Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng vi sinh vật có trong cao chiết thân rễ và rễ ngải bún (boesenbergia pandurata (roxb.) schltr zingiberaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 469 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HOẠT CHẤT KHÁNG VI SINH VẬT CÓ TRONG CAO CHIẾT THÂN RỄ VÀ RỄ NGẢI BÚN (BOESENBERGIA PANDURATA (ROXB.) SCHLTR ZINGIBERACEAE) Phạm Bền Chí*, Nguyễn Đinh Nga* TÓM TẮT Mở đầu: Boesenbergia pandurata Zingiberaceae là một trong những dược liệu của Việt Nam và được biết đến với tên Ngải bún. Thân rễ và rễ Ngải bún được sử dụng trong dân gian để hỗ trợ điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và nhiễm nấm. Mục tiêu: Phân lập, tinh khiết hóa và xác định cấu trúc hóa học của chất có hoạt tính kháng vi sinh vật từ cao toàn phần thân rễ và rễ Ngải bún. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Thân rễ và rễ Ngải bún thu mua tại thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016. Cao thân rễ và rễ Ngải bún (Cao NB): Bột thân rễ và rễ Ngải bún được ngâm lạnh với cồn 96% trong 24 giờ. Sau khi bốc hơi dung môi, cao cồn được lắc phân bố tỉ lệ 1:1 với lần lượt với các dung môi n – hexan, dichloromethan, ethylacetat để thu được các cao phân đoạn (PĐ). Hoạt tính kháng vi sinh vật của cao toàn phần và cao phân đoạn được thực hiện theo phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy và pha loãng trong môi trường rắn. Sử dụng sắc ký cột cổ điển với sự hỗ trợ của sắc ký lớp mỏng, kỹ thuật hiện hình sinh học để phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật từ cao NB. Kiểm tra độ tinh khiết bằng UPLC và xác định cấu trúc hóa học của hoạt chất kháng vi sinh vật trong cao NB bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Kết quả và bàn luận: Cao NB và các cao phân đoạn cho hoạt tính kháng mạnh trên 3 chủng nấm da Microsporum gypseum, Trichophyton rubrum và Trichophyton mentagrophytes (MIC từ 90 – 120 µg/ml); kháng vừa trên S. aureus và MRSA (MIC từ 1100 – 1500 µg/ml). Đã phân lập và xác định được hoạt chất kháng vi sinh vật có trong cao NB là pinocembrin. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Từ khóa: Thân rễ và rễ Ngải bún, kháng khuẩn, kháng nấm, pinocembrin ABSTRACT ISOLATING AND DETERMINING CHEMICAL STRUCTURE OF ANTI MICROORGANISM SUBSTANCE FROM EXTRACT OF NGAI BUN RHIZOME AND ROOTS (BOESENBERGIA PANDURATA (ROXB.) SCHLTR ZINGIBERACEAE) Pham Ben Chi, Nguyen Dinh Nga * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 469 - 474 Background – Objectives: B. pandurata is one of the herbals in Viet Nam and is known as “Ngai bun”. Its rhizome and roots have been traditionally used in treatment infections. The aim of the study to isolating, purifying and determining the chemical structure of antimicroorganism agent from the its extract. Material and methods: The rhizome and roots of B. pandurata was collected in Tra Cu town, Tra Vinh province in 10/2016. Its powder was extracted with 96% EtOH for 24 hours. This extract was partitioned with n – hexane, DCM and EtOAc. The antimicroorganism activity of these extracts were evaluated by applying disk *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908836969 Email: nganguyendinh@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 470 diffusion and agar dilution methods. The antimicroorganism agent was isolated, purified by column chromatography in support with layer chromatography (TLC) and autobiography method. Its purify was tested by UPLC method. Its chemical structure was determined by NMR spectrum. Results: The EtOH, DCM and EtOAc extracts strongly effect against T. mentagrophytes, T. rubrum and M. gypseum with MIC values from 90 – 120 µg/ml, and have medium active on S. aureus and MRSA with MIC values from 1100 – 1500 µg/ml. The antimicroorganism agent was determined as pinocembrine. Conclusion: The results demonstrated the strong potential of the extracts of B. pandurata for pharmaceutical development. Keyword: Boesenbergia pandurata, rhizome and roots, antimicrobial, antifungal, pinocembrine ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm khuẫn, nhiễm nấm ảnh hưởng nhiều đến chất lượng cuộc sống của con người. Các nhà khoa học trên thế giới liên tục tìm kiếm các hợp chất mới từ các nguyên liệu có nguồn gốc tổng hợp và tự nhiên để bổ sung nguồn hợp chất kháng vi sinh vật và đối phó với hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật. Với điều kiện khoa học kỹ thuật còn hạn chế, việc phát triển nguồn nguyên liệu hóa dược tại Việt Nam gặp nhiều thách thức. Bên cạnh đó Việt Nam có nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú với nhiều dược liệu có tiềm năng nhưng vẫn chưa được khai thác nhiều. Từ lâu, một dược liệu thuộc họ Gừng – Ngải bún (Boesenbergia pandurata Zingiberaceae) đã được dân gian sử dụng để làm gia vị và chữa một số bệnh như chốc lở, kháng viêm, đầy bụng, giun sán, ung thư < nhưng chưa được chứng minh bằng những bằng chứng khoa học tại Việt Nam(2). Chính vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là chứng minh hoạt tính kháng vi sinh vật của thân rễ và rễ Ngải bún. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Thân rễ và rễ Ngải bún được thu mua tại thị trấn Trà Cú, tỉnh Trà Vinh vào tháng 10/2016; được định danh bằng cách khảo sát các đặc điểm hình thái, giải phẫu thực vật và so sánh với tài liệu tham khảo(8). Vi khuẩn thử nghiệm: Staphylococus aureus ATCC 29213, MRSA ATCC 43300, E. Coli ATCC 25922, Pseudomonas aegrunosa ATCC 27853. Vi nấm thử nghiệm: Trichophyton mentagrophytes, T. rubrum, Microsporum gypseum, Malassezia furfur ATCC 44344, Candida albicans ATCC 10231. Phƣơng pháp nghiên cứu Chiết xuất: Bột thân rễ và rễ Ngải bún được chiết bằng phương pháp ngâm lạnh với ethanol 96% (EtOH) 3 lần với tỷ lệ dược liệu: dung môi (1:10, 1:7,5 và 1:5) trong 24 giờ. Dịch chiết ethanol được bay hơi dung môi đến còn khoảng 1/10 thể tích ban đầu (cao NB). Sau đó lắc phân bố dịch chiết này với n – hexan, dichloromethan (DCM), ethylacetat (EtOAc) với tỷ lệ 1:1, bốc hơi dung môi để thu được các cao phân đoạn. Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật có trong cao NB Kỹ thuật hiện hình sinh học với sự kết hợp sắc ký lớp mỏng và xác định tác động kháng vi sinh vật của các hợp chất được phân tách trên bảng mỏng sắc ký. Điều kiện thực hiện: Cao NB được hòa tan trong CHCl3 chấm lên bản mỏng silicagel F254 (Merck); khai triển với pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1); phát hiện vết bằng cách soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm; vi sinh vật thử nghiệm: M. gypseum và S. aureus.