Phát hiện nhanh vật liệu di truyền vi rút Hepers (HSV) bằng cảm biến sinh học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 228 PHÁT HIỆN NHANH VẬT LIỆU DI TRUYỀN VI RÚT HEPERS (HSV) BẰNG CẢM BIẾN SINH HỌC Trần Quang Huy*, Nguyễn Thị Hồng Hạnh*, Phan Thi Ngà*, Nguyễn Thị Thường*, Phạm Văn Chung*, Mai Anh Tuấn** TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Kết quả nghiên cứu trong những năm gần ñây ñược công bố trên các tạp chí quốc tế chuyên ngành ñã cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn của cảm biến sinh học trong chẩn ñoán một số tác nhân gây bệnh nhờ khả năng phát hiện nhanh một hay ña tác nhân gây bệnh, tiện ích, dễ sử dụng và chi phí sinh phẩm và thiết bị kèm theo thấp hơn các thiết bị chẩn ñoán truyền thống. Mục tiêu nghiên cứu: Bước ñầu nghiên cứu ứng dụng bộ cảm biến sinh học ñiện hóa ñể phát hiện nhanh vật liệu di truyền của vi rút gây bệnh. Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng bộ cảm biến sinh học ñiện hóa trên cơ sở cố ñịnh DNA làm phần tử dò ñể phát hiện vật liệu di truyền của vi rút Herpes (HSV) trên mẫu chuẩn và thử nghiệm trên mẫu thực ñã khuyếch ñại bằng PCR. Kết quả: Cảm biến sinh học ñiện hóa trên cơ sở DNA có ñộ nhạy cao, có khả năng dò tìm mẫu với nồng ñộ rất thấp cỡ 0,5nM, tín hiệu ñầu ra xuất hiện và ổn ñịnh khoảng 5 phút sau khi tiếp xúc với mẫu. Kết luận: Có khả năng phát triển và ứng dụng cảm biến sinh học trên cơ sở DNA ñể phát hiện nhanh một hoặc ñồng thời vật liệu di truyền của một hay nhiều vi rút ở Việt Nam. Từ khóa: cảm biến sinh học, vật liệu di truyền, vi rút Herpes. ABSTRACT RAPID DETECTION OF HSV GENOME USING BIOSENSOR Tran Quang Huy, Nguyen Thi Hong Hanh, Phan Thi Nga, Nguyen Thi Thuong, Pham Van Chung, Mai Anh Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 228 - 233 Background: Recent research results of biosensors published in the international specialized scientific journals have shown their potential application in rapid detection of one or simultaneous multi-pathogens, easy use and low cost in comparison with traditional diagnostic methods. Objectives: Initial study on the application of electrochemical biosensor for the rapid detection of viral genome. Method: Using electrochemical biosensor based on DNA immobilization as probe for the rapid detection of Herpes Simplex Virus (HSV) genome from standard samples and its PCR product Results: Our DNA based electrochemical biosensor shown a high sensitivity, the detection limit is 0.5nM of sample and the stable response time of the biosensor is approximately 5 min. Conclusion: Our DNA based electrochemical biosensor can be developed and applied for rapid detection of one or simultaneous multi-virus genomes in Vietnam. Keywords: biosensor, viral genome, Herpes Simplex Virus (HSV) * Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ** Viện ITIMS, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Địa chỉ Liên lạc: ThS Trần Quang Huy ĐT: 0978960658 Email:huytq@nihe.org.vn/ huytq@itims.