theo đó, mẫu thử (khoảng 10 µL) được chấm lên bản mỏng silicagel 60 F254, để khô tự nhiên, nhuộm bản mỏng với dung dịch DPPH 0,4 M bằng cách lật ngược bản mỏng và giữ trong 10 giây, đọc kết quả nhuộm sau 1 phút(4, 6). Chứng âm: nước cất hoặc môi trường PDA không có vi nấm, chứng dương: dung dịch vitamin C 0,1% và dịch nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae 4F có chứa acid kojic. Mẫu có hoạt tính chống oxy hóa (dương tính) khi xuất hiện vòng trắng trên nền tím, ngược lại mẫu không có hoạt tính chống oxy hóa (âm tính) khi không xuất hiện vòng trắng, giống với mẫu nước cất và môi trường không có vi nấm. Định lượng hoạt tính chống oxy hóa Trong báo cáo này chúng tôi sử dụng 3 phương pháp khác nhau để định lượng hoạt tính chống oxy hóa. Phương pháp xác định khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH của Zhao và cộng sự(12). Theo đó, hỗn hợp phản ứng bao gồm 1 ml dung dịch DPPH 0,1 mM/ethanol 96% và 0,5 ml mẫu thử, ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đo độ hấp thu ở bước sóng 517 nm. Dung dịch BHT 0,5 M làm chất đối chiếu, phải đánh bắt được 100% gốc tự do. Khả năng đáng bắt gốc tự do (%) được tính theo công thức: 1 2 0 % 1 100 A A S A  − = − ×    Với A1 : giá trị OD của dịch nuôi cấy sau khi phản ứng với DPPH A2 giá trị OD của phản ứng khi không có DPPH A0 giá trị OD của phản ứng khi không có dịch nuôi cấy Phương pháp xác định khả năng kết hợp ion Fe2+ dựa trên sự giảm màu của phức Fe2- ferrozin ở bước sóng 562 nm của Zhao và cộng sự (12). Hỗn hợp phản ứng bao gồm mẫu thử, dung dịch FeCl2 và thuốc thử ferrozin, phản ứng được thực hiện trong 40 phút ở nhiệt độ phòng. Mẫu đối chiếu BHT 0,5M thực hiện trong cùng điều kiện phải đạt khả năng kết hợp 100%. Tính toán khả năng kếp hợp dựa theo công thức: 1 2 0 % 1 100 A A S A  − = − ×    A0 là chứng dương với môi trường chưa nuôi cấy A1 là mẫu thử nghiệm với dịch nuôi cấy A2 là mẫu thử nghiệm nhưng không mặt của FeCl2 Phương pháp xác định phenol tổng số: Mẫu thử kết hợp với thuốc thử Folin- Ciocalteau, kiềm hóa hỗn hợp này bằng dung dịch Na2CO3 20%, phản ứng thực hiện ở 40oC trong 30 phút. Hỗn hợp sau phản ứng được đo độ hấp thu ở bước sóng 562 nm. Xây dựng đường chuẩn với acid gallic ở các nồng đồ 0, 10, 20, 30, 40,50,60, 70, 80 (µg/ml). Kết quả tính toán dựa theo đường chuẩn (10). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Phân lập Từ các mẫu đất nước đất thu được ở các vùng, chúng tôi thu được 48 chủng nấm mốc, không thu được chủng nấm men nào trong quá trình phân lập. Định tính hoạt tính chống oxy hóa Sử dụng phương pháp bản mỏng DPPH, đã sàng lọc được 18 trong 48 chủng có hoạt tính chống oxy hóa, kết quả được trình bày ở hình 1 và bảng 1: Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 259 7 1 2 3 4 5 6 14 8 9 10 11 12 13 21 15 16 17 18 19 20 vitC 22 23 24 H2O Mt- Mt+ 39 40 41 42 43 44 45 32 33 34 35 36 37 38 25 26 27 28 29 30 31 Mt- H2O 46 47 48 Mt+ VitC Hình 1: Kết quả định tính hoạt tính chống oxy hóa trên bản mỏng DPPH Mẫu thử: 1 – 48. Chứng âm H2O, Mt- (môi trường chưa nuôi cấy). Chứng dương Mt+ (dịch nuôi cấy có aicd kojic), Vit C (dung dịch vitamin C 0,1%). Bảng 1: Tổng hợp kết quả định tính hoạt tính chống oxy hóa STT Kí hiệu Hoạt tính chống oxy hóa STT Kí hiệu Hoạt tính chống oxy hóa 1 NT5 - 25 DQ31.2 + 2 DQ23.2 - 26 DT17 ++ 3 DQ28.1 - 27 DT18 - 4 BH9.2 ++ 28 DQ25.2 + 5 BD6 +++ 29 DQ31.3 - 6 DT27.1 ++ 30 DQ31.4 +++ 7 DT26.2 + 31 DQ26.6 + 8 DQ38 - 32 DQ11 + 9 DQ39.1 - 33 DQ24.1 - 10 DT26.1 + 34 DQ26.3 - 11 NT1 - 35 PrBD - 12 BH9.5 + 36 DQ39.1 - 13 NHS + 37 DQ22.1 + 14 DT26.1 - 38 DQ19.2 - 15 GL6.1 - 39 DQ21.1 - 16 NT10 - 40 DQ39.2 - 17 BH9.4 - 41 DQ26.5 - 18 DT27.2 + 42 DQ22.2 - 19 DT27.3 + 43 DQ25.1 - 20 GL6.3 - 44 TD6 - 21 BH14.1 ++ 45 DQ22.3 - 22 NT2 - 46 DQ21.2 - 23 BH12 - 47 DQ26.2 - 24 GL6.2 - 48 DQ22.4 + (+): có hoạt tính chống oxi hoá; (-): không có hoạt tính chống oxi hoá; (++), (+++): hoạt tính chống oxi hoá mạnh và rất mạnh so với độ sáng của vết vitamin C Kết quả định lượng hoạt tính chống oxy hóa Kết quả đánh bắt gốc tự do DPPH của các chủng vi nấm thu được trong khoảng 61,31-93,56 %, khả năng kết hợp với ion Fe2+ trong khoảng 51,56 % - 98,75%, các kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Arora và cộng sự. Kết quả phenol tổng số của các chủng vi nấm trong khoảng 16,71-124,18 (mg/ml) tính theo acid gallic, đa số các chủng có lượng phenol tổng số thấp hơn nghiên cứu của Arora và cộng sự (3). Bảng 2: Kết quả định lượng hoạt tính chống oxy hóa theo các phương pháp Ký hiệu Khả năng đánh bắt DPPH (%) Khả năng kết hợp ion Fe2+ (%) Lượng phenol tổng số (mg/ml) BH9.2 80,91 96,65 108,14 BD6 91,75 97,20 113,59 DT27.1 79,80 96,30 103,41 DT26.2 76,5 93,75 92,16 DT26.1 70,57 86,61 44,89 BH9.5 76,68 93,80 95,00 NHS 73,75 91,90 77,27 DT27.2 74,94 92,29 82,26 DT27.3 61,31 51,56 10,73 BH14.1 67,19 76,66 34,97 DQ31.2 75,88 92,85 88,89 DT17 92,50 97,76 118,58 DQ25.2 65,56 68,75 13,95 DQ31.4 93,56 98,66 124,18 DQ26.6 70,94 90,00 55,66 DQ11 71,69 91,19 58,35 DQ22.1 69,94 82,28 37,33 DQ22.4 66,12 75,71 16,71 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 260 BÀN LUẬN Hiện nay, để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất tự nhiên, các tác giả sử dụng nhiều thử nghiệm khác nhau dựa trên cơ chế nội sinh của các chất này trong cơ thể, vẫn chưa có một thử nghiệm tiện lợi, nhanh chóng, chính xác để đánh giá hoạt tính này. Nhiều tác giả cho rằng các hợp chất polyphenol ở thực vật và vi nấm trong đất và nước chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính chống oxy hóa(8). Hệ thống liên hợp trong nhân phenol có tác dụng vận chuyển điện tử hoặc nguyên tử hydro làm trung hòa các gốc tự do. Nguyên tử hydro linh động trong nhóm OH đóng vai trò là tác nhân khử làm ngăn cản quá trình oxy hóa các hợp chất lipid, ngăn cản sự sản sinh các gốc tự do từ quá trình này(1). Hơn nữa, các polyphenol có khả ăng tạo phức với ion Fe 2+, đây là ion kích thích quá trình oxy hóa các hợp chất lipid và tăng cường tích lũy các gốc tự do từ quá tình này(3). Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng 2 phương pháp phổ biến đánh giá dựa trên 2 cơ chế: đánh bắt gốc tự do và khả năng tạo phức với ion kim loại khử. Nhằm khảo sát mối liên hệ và mối liên hệ giữa các cơ chế với lượng phenol tổng cộng, chúng tôi sử dụng dữ liệu định lượng của 18 chủng vi nấm để tính toán hệ số tương quan R2 với phần mềm Excel 2003. Khả năng đánh bắt gốc tự và tạo phức với ion Fe2+ có hệ số tương quan 0,592 (<0,800) cho thấy 2 cơ chế này không tương quan với nhau. Khi xem xét mối liên hệ giữa lượng phenol tổng cộng và khả