(3) Cao NB được sử dụng để phân lập các hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng sắc ký cột cổ điển với các điều kiện sắc ký: Cột 50 cm x 2 cm; pha tĩnh: 70 g silica gel cỡ 37 – 63 µm; pha động: CHCl3 – EtOAc (9:1) (Cột 1), n- hexan – EtOAc (5:2) (Cột 2); thể tích mỗi phân đoạn 5 ml, lượng mẫu nạp 2 g. Gộp các phân đoạn có vết tương tự trên sắc ký lớp mỏng, khảo sát tác động kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật hiện hình sinh học. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 471 Chất phân lập được xác định độ tinh khiết bằng UPLC với các điều kiện: máy UPLC của hãng Water; cột C18 Sunfire 4,6 x 150 mm, kích thước hạt pha tĩnh 5 µm; pha động: nước – acetonitril; chương trình chạy gradient (nước từ 90% đến 10%); thể tích tiêm mẫu 5 µl; tốc độ dòng 0,8 ml/phút; đầu dò PDA phát hiện tại bước sóng 288,7 nm; thời gian chạy 55 phút. Xác định cấu trúc của hoạt chất kháng vi sinh vật trong cao NB bằng phổ NMR. Tác động kháng vi sinh vật của cao NB và các cao phân đoạn Ngải bún được xác định bằng phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy và phương pháp pha loãng trong môi trường rắn theo hướng dẫn của CLSI M38 – A2. Môi trường sử dụng TSA cho vi khuẩn, SDA cho nấm da và C. albicans, m – Dixon cho M. furfur.(7) KẾT QUẢ Chiết xuất Từ 500 g bột Ngải bún khô (thu được từ 5 kg thân rễ và rễ Ngải bún tươi), sau khi ngâm lạnh với EtOH 96% thu được 66,64 g cao toàn phần NB. Từ 50 g cao toàn phần, sau khi lắc phân bố với các dung môi thu được các cao n – hexan (17,25 g), DCM (23,75 g), EtOAc (2,13 g) và cao nước còn lại (2,13 g). Hoạt tính kháng vi sinh vật các cao toàn phần và cao phân đoạn từ ngải bún. Bảng 1: Đường kính vòng ức chế vi sinh vật của cao NB và các cao PĐ (mm) Cao Lượng cao trên 1 đĩa giấy (mg) Vi khuẩn Vi nấm Sa MRSA Pa Ec Tm Tr Mg Ca Mf TP 0,82 11,33 10.50 - - 17,50 19,17 17,33 - - NH 0,95 - - - - - - - - - DCM 0,80 10,67 10,17 - - 18,33 20,17 19,12 - - EtOAc 0,94 10,83 10,33 - - 19,17 20,00 19,33 - - Nƣớc 0,85 - - - - - - - - - Chứng âm - - - - - - - - - Chú thích: Sa: S. aureus, Pa: P. aegrunosa, Ec: E. coli, Tm: T. mentagrophytes, Tr: T. rubrum, Mg: M. gypseum, Ca: C. albicans, NH: n – hexan, DCM: Dicloromethan, “ – “: không xác định được, EtOAc: Ethylacetat, Mf: Malassezia furfur. Nhận xét: Kết quả ở bảng 1 cho thấy, cao toàn phần và các cao phân đoạn DCM, EtOAc cho phổ kháng khuẩn và kháng nấm tương tự nhau. Cả 3 loại cao này đều cho tác động trên T. mentagrophytes, T. rubrum, M. gypseum, S. aureus và MRSA; không có tác động kháng E. coli, P. aeruginosa, C. albicans và M. furfur. Bảng 2: Kết quả MIC của cao toàn phần và cao phân đoạn trên các vi sinh vật thử nghiệm (µg/ml) Cao Vi khuẩn Vi nấm S. aureus MRSA T. mentagrophytes T. rubrum M. gypseum TP 1223,25 1223,25 101,94 101,94 101,94 DCM 1196,55 1196,55 99,71 99,71 99,71 EtOAc 1410,45 1410,45 117,54 117,54 117,54 Nhận xét: Từ giá trị MIC ở bảng 2 cho thấy cao DCM và cao toàn phần có hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm tương đương nhau và cao hơn so với cao EtOAc. Giá trị MIC của cao toàn phần trên S. aureus thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của Ekkarin Pattaratanawadee và cộng sự (3000 µg/ml)(5). Kết quả này tương đương với nghiên cứu của Souwalak Phongpaichit và cộng sự sử dụng dịch chiết thân rễ và rễ Ngải bún với các dung môi EtOH 96%, CHCl3 và methanol trên chủng M. gypseum có giá trị MIC từ 64 – 128 µg/ml(6). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 472 Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật trong cao NB Xác định vết có hoạt tính kháng vi sinh vật bằng kỹ thuật hiện hình sinh học Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng cao NB cho 18 vết ở UV365, trong đó: Vết số 8 với Rf = 0,58; cho phát quang màu vàng cam cho vòng ức chế M. gypseum. Vết 9 với Rf = 0,52; phát quang màu cam cho vòng ức chế M. gypseum và S. aureus. Vết 10 với Rf = 0,48; phát quang (không xác định được màu) cho vòng ức chế S. aureus. Từ kết quả tự sinh đồ (hình 1), chúng tôi chọn vết 9 làm mục tiêu phân lập. S. aureus M. gypseum Hình 1: Kết quả kỹ thuật hiện hình sinh học phát hiện vết có hoạt tính kháng vi sinh vật. Phân lập hoạt chất kháng vi sinh vật bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển Cao NB sau khi được triển khai qua cột 1 thu được 70 PĐ, gộp các PĐ có chứa mục tiêu phân lập thành 2 phân đoạn lớn: PĐ – A (42 – 49) và PĐ – B (50 – 57). Phân đoạn B tinh khiết hơn, chỉ có 2 vết. Sau khi triển khai sắc ký cột cổ điển PĐ – B (Cột 2), thu được 40 PĐ. Từ kết quả SKLM, tiến hành gộp các PĐ có chứa mục tiêu, để bay hơi dung môi tự nhiên, thu được các cắn màu trắng lẫn vàng: PĐ – B1 (13 -15) 20mg, PĐ – B2(16 -18) 5mg, PĐ – B3 (19 – 20) 19,1 mg, PĐ – B4 (21 – 25) 23,9 mg. Tiến hành rửa phân đoạn B1 bằng n- hexan và EtOAc để tách riêng phần bột màu trắng ngà, thu được chất NB1 (3,6 mg). Kiểm tra độ tinh khiết của chất NB1 bằng UPLC Kết quả ở hình 3 cho thấy sắc ký đồ của chất NB1 chỉ cho một đỉnh duy nhất tại 27,324 phút, có độ tinh khiết lớn hơn 95%, đủ điều kiện để tiến hành xác định cấu trúc bằng phổ NMR. Hình 2: Sắc ký đồ kiểm tra độ tinh khiết chất NB1 bằng UPLC Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 473 Xác định cấu trúc hợp chất NB1 NB1 tủa trong MeOH ở dạng bột vô định hình, màu trắng ngà, dễ tan trong CHCl3, EtOAc, MeOH, kém tan trong n – hexan. Trên bản silica gel 60 F254 cho vết tắt quang màu xanh nhạt dưới UV254, màu hồng đậm với thuốc thử VS. Đồng thời NB1 cho kết quả dương tính với phản ứng cyanidin. Có thể sơ bộ kết luận NB1 là flavonoid. Phổ 13C – NMR của NB1 cho thấy sự hiện diện của 12 tín hiệu carbon, nhưng có 2 tín hiệu cao bất thường tại 128,89 ppm và 126,15 ppm. Vậy, cấu trúc của NB1 có đối xứng. Thêm vào đó, khi đ{nh giá phổ DEPT cường độ tín hiệu của carbon tại 128,89 ppm cao hơn so với tín hiệu tại 126,15 ppm, do đó tại vị trí 128,89 ppm là tổ hợp của 3 tín hiệu carbon có độ dời hóa học như nhau. Từ những lý luận trên, cấu trúc của NB1 có 15 carbon, trong đó có: 1 nhóm CH2 (δC 43,36 ppm). 8 nhóm CH (δC 128,89; 126,15; 96,81; 95,53; 79,22 ppm). 6 carbon bậc 4, trong đó: 5 nhóm CIV sp3 (δC 164,93; 164,39; 163,17; 138,38; 103,16 ppm) và 1 nhóm >C=O (δC 195,71 ppm). Các dữ liệu phổ NMR của NB1 gần như hoàn toàn phù hợp với pinocembrin và điều này được khẳng định qua dữ liệu phổ HSQC, HMBC, COSY(1,4). Dưới đ}y là dữ liệu phổ NMR của NB1 được so sánh với pinocembrin trình bày ở bảng 3. Bảng 3: So sánh dữ liệu phổ 13C – NMR (125 MHz) và 1H – NMR (500 MHz) của NB1 và pinocembrin C DEPT NB1 (CDCl3) Pinocembrin (DMSO – d6) δC δH (J, Hz) HMBC (H Cn) COSY δC (1) δH (J, Hz) (4) 2 CH 79,22 5,42dd (13,3) C – 2’, 6’ H – 3 78,4 5,58 dd (13,3) 3 CH2 43,36 3,08 dd (17,13) 2,82 dd (17,3) C – 2, 1’, 4 H– 2 42,2 3,23 dd (17,13) 2,72 dd (17,3) 4 >C=O 195,71 - - - 195,8 - 5 =CH– 164,39 - - - 163,6 - 6 =CH– 96,81 6,01 d(2,0) C– 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 - 96,1 5,93 d (2,0) 7 =C< 164,93 - - - 166,6 - 8 =CH– 95,53 6,00 d(2,0) C – 6, 10, 8 95,1 5,90 d (2,0) 9 =C< 163,17 - - - 162,7 - 10 =C< 103,16 - - - 101,9 - 1’ =C< 138,38 - - - 138,0 - 2’,6’ =CH< 126,15 7,42 m C – 1’, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ - 126,5 7,41 – 7,55 m 3’, 4’,5’ =CH< 128,89 7,42 m C – 1’, 2’, 3’, 4’, 5’, 6’ - 128,5 - Dưới đ}y là công thức khai triển của pinocembrin (5,7 – dihydroxyflavanon) Hình 3: Công thức khai triển của pinocembrin Bằng kỹ thuật tự sinh đồ, chất NB1 có hoạt tính kháng các vi sinh vật thử nghiệm (hình 4). T. mentagrophytes S.aureus Hình 4: Kết quả tự sinh đồ chất NB1 trên T. mentagrophytes và S. aureus. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 474 KẾT LUẬN Các cao ethanol, các cao phân đoạn n-hexan, dichloromethan và ethylacetat chiết từ thân rễ và rễ Ngải bún cho tác động kháng S. aureus, MRSA với MIC trong khoảng 1100 – 1500 µg/ml; T. mentagrophes, T. rubrum và M. gypseum với MIC trong khoảng 90 – 120 µg/ml. Hợp chất cho tác động kháng khuẩn và kháng nấm da đã được phân lập bằng sắc ký cột cổ điển và xác định cấu trúc hóa học bằng phổ NMR là pinocembrin. KẾT QUẢ Các kết quả trên là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo để ứng dụng thân rễ và rễ Ngải bún như nguồn nguyên liệu kháng vi sinh vật. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Agrawal P (2013). Carbon – 13 NMR of flavonoids. pp. 78 – 101, Elsevier, Amsterdam. 2. Chahyadi A, Rika H, and Komar RW (2014). Boesenbergia pandurata Roxb, an Indonesian medicinal plant: phytochemistry, biological activity, plant biotechnology. Procedia Chemistry. 13, pp.13-37. 3. Choma I (2011). Bioautography detection in thin – layer chromatography. Journal of Chromatography A. 1218, pp.2684 – 2691. 4. Liu Y (1992). Isolation of potential cancer chemopreventive agents from Eriodictyon californicum. Journal of natural products. 55, pp.357 – 363. 5. Pattaratanawadee E (2006). Antimicrobial activity of spice extracts against pathogenic and spoilage microorganisms. Kasetsart J Nat Sc. 40, pp. 159 – 165. 6. Phongpaichit S (2005). Antifungal activities of extracts from Thai medicinal plants against opportunistic fungal pathogens associated with AIDS patients. Mycoses. 48, pp. 333 – 338. 7. Wayne P (2008). CLSI Document M38 – A2. Clinical and Laboratory Standards Institute. 8. Wuzy (2000). Flora of China. pp. 367 – 368. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018