Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên : Trương Thị Hồng Nhung Hoàng Minh Nguyệt Lớp : CNSH – K52 Giáo viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Giang KS. Nguyễn Thị Bích Lưu Bộ môn SHPT & CNVS – Khoa Công nghệ sinh học * Đề tài: “Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường” * Ô nhiễm môi trường đã và đang là vấn đề cấp thiết và thu hút sự quan tâm của rất nhiều cá nhân, tổ chức cũng như nhiều quốc gia trên thế giới. Các công nghệ xử lý rác thải được sử dụng hiện nay đều vấp phải các vấn đề môi trường về lâu dài. Trong khi đó xử lý ô nhiễm môi trường bằng biện pháp sinh học, đặc biệt là việc sử dụng vi sinh vật trong xử lý rác thải đang là một công nghệ đem lại hiệu quả cao, ít tốn kém và bền vững. Các vi sinh vật được sử dụng chủ yếu là các vi khuẩn có khả năng phân hủy các chất hữu cơ, một nguồn rác thải chủ yếu ở Việt Nam. Với mục đích phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ở suối nước nóng để khởi đầu cho việc nghiên cứu sâu hơn quá trình phân giải các chất hữu cơ trong rác thải của vi sinh vật ưa nhiệt, chúng em tiến hành đề tài: “Phân lập và xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt ứng dụng trong xử lý môi trường” * Mục đích và yêu cầu: 1. Mục đích: Phân lập, tuyển chọn ra một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt có hoạt tính enzyme để ứng dụng trong xử lý môi trường. 2. Yêu cầu: Phân lập được các chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng. Xác định điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn ưa nhiệt: pH thích hợp. Nhiệt độ thích hợp. Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt phân lập được. * * 1. Đối tượng: Mẫu thu thập: Mẫu nước lấy từ một số suối nước nóng. * 2. Địa điểm: Địa điểm: Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Vi sinh – Khoa CNSH – ĐH Nông Nghiệp Hà Nội. 3. Thời gian nghiên cứu: Thời gian: Từ 3/2009 đến 3/2010. 2.1. Nội dung. Tìm kiếm, thu thập, phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn ưa nhiệt từ suối nước nóng. Nghiên cứu các điều kiện tối ưu để nuôi cấy vi khuẩn ưa nhiệt. Xác định các hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt. Xác định độ bền nhiệt của enzyme ngoại bào của vi khuẩn ưa nhiệt. 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu: Nước, bùn, đất ở lòng suối ở những điểm có nhiệt độ khác nhau > 400C. 2.2.2. Môi trường nuôi cấy: Môi trường LB – Agar 1. Pepton : 10g/L 2. NaCl : 5g/L 3. Cao nấm men : 5g/L 4. Agar : 18g/L pH = 7.0 * 2.2. Phương pháp nghiên cứu. 2.2.3. Phương pháp nhuộm Gram Bước 1: Cố định tiêu bản vi khuẩn bằng cách cố định trên ngọn lửa đèn cồn rồi nhuộm bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet), thường dùng dung dịch Gentian 1%, lên vết bôi trong khoảng một phút rồi rửa bằng nước cất. Bước 2: Nhuộm tiếp bằng dung dịch Iot ( dung dịch lugol) trong 1 phút rồi rửa vết bôi bằng nước cất. Bước 3: Phủ lên vết bôi dung dịch ethanol 95% : Acetone (1:1) trong khoảng 1 phút rồi rửa lại bằng nước sạch. Bước 4: Nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ ( safrnin hoặc fucsin Ziehl ) 30 – 60 giây rồi rửa lại bằng nước sạch và hong khô trong không khí. Để tiêu bản khô và tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu 100. Vi khuẩn bắt màu tím là vi khuẩn Gram (+) còn vi khuẩn bắt màu hồng là vi khuẩn Gram (-). 2.2.4. Phương pháp thử khả năng sinh Enzyme ngoại bào của vi khuẩn: Phương pháp đục lỗ trên thạch: môi trường gồm agar (18g/l) + nước cất + 1% cơ chất tương ứng với từng loại enzyme được hấp khử trùng, đổ vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội, dùng khuyên đục lỗ (đường kính 1cm). Nhỏ dịch nghiên cứu vào lỗ thạch. Ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 50oC thời gian 18h – 24h. Nhuộm màu bằng thuốc nhuộm tương ứng; sau đó đo đường kính vòng phân giải (D). Từ đó ta có kích thước vòng phân giải (D- d). Môi trường thử khả năng sinh enzyme protease: agar + cơ chất (0,1 % cazein) + nước cất, thuốc nhuộm lugol (5%). Môi trường thử khả năng sinh enzyme amylase: agar + cơ chất (0,1% tinh bột) + nước cất, thuốc nhuộm là dung dịch KI (0,1%). Môi trường thử khả năng sinh enzyme cellulase: agar + cơ chất (0,1% CMC) + nước cất, thuốc nhuộm lugol (5%). * 2.2.5. Phương pháp đo mật độ quang để xác định mật độ vi khuẩn: Phương pháp này dưa trên khả năng hấp thụ cực đại của các bước sóng đối với các phân tử có kích thước khác nhau trong dung dịch. Mỗi mức độ phân tử được hấp phụ ở một bước sóng khác nhau. Bước sóng hấp phụ cực đại đối với vi khuẩn là 620nm. * Thí nghiệm 1: Phân lập mẫu vi khuẩn thu thập tại một số suối nước nóng: Một số chỉ tiêu theo dõi chủng vi khuẩn phân lập được: Quan sát hình thái khuẩn lạc. Hình thái tế bào nhuộm Gram. Khả năng di động. Thí nghiệm 2: Thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng vi khuẩn ưa nhiệt phân lập được: - Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch. - Chỉ ra chủng vi khuẩn sinh enzyme ngoại bào sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. 2.2.6. Cách bố trí các thí nghiệm * Thí nghiệm 3 và 4: Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu cho các chủng vi khuẩn phân lập được: 1. Xác định pH nuôi cấy tối ưu: thí nghiệm được bố trí với 11 công thức: CT 1: pH = 5,0 CT 7: pH = 8,0 CT 2: pH = 5,5 CT 8: pH = 8,5 CT 3: pH = 6,0 CT 9: pH = 9,0 CT 4: pH = 6,5 CT 10: pH = 9,5 CT5: pH = 7,0 CT 11: pH = 10 CT6: pH = 7,5 2. Xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ưu: thí nghiệm được bố trí với 5 công thức: CT 1: pH tối ưu, nhiệt độ 400C CT 2: pH tối ưu, nhiệt độ 500C CT 3: pH tối ưu, nhiệt độ 600C CT 4: pH tối ưu, nhiệt độ 700C CT5: pH tối ưu, nhiệt độ 800C Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của enzyme ngoại bào thu được từ chủng vi khuẩn ưa nhiệt đã phân lập: Mỗi enzyme hoạt động ở một ngưỡng nhiệt độ và pH nhất định. Vì vậy xác định các điều kiện tối ưu cho hoạt tính của enzyme có ý nghĩa ứng dụng thực tiễn rất quan trọng. * * Bảng1: Đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập: * Bảng 1: Đặc điểm của các chủng vi khuẩn phân lập: * Hình 1a: Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng vi khuẩn ưa nhiệt N6 * * Trong đó: D: Đường kính vòng phân giải của enzyme (tính cả giếng) d: Đường kính của giếng đã đục lỗ (d = 1cm) * Bảng 2a: Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn đã phân lập sau 24h Hình 2: Vòng phân giải của 3 chủng N1, N6, N8 đã phân lập sau 24h Dịch nuôi vi khuẩn Vòng phân giải tinh bột chủng N7 (trái) và N8 (phải) Vòng phân giải CMC chủng N1 (trái) và N2 (phải) Vòng phân giải casein chủng N6 (trái) và N5 (phải) * Bảng 2b: Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn đã phân lập sau 36h * Bảng 2c: Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn đã phân lập sau 48h * Từ kết quả trên chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: Phân lập được 8 chủng vi khuẩn (N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 ) với những đặc điểm, hình thái khuẩn lạc và hình dạng sắp xếp tế bào đặc trưng. Cả 8 chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh enzyme ngoại bào amylase, protease và cellulase, trong đó khả năng sinh enzyme ngoại bào protease là lớn nhất và sinh amylase là nhỏ nhất. * *