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 229 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, rất nhiều các bệnh truyền nhiễm ñang ñe dọa nghiêm trọng tới sức khỏe cộng ñồng. Khống chế và ngăn chặn kịp thời các tác nhân gây bệnh truyền nhiễm luôn là yêu cầu cấp thiết không chỉ ñối ngành y tế mà với tất cả các ngành nghề khác nhằm giảm thiểu nguy cơ liên quan tới sức khỏe và những thiệt hại về mặt kinh tế xã hội. Hiện có rất nhiều phương pháp và thiết bị chẩn ñoán phòng thí nghiệm ñể xác ñịnh tác nhân gây bệnh như: phân lập; nuôi cấy; huyết thanh học; ELISA; PCR... Tuy nhiên, các phương pháp chẩn ñoán truyền thống này thường mất hàng giờ tới hàng tuần ñể biết ñược kết quả(5). Trong những năm gần ñây, cảm biến sinh học ñã ñược nghiên cứu và chứng minh có tiềm năng lớn trong lĩnh vực chẩn ñoán, kiểm soát bệnh, môi trường, an toàn thực phẩm và khủng bố sinh học, hiện ñang ñược rất nhiều các nhà khoa học trong và ngoài nước tập trung nghiên cứu và phát triển(6,4). Những ưu ñiểm nổi bật của cảm biến sinh học như: ñộ nhạy cao, ñộ chọn lọc cao, kích thước nhỏ gọn, tiện dụng, lượng mẫu cần phân tích với nồng ñộ thấp, khả năng phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh tại chỗ, giá thành thấp,(4,1). Nhờ sự phát triển vượt bậc của công nghệ, các nhà công nghệ có khả năng tích hợp nhiều cảm biến sinh học trên một diện tích cỡ mm2, nên có khả năng phát hiện ñồng thời hay ñộc lập từ một ñến hàng trăm tác nhân gây bệnh trong thời gian trả lời chỉ tính bằng phút(7,8,9,10). Tại Việt Nam, nhóm nghiên cứu của chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu và chế tạo thành công bộ cảm biến sinh học ñiện hóa trên cơ sở gắn DNA làm phần tử dò ứng dụng trong lĩnh vực y sinh học. Những kết quả thử nghiệm bước ñầu ñối với loại cảm biến này ñã ñược chấp nhận và công bố trên một số tạp chí trong nước và quốc tế(3,8). Nhằm mục ñích tiếp tục phát triển và phát huy tối ña hiệu quả ứng dụng bộ cảm biến sinh học này ñể phát hiện nhanh vật liệu di truyền của một số loại vi rút gây bệnh, chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm ñể phát hiện nhanh vật liệu di truyền của vi rút Herpes (HSV) trên mẫu chuẩn và mẫu thực tế. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Bộ cảm biến sinh học ñiện hóa ñã ñược tác giả và nhóm nghiên cứu thiết kế, chế tạo thành công tại Viện ITIMS, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội(4). Nucleotit làm phần tử dò có trình tự 5’–AT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C–3’ (Invitrogen) ñặc hiệu với vi rút HSV, nucleotit bổ sung làm phần tử ñích (mẫu chuẩn) có trình tự 5’-G TCC CTC TCC GGG TCG GTG AT-3’ (Invitrogen), sản phẩm PCR dương tính từ mẫu bệnh phẩm dịch não tủy bệnh nhân nghi mắc HSV ký hiệu VN055 ñược thực hiện và cung cấp bởi Phòng thí nghiệm các vi rút Herpes, khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Phương pháp nghiên cứu Gắn nucleotit có trình tự ñặc hiệu với vi rút HSV lên bề mặt cảm biến ñiện hóa làm ñầu dò bằng phương pháp cộng hóa trị thông qua lớp polyme APTS (3-aminopropyl–triethoxy-silane). Đo tín hiệu dò tìm (tín hiệu ñầu ra) của cảm biến sinh học bằng bộ khuyếch ñại xung Lock in SR830 theo nồng ñộ nồng ñộ mẫu phân tích và nhiệt ñộ. Sơ ñồ ño như mô tả trên hình 1. Phân tích, ñánh giá khả năng phát hiện vật liệu di truyền của vi rút HSV bằng cảm biến ñiện hoá, so sánh các kết quả dò tìm trên mẫu chuẩn và trên sản phẩm PCR HSV dương tính sau khi ñã biến tính. Hình 1. Sơ ñồ ño ñạc tín hiệu dò tìm của cảm biến sinh học ñiện hóa. Phần tử dò ñược gắn trên phần ñiện cực hoạt ñộng, ñiện cực so sánh (không gắn phần tử dò) sử dụng ñể ñối chứng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 230 KẾT QUẢ VÀ BÀI LUẬN Dò tìm nucleotit có trình tự bổ sung với phần tử nucleotit dò trên cảm biến sinh học Để xác ñịnh ñộ nhạy của cảm biến sinh học ñiện hóa, trước tiên chúng tôi thử nghiệm khả năng phát hiện nucleotit có trình tự bổ sung với ñầu dò gắn trên