năng đánh bắt gốc tự do thu được hệ số tương quan 0,8464, như vậy các hợp chất polyphenol trong dịch nuôi cấy thu được đóng góp đáng kể vào khả năng đánh bắt gốc tự do. Lượng phenol tổng cộng và khả năng tạo phức với ion Fe2+ có hệ số tương quan 0,7757 cho thấy mối liên hệ giữa 2 yếu tố này khá thấp. Các hệ số tương quan thấp hơn so với nghiên cứu của Arora và cộng sự(4) có thể do lượng phenol tổng số trong mẫu thấp hơn. KẾT LUẬN Từ các mẫu đất và nước thu thập được, chúng tôi phân lập được 48 chủng nấm mốc. Sử dụng phương pháp bản mỏng DPPH chúng tôi đã sàng lọc được 18 chủng có hoạt tính chống oxy hóa. Khi định lượng hoạt tính chống oxy hóa của các chủng này, nhận thấy khả năng đánh bắt gốc tự do, kết hợp ion sắt đều rất cao so với nghiên cứu tương tự của Arorra và cộng sự. Cần có những nghiên cứu tiếp theo nhằm tách chiết, tinh chế và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy trên các chủng vi nấm tiềm năng này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Amarowicz R, Pegg R B, et al. (2004). Free-radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies. Food Chemistry. 84(4): 551-562. 2. Antolovich M, Prenzler P D, et al. (2002). Methods for testing antioxidant activity. Analyst. 127(1): 183-98. 3. Arora D S, Priyanka Chandra (2010). Assay of antioxidant potential of two Aspergillus isolates by different methods under various physio-chemical conditions. Braz. J. Microbiol. 41. 4. Femenía-Ríos M, García-Pajón C M, et al. (2006). Synthesis and free radical scavenging activity of a novel metabolite from the fungus Colletotrichum gloeosporioides. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 16(22): 5836-5839. 5. Huang W Y, Cai Y Z, et al. (2007). Endophytic fungi from Nerium oleander L (Apocynaceae): main constituents and antioxidant activity. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 23(9): 1253-1263. 6. Huang D J., Chen H J., et al. (2006). Sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam ‘Tainong 57’) storage root mucilage with antioxidant activities in vitro. Food Chemistry. 98(4): 774-781. 7. Mathew S, Abraham T E (2006). Studies on the antioxidant activities of cinnamon (Cinnamomum verum) bark extracts, through various in vitro models. Food Chemistry. 94(4): 520- 528. 8. Mokbel M S, Hashinaga F (2006). Evaluation of the antioxidant activity of extracts from buntan (Citrus grandis Osbeck) fruit tissues. Food Chemistry. 94(4): 529-534. 9. Moon B S, Ryoo I J, et al. Glyscavins A, B and C, New Phenolic Glycoside Antioxidants Produced by a Fungus Mycelia sterilia F020054. J Antibiot. 59(11): 735-739. 10. Singleton V L, Orthofer R, et al. (1999). (14) Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of folin-ciocalteu reagent. In P. Lester (eds). Methods in Enzymology, Vol. Volume 299, pp 152-178. Academic Press. 11. Song T Y, Yen G C (2002). Antioxidant Properties of Antrodia camphorata in Submerged Culture. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50(11): 3322-3327. 12. Zhao G R, Xiang Z J, et al. (2006). Antioxidant activities of Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng. Food Chemistry 99(4): 767-774. Ngày nhận bài báo: 11.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 19.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014