Phát hiện đột biến gene Dystrophin bằng các phương pháp sinh học phân tử trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker

Phương pháp MLPA (Multiplex ligationdependent probe amplification) là phương pháp cho phép khuếch đại nhiều đoạn gene khác nhau với chỉ một cặp mồi duy nhất. Mỗi một đầu dò (probe) bao gồm 1 cặp mồi (primer), cặp mồi này sẽ bắt cặp từ hai đầu của vùng gene quan tâm, sau đó hai cặp mồi này sẽ được nối lại với nhau thành một trình tự đích hoàn chỉnh. Phương pháp MLPA là phương pháp cho phép sàng lọc sự mất đoạn và lặp đoạn của 79 exon được chia làm hai bộ P034-P035 (8). Với những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng điển hình nhưng không phát hiện đột biến trên 25 exon vùng hot spots, chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật MLPA để phân tích gene DMD, kết quả phát hiện thêm 06/61 (9,84%) bệnh nhân bị đột biến mất đoạn và và 09/61 (14,75%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn. Theo nghiên cứu của Prior và cộng sự thì tỷ lệ đột biến mất đoạn của gene Dystrophin là 70% (306 ca DMD và 55 ca BMD có đột biến mất đoạn) và đột biến chủ yếu tập trung ở vùng “hos pots” , chiếm tỷ lệ khoảng 80% (9). Yuge và cộng sự (10) đã nghiên cứu trên 138 bệnh nhân DMD với kết quả có 62% bệnh nhân bị mất đoạn, trong đó có 68% bệnh nhân mất đoạn ở vùng hospot. Nhờ sử dụng kết hợp các phương pháp MultiplexPCR và MLPA, Janssen và cộng sự đã phát hiện 53% tổng số bệnh nhân có đột biến mất đoạn và lặp đoạn (11). Nghiên cứu của Zimowski và cộng sự (12) phát hiện 134/180 bệnh nhân (73.9%) bệnh nhân có mất đoạn gene DMD bằng phương pháp MLPA. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết hợp giữa haiphương pháp Multiplex PCR và MLPA đã tăng tỷ lệ phát hiện đột biến từ 27.8% lên 30.5% và làm đa dạng khả năng phát hiện các loại đột biến như mất đoạn lớn, mất đoạn nhỏ, lặp đoạn Sự khác nhau về tỷ lệ mất đoạn của gene Dystrophin có thể phụ thuộc vào số lượng các exon được phân tích và số lượng mẫu nghiên cứu.

pdf9 trang | Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 5 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Phát hiện đột biến gene Dystrophin bằng các phương pháp sinh học phân tử trên bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne/Becker, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 62 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD)/ Loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là nhóm bệnh di truyền lặn liên kết giới tính do đột biến trên gene Dystrophin (DMD). DMD là một trong những bệnh thần kinh cơ phổ biến ở trẻ em với tỷ lệ mắc 1/3500 trẻ trai đẻ sống (1). Bệnh DMD có đặc trưng là thoái hoá và gây suy yếu cơ một cách tuần tiến dẫn đến tàn tật và tử vong do suy tim và bội nhiễm phổi. Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh được nhận biết ở giai đoạn trẻ từ 2 đến 3 tuổi. Các bệnh nhân được coi như mắc thể nặng nếu phải ngồi xe lăn, mất khả năng tự đi lại trước tuổi 12 (1). Bệnh loạn dưỡng cơ Becker (BMD) là thể trung gian của bệnh DMD với thời kỳ khởi phát bệnh muộn hơn và có tiến PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GENE DYSTROPHIN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRÊN BỆNH NHÂN LOẠN DƯỠNG CƠ DUCHENNE/BECKER Ngô Mạnh Tiến*, Nguyễn Thị Phương Mai*, Nguyễn Thị Mai Hương*, Lý Thị Thanh Hà*, Ngô Thị Tuyết Nhung*, Ngô Diễm Ngọc*, Nguyễn Ngọc Khánh**, Bùi Phương Thảo**, Vũ Chí Dũng** *Khoa Di truyền và SHPT, Bệnh viện Nhi TW **Khoa Nội tiết-Chuyển hoá-Di truyền, Bệnh viện Nhi TW TÓM TẮT Loạn dưỡng cơ Duchenne (DMD) là một trong những bệnh thần kinh cơ - di truyền phổ biến nhất với tỷ lệ mới mắc là 1/3.500 trẻ trai đẻ sống. Mục tiêu: Xác định đột biến trên gene Dystrophin. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được thực hiện trên 564 bệnh nhân được chẩn đoán nghi ngờ mắc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne từ năm 2005 đến 12-2014 tại Bệnh Viện Nhi Trung ương. Phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene Dystrophin bằng kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật MLPA (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification). Kết quả: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện được 172/564 (30.5%) trường hợp bị đột biến mất đoạn và lặp đoạn, trong đó 157/564 (27.8%) trường hợp đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Những trường hợp không phát hiện thấy đột biến, được thực hiện tiếp kỹ thuật MLPA phát hiện 6 trường hợp đột biến mất đoạn và 9 trường hợp đột biến lặp đoạn. Vị trí đột biến mất đoạn tập trung ở vùng hotspot của gene Dystrophin, gồm các đột biến trong vùng trung tâm (exon 45-52) chiếm 61,1% và vùng đầu 5’ (exon 1-19) chiếm 29,3%, đột biến trên các vùng còn lại chiếm 9.63% (không đặc hiệu). Kết luận: Kỹ thuật Multiplex PCR và kỹ thuật MLPA phát hiện đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene Dystrophin có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, hiệu quả trong chẩn đoán di truyền bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne. Từ khóa: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR). 63 PHẦN NGHIÊN CỨU triển lâm sàng chậm hơn. Tỷ lệ mắc bệnh BMD khoảng 1/18,500 trẻ trai đẻ sống (2). Gene Dystrophin (DMD) là một trong những gene lớn nhất trong bộ gene người, nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể X (Xp21) có độ lớn 2.4Mb. Gene DMD gồm 79 exon, mã hóa cho protein dystrophin có độ lớn 427kDa. Đây là loại protein màng bao cơ, chủ yếu tập trung ở cơ xương và cơ tim. Một lượng nhỏ protein Dystrophin tập trung ở các tế bào thần kinh của não. Ở những bệnh nhân DMD, protein dystrophin thường không biểu hiện, trong khi đó bệnh nhân BMD thường có khoảng 10-40% lượng protein dystrophin. Các đột biến có thể xảy ra trên gene là đột biến mất đoạn, đột biến điểm, chuyển đoạn và mất đoạn nhỏ. Mất đoạn và lặp đoạn là loại đột biến hay gặp nhất, chiếm khoảng 65% trong số các đột biến (3-5). Trong đó, đột biến mất đoạn hay xảy ra trong vùng “hot spots” của gen, chủ yếu từ exon 44 đến exon 52 và từ exon 2 đến exon 19 (6). Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai phương pháp Multiplex PCR và MLPA để phát hiện các đột biến gene DMD trên 564 bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh DMD/BMD đến khám và điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương trong từ năm 2005 đến năm 2015. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng phương pháp hồi cứu, thực hiện trên 564 bệnh nhân nam từ 5 tháng đến 19 tuổi mắc DMD được điều trị tại Bệnh viện Nhi trung ương từ 12/2005 đến 01/2015. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân dựa trên các tiêu chuẩn cổ điển của Duchenne đã mô tả bao gồm: trẻ trai; giảm vận động, yếu cơ gốc chi (dấu hiệu Gowers), teo cơ gốc chi nhiều vị trí, đối xứng hai bên, bắp chân phì đại đối xứng hai bên, điện cơ đồ có hình ảnh tổn thương nguồn gốc sợi cơ; men creatine kinase huyết thanh tăng cao trên 20 lần so với trị số bình thường (13). 2.2. Phương pháp 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA vô trùng. 2.2.2. Tách chiết DNA từ máu ngoại vi DNA đước tách chiết theo QiaAmp DNA blood mini kit (QiAgen). Nồng độ và độ tinh sạch DNA được xác định trên máy Biophotometter plus (Eppendorf), các mẫu đạt độ tinh sạch OD (bước sóng 260/280) 1,8-2.0 sẽ được sử dụng làm các phản ứng tiếp theo. 2.2.3. Phản ứng Multiplex PCR Kỹ thuật Multiplex PCR phát hiện sự mất đoạn của 25 exon đặc hiệu tập trung ở vùng “hotspots” của gene. 25 exon này được chia thành 3 bộ Multiplex A, B, C. Trình tự mồi được thiết kế theo Chamberlain và cộng sự (7). TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 64 Bảng 1. Các exon của Multiplex A, B, C Multiplex A Multiplex B Mutiplex C Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) Exon Kích thước (bp) 45 547 Pm 535 49 439 48 506 3 410 Pb 332 19 459 43 357 16 290 17 416 50 271 41 270 51 388 13 238 32 253 8 360 6 202 42 195 12 331 47 181 34 171 44 268 60 139 4 196 52 113 Chu trình nhiệt được tiến hành với các điều kiện sau: 950C, 3 phút; [950C, 30s; 500C, 30s; 720C, 1 phút] x 30 chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 3%, nhuộm bằng Ethidium và nhận định kết quả dưới đèn UV. 2.2.4. Phản ứng MLPA Kỹ thuật MLPA (MRC-Holland, Hà Lan) thực hiện bằng cách sử dụng bộ đầu dò thương mại P034 và P035. 50-200ng DNA của mẫu pha loãng trong 5µL buffer AE được biến tính ở 98oC trong 5 phút, trộn với 3µL hỗn hợp probe và MLPA buffer. Phản ứng lai: hỗn hợp DNA và probe này sau đó được ủ tại 95oC trong 1 phút và 60oC trong 12 giờ hoặc qua đêm. Phản ứng nối: hỗn hợp DNA và probe được cho thêm với 32µL hỗn hợp Ligase-65 và buffer ở 54oC trong 15 phút và bất hoạt ở 980C trong 5 phút. Phản ứng PCR: sản phẩm sau nối được trộn kỹ với 30µL PCR buffer và mồi, sau đó phản ứng PCR được thực hiện ở điều kiện luân nhiệt PCR. Các đầu dò nếu không được ghép nối với nhau thì chỉ mang 1 primer cho nên không được khuếch đại. Sản phẩm sau khuếch đại được điện di phân tách đoạn trên hệ thống ABI 3130. Dữ liệu được phân tích trên phần mềm Coffalyser. 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Phát hiện đột biến bằng kỹ thuật Multiplex PCR Nhóm nghiên cứu sàng lọc đột biến mất đoạn trên 564 trường hợp bằng kỹ thuật Multiplex PCR đã phát hiện 157/564 (27.8%) bệnh nhân có đột biến mất đoạn. Trong đó có 96/157 (61.1%) bệnh nhân mất đoạn vùng hot spot trung tâm (từ exon 45-52); 46/157 (29.3%) bệnh nhân mất đoạn vùng exon 3-19. 65 PHẦN NGHIÊN CỨU Bảng 2. Tỷ lệ mất đoạn vùng hot spots Stt Vị trí của gene có mất đoạn N (%) 1 Exon 3 – 19 46 (29.3) 2 Exon 32 – 44 15 (9.6) 3 Exon 45 – 52 (vùng hospot) 96 (61.1) Tổng số 157 (100) Hình 1. Kết quả điện di multiplex PCR trên agarose Giếng 1: marker 100bp; Giếng 2a, 2b, 2c: mẫu chứng mất đoạn exon 3-44; Giếng 3a, 3b, 3c: mẫu chứng không mất đoạn; Giếng 4a, 4b, 4c: bệnh nhân mất đoạn exon 41, 42, 43; Giếng 5a, 5b, 5c: bệnh nhân không mất đoạn; Giếng 6a, 6b, 6c: bệnh nhân mất đoạn exon 12, 13; Giếng 7a, 7b, 7c: mẫu không chứa DNA. 3.2. Phát hiện đột biến bằng kỹ thuật MLPA 61 bệnh nhân không tìm thấy đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật Multiplex PCR được thực hiện tiếp kỹ thuật MLPA để phát hiện các đột biến mất đoạn nhỏ hoặc lặp đoạn. Kết quả có 06/61 (9.84%) bệnh nhân bị đột biến mất đoạn, trong đó có 3 trường hợp bị đột biến mất đoạn 1 exon, 1 trường hợp đột biến mất đoạn ngoài vùng hotspots (exon 65-74), và 09/61 (14.75%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn, trong đó có 4 trường hợp chỉ có đột biến lặp đoạn 1 exon. TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 66 Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện đột biến gene DMD bằng kỹ thuật MLPA Stt Dạng đột biến N (%) 1 Mất đoạn 6 (9.84%) 2 Lặp đoạn 9 (14.75%) 3 Không phát hiện đột biến 46 (75.41%) Tổng số 61 (100%) Hình 2. Điện di mao quản bộ P034 - DMD 2a: Mẫu đối chứng không có đột biến (NC). 2b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 44-50 67 PHẦN NGHIÊN CỨU 4. BÀN LUẬN Có nhiều phương pháp phát hiện đột biến gene Dystrophin như PCR, Southern blot, PCR định lượng, FISH (fluorescence in situ hybridization) và giải trình tự xác định đột biến điểm Tuy nhiên, có hai phương pháp phổ biến và hiệu quả thường được sử dụng để phát hiện các đột biến mất đoạn và lặp đoạn trên gene DMD là phương pháp Multiplex PCR và MLPA. Phương pháp Multiplex PCR là phương pháp sàng lọc mất đoạn 25 exon vùng hot spot. Đây là phương pháp nhân đoạn nhiều exon trong cùng một phản ứng có độ đặc hiệu cao và ít tốn kém. Nhận biết đột biến mất đoạn của 25 exon đặc hiệu trong vùng “hotspots” có thể phát hiện được 98% trong tổng số đột biến mất đoạn của gene Dystrophin (6). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát hiện 157/564 (27,8%) bệnh nhân có đột biến mất đoạn, trong đó 96/157 (61,1%) bệnh nhân chủ yếu mất đoạn ở vùng hotspots (Exon 45-52). Phương pháp MLPA (Multiplex ligation- dependent probe amplification) là phương pháp cho phép khuếch đại nhiều đoạn gene khác nhau với chỉ một cặp mồi duy nhất. Mỗi một đầu dò Hình 3. Điện di mao quản bộ P035 - DMD 3a: Mẫu đối chứng không có đột biến (NC). 3b: Mẫu bệnh nhân lặp đoạn exon 51-60 TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 68 (probe) bao gồm 1 cặp mồi (primer), cặp mồi này sẽ bắt cặp từ hai đầu của vùng gene quan tâm, sau đó hai cặp mồi này sẽ được nối lại với nhau thành một trình tự đích hoàn chỉnh. Phương pháp MLPA là phương pháp cho phép sàng lọc sự mất đoạn và lặp đoạn của 79 exon được chia làm hai bộ P034-P035 (8). Với những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng điển hình nhưng không phát hiện đột biến trên 25 exon vùng hot spots, chúng tôi tiếp tục sử dụng kỹ thuật MLPA để phân tích gene DMD, kết quả phát hiện thêm 06/61 (9,84%) bệnh nhân bị đột biến mất đoạn và và 09/61 (14,75%) bệnh nhân có đột biến lặp đoạn. Theo nghiên cứu của Prior và cộng sự thì tỷ lệ đột biến mất đoạn của gene Dystrophin là 70% (306 ca DMD và 55 ca BMD có đột biến mất đoạn) và đột biến chủ yếu tập trung ở vùng “hos pots” , chiếm tỷ lệ khoảng 80% (9). Yuge và cộng sự (10) đã nghiên cứu trên 138 bệnh nhân DMD với kết quả có 62% bệnh nhân bị mất đoạn, trong đó có 68% bệnh nhân mất đoạn ở vùng hospot. Nhờ sử dụng kết hợp các phương pháp MultiplexPCR và MLPA, Janssen và cộng sự đã phát hiện 53% tổng số bệnh nhân có đột biến mất đoạn và lặp đoạn (11). Nghiên cứu của Zimowski và cộng sự (12) phát hiện 134/180 bệnh nhân (73.9%) bệnh nhân có mất đoạn gene DMD bằng phương pháp MLPA. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết hợp giữa haiphương pháp Multiplex PCR và MLPA đã tăng tỷ lệ phát hiện đột biến từ 27.8% lên 30.5% và làm đa dạng khả năng phát hiện các loại đột biến như mất đoạn lớn, mất đoạn nhỏ, lặp đoạn Sự khác nhau về tỷ lệ mất đoạn của gene Dystrophin có thể phụ thuộc vào số lượng các exon được phân tích và số lượng mẫu nghiên cứu. 5. KẾT LUẬN - Sự kết hợp giữa hai phương pháp Multiplex PCR và MLPA đã phát hiện được 172/564 (30.5%) bệnh nhân DMD/BMD có đột biến mất đoạn hoặc lặp đoạn. Các đột biến xảy ra chủ yếu nằm ở vùng hot spots. - Kỹ thuật Multiplex PCR và MLPA là các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, làm tăng tỷ lệ phát hiện đột biến trên gene DMD. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Emery AE. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases--a world survey. Neuromuscul Disord. 1991;1(1): 19-29. 2. Bushby KM, Thambyayah M, Gardner - Medwin D. Prevalence and incidence of Becker muscular dystrophy. Lancet. 1991;337(8748): 1022-4. 3. Koenig M, Hoffman EP, Bertelson CJ, Monaco AP, Feener C, Kunkel LM. Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell. 1987;50(3): 509-17. 4. Forrest SM, Cross GS, Flint T, Speer A, Robson KJ, Davies KE. Further studies of gene deletions that cause Duchenne and Becker muscular dystrophies. Genomics. 1988;2(2): 109- 14. 5. Den Dunnen JT, Grootscholten PM, Bakker E, Blonden LA, Ginjaar HB, Wapenaar MC, et al. Topography of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) gene: FIGE and cDNA analysis of 194 cases reveals 115 deletions and 13 duplications. Am J Hum Genet. 1989;45(6): 835-47. 69 PHẦN NGHIÊN CỨU 6. Beggs AH, Koenig M, Boyce FM, Kunkel LM. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genet. 1990;86(1): 45-8. 7. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 1988;16(23): 11141-56. 8. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Res. 2002; 30(12): e57. 9. Prior TW, Bridgeman SJ. Experience and strategy for the molecular testing of Duchenne muscular dystrophy. J Mol Diagn. 2005;7(3): 317- 26. 10. Yuge L, Hui L, Bingdi X. Detection of gene deletions in Chinese patients with Duchenne/ Becker muscular dystrophy using CDNA probes and the polymerase chain reaction method. Life Sci. 1999;65(9): 863-9. 11. Janssen B, Hartmann C, Scholz V, Jauch A, Zschocke J. MLPA analysis for the detection of deletions, duplications and complex rearrangements in the dystrophin gene: potential and pitfalls. Neurogenetics. 2005;6(1): 29-35. 12. Zimowski JG, Massalska D, Holding M, Jadczak S, Fidzianska E, Lusakowska A, et al. MLPA based detection of mutations in the dystrophin gene of 180 Polish families with Duchenne/Becker muscular dystrophy. Neurologia i neurochirurgia polska. 2014;48(6): 416-22. 13. Katharine Bushby, Richard Finkel, David J Birnkrant, et al. Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy, part 1: diagnosis, and pharmacological and psychosocial management. Lancet Neurol. 2010 Jan; 9(1): 77-93. ABSTRACT DETECTION MUTATION IN DYSTROPHIN GENE USING MOLECULAR TECHNIQUES IN DUCHENNE/BECKER PATIENTS Ngo Manh Tien*, Nguyen Thi Phuong Mai*, Nguyen Thi Mai Huong*, Ly Thi Thanh Ha*, Ngo Thi Tuyet Nhung*, Ngo Diem Ngoc*, Nguyen Ngoc Khanh**, Bui Phuong Thao**, Vu Chi Dung** * Human Genetics Department, National Hospital of Peadiatrics, Hanoi, Vietnam ** Endocrinology-Metabolic-Genetic Department, National Hospital of Pediatrics, Hanoi, Vietnam Overview: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common genetic neuromuscular diseasesat the rate of 1 out of 3500male live births. Goal: Detecting mutation in Dytrophin gene. Patients and Method: 564 patients suspected of Duchenne muscular dystrophy (DMD) were collected from 2005 to 12-2014 at National Hospital of Pediatrics. The detection of deletion and dulication mutation in Dystrophin gene were identified by Multiplex PCR technique and MLPA technique (Multiplex Liation-dependent Probe Amplification). Results: In this study, we have discovered TẠP CHÍ NHI KHOA 2016, 9, 3 70 172/564 (30.5%) cases of deletion and duplication mutations, in which 157/564 (27.8%) cases of deletion mutations by multiplex PCR technique. The remaining cases are 6 cases deletion and 9 cases duplication mutation by MLPA technique. Most of the mutation arelocated in the hotspot of the Dystrophin gene, including mutations in the central genomic region for (exon 45-52) 61.1% and in the 5’ region (exon 3-19) 29.3%, following is the remaining of the gene 9.6% (respectively). Conclusion: Multiplex PCR technique and MLPA technique detect deletions and duplication mutations in the Dystrophin gene, have high sensitivity and specificity and efficiency in diagnosing genetic Duchenne muscular dystrophy díseases. Keywords: Duchenne, DMD, Dystrophin, multiplex PCR (MPCR).

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfphat_hien_dot_bien_gene_dystrophin_bang_cac_phuong_phap_sinh.pdf
Tài liệu liên quan