cảm biến. Ở nhiệt ñộ phòng, với các cảm biến ñã gắn sẵn nucleotit dò ñược ño theo thứ tự nồng ñộ mẫu thay ñổi từ 0,03nM ñến 0,5nM. Với mỗi phép ño tương ứng ở những nồng ñộ nhất ñịnh, tín hiệu ñầu ra ñược quan sát từ khi cảm biến tiếp xúc với mẫu ñến khoảng 10 phút hầu như không thay ñổi hoặc thay ñổi rất ít. Khi tăng nồng ñộ mẫu ñến 0,5nM, tín hiệu ñầu ra ngay sau 1 phút ñã có sự thay ñổi rõ rệt hơn và ñạt giá trị tương ñối ổn ñịnh sau khoảng 5 phút (hình 2). Thí nghiệm ñược lặp lại 03 lần với các nồng ñộ mẫu thay ñổi từ 0,5nM tới 3nM, kết quả ñã chứng minh khi nồng ñộ mẫu tăng thì tìn hiệu ñầu ra cũng tăng dần và giới hạn dò tìm mẫu ñể tạo sự bắt cặp ñặc hiệu giữa phần tử dò và phần tử ñích ñược xác ñịnh là 0,5nM. Kết quả này cũng phù hợp với công bố của Phuong Dinh Tam và ñồng nghiệp sử dụng loại cảm biến tương tự ñể dò tìm vật liệu di truyền của vi rút H5N1(8). Ngoài ra, ñể kiểm chứng sự ổn ñịnh của cảm biến, chúng tôi ñã thực hiện phép ño chứng âm với mẫu chỉ chứa nước khử ion. Khi thể tích mẫu chứng âm tăng thì tín hiệu ñầu ra của cảm biến không xuất hiện hoặc xuất hiện với giá trị không ñáng kể (hình 3). Hình 2. Tín hiệu dò tìm theo thời gian tương ứng với nồng ñộ mẫu phân tích bằng 0,5nM Hình 3. Tín hiệu dò tìm theo sự thay ñổi nồng ñộ mẫu phân tích ở nhiệt ñộ phòng. Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến ñộ nhạy và tính ổn ñịnh của cảm biến, chúng tôi tiến hành ño ñạc khả năng phát hiện nucleotit bổ sung trong ống mẫu ñược gia nhiệt. Với nồng ñộ mẫu thay ñổi là 0,5nM, 1nM và 3nM, ñồng thời tăng từ nhiệt ñộ phòng (27°C) lên các mức 30°C, 35°C, 45°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C, 80°C, 85°C (hình 4, hình 5). Lựa chọn thời gian trung bình 5 phút ñể ghi nhận tín hiệu kể sau khi cho cảm biến tiếp xúc với mẫu. Khi tăng nhiệt ñộ từ 30°C lên ñến 70°C, tín hiệu ñầu ra tăng tuyến tính. Trong ñó, khoảng nhiệt ñộ từ 30°C ñến khoảng 50°C (vùng I), tín hiệu ra tăng chậm, nhưng từ 50°C ñến giá trị 70°C (vùng II) tín hiệu ra tăng rất nhanh rồi giảm ñột ngột khi tiếp tục tăng lên nhiệt ñộ 75°C, khi tiếp tục tăng ñến 80°C - 85°C (vùng III) tín hiệu ra giảm nhẹ và sau ñó ổn ñịnh. Để giải thích hiện tượng này, chúng tôi cho rằng tín hiệu ra tăng tương ứng với tốc ñộ phản ứng lai hóa giữa nucleotit dò và nucleotit ñích tăng khi nhiệt ñộ tăng. Tuy nhiên, với nồng ñộ mẫu thấp, tốc ñộ phản ứng lai ít bị tác ñộng bởi dải nhiệt ñộ từ nhiệt ñộ phòng ñến khoảng 50°C, nhưng lại tăng rất nhanh ở dải nhiệt ñộ từ 50°C ñến hơn 70°C. Theo thực nghiệm, tốc ñộ phản ứng lai ñạt giá trị cực ñại trong khoảng 70° ñến 75°C rồi ñột ngột giảm mạnh, do ñó trong khoảng nhiệt ñộ này bao gồm giá trị nhiệt ñộ biến tính Tm mà tại ñó xảy ra sự tách cặp giữa hai mạch nucleotit dò và nucleotit ñích. Theo lý thuyết, tốc ñộ phản ứng lai hóa ñạt cực ñại ở nhiệt ñộ thấp hơn Tm của chính axit nucleic ñó khoảng 25%(2). Mặt khác, từ công thức: Tm = 69,3 + 0,41(G + C), trong khi trình tự nucleotit ñầu dò ñược thiết kế gồm 21 nucleotit: 5’–AT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C–3’, với số A = 6, T = 1, C = 7, G= 7, do ñó Tm = 69,3 + 0,41(7 + 7) = 75,04°C, giá trị này cũng gần ñúng với kết quả thực nghiệm. Tuy nhiên, ñể thuận lợi cho quá trình phân tích, dải nhiệt ñộ từ 500C ñến 600C ñược cho là thích hợp ñể tiến hành phản ứng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 231 Hình 4. Sự ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên khả năng phát hiện nucleotit bổ sung của cảm biến sinh học theo nồng ñộ mẫu phân tích Hình 5. Tín hiệu dò tìm theo nhiệt ñộ của cảm biến sinh học với nồng ñộ mẫu phân tích 1nM Dò tìm vật liệu di truyền của HSV trong sản phẩm PCR bằng cảm biến sinh học Để xác ñịnh ñộ nhạy và khả năng phát hiện vật liệu di truyền của vi rút gây bệnh từ trên mẫu thực bằng cảm biến sinh học, chúng tôi tiến hành ño ñạc thử nghiệm với sản phẩm PCR của HSV. Mẫu bệnh phẩm từ dịch não tủy bệnh nhân dương tính với HSV ký hiệu VN055 ñược khẳng ñịnh bằng kỹ thuật PCR tại phòng thí nghiệm các vi rút Herpes, khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Sau phi pha mẫu trong phản ứng 25µl và chạy bằng kỹ thuật PCR cổ ñiển. Từ sản phẩm thu ñược, lấy 10µl nhỏ trên hai giếng (số 8 và 9) ñể chạy ñiện di trên thạch l%, sử dụng 15µl còn lại ñể làm mẫu phân tích cho cảm biến sinh học. Hình 6 là kết quả PCR dương tính của mẫu bệnh phẩm ký hiệu VN055, ñược minh chứng bằng hai dải sáng với trọng lượng khoảng 92bp ở giếng số 8 và số 9, giếng số 2 ñến số 7 là chứng dương theo số lượng tương ứng 105 – 100 bản sao DNA của HSV chuẩn từ phòng thí nghiệm. Giếng số 1 là chứng âm, sử dụng nước khử ion thay cho khuôn mẫu DNA, M là dải DNA chuẩn. Pha loãng sản phẩm PCR của HSV theo nồng ñộ tới 0,5nM. Trước khi tiến hành các phép ño, chúng tôi nâng nhiệt ñộ dung dịch chứa mẫu lên 95°C trong 5 phút ñể DNA sợi ñôi ñặc hiệu của HSV biến tính hoàn toàn thành các sợi DNA ñơn, sau ñó làm nguội nhanh xuống 50 – 55°C, quá trình ño ñạc ñược thực hiện ngay sau ñó ñể giảm thiểu khả năng tái bắt cặp giữa các DNA sợi ñơn. Hình 7 là ñồ thị mô tả kết quả dò tìm DNA ñặc hiệu của vi rút HSV của cảm biến, tín hiệu dò tìm xuất hiện và ổn ñịnh ngay sau khoảng 5 phút ñối với nồng ñộ mẫu 0,5nM, nhưng các giá trị tín hiệu ñầu ra ño ñược nhỏ và tăng tuyến tính khi tăng nồng ñộ mẫu từ 0,5nM ñến 7nM. Với nồng ñộ mẫu lớn hơn 7nM tín hiệu lai hóa ở trạng thái bão hòa. Kết quả này ñược giải thích rằng, khi cho vi cảm biến Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 232 tiếp xúc với nồng ñộ mẫu ñủ nhỏ, trên bề mặt vi cảm biến xuất hiện sự lai hóa của DNA dò và DNA ñích, nhưng ñồng thời trong dung dịch cũng xảy ra hiện tượng tái bắt cặp giữa các DNA sợi ñơn, dẫn ñến tín hiệu lai hóa thấp, còn giá trị bão hòa có thể là do số lượng DNA ñầu dò trên bề mặt vi cảm biến ñã lai hóa hết với DNA trong mẫu phân tích. Từ kết quả thực nghiệm phát hiện DNA ñặc hiệu của HSV trong sản phẩm PCR, số lượng DNA thực tế lai hóa với DNA ñầu dò ñược xác ñịnh bởi: NDNA lai hóa = NDNA trong sản phẩm PCR của HSV – (NDNA tái bắt cặp + NDNA dư thừa) Trong ñó N là số lượng DNA sợi ñơn. Hình 6. Kết quả PCR dương tính với HSV của bệnh nhân ký hiệu VN055 Hình 7. Khả năng phát hiện DNA ñặc hiệu của HSV từ sản phẩm PCR. KẾT LUẬN Với nghiên cứu bước ñầu, chúng tôi ñã tạo ra một loại cảm biến sinh học ñiện hóa trên cơ sở gắn DNA làm phần tử dò có ñộ nhạy cao, có khả năng phát hiện vật liệu di truyền của vi rút Herpes ở nồng ñộ thấp cỡ 0,5nM ngay 5 phút sau khi cho tiếp xúc với mẫu phân tích, dải nhiệt ñộ tối ưu ñể phát hiện từ 500C – 650C, quá trình ño ñạc ñơn giản, không yêu cầu các thao tác thí nghiệm phức tạP. Những kết quả này là tiền ñề cho quá trình nghiên cứu phát triển bộ chíp sinh học dạng mảng (microarray) ñể có khả năng phát hiện nhanh một hay ñồng thời nhiều vật liệu di truyền của vi rút gây bệnh ở Việt Nam. Lời cảm ơn: Công trình này ñược sự hỗ trợ của Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia, ñề tài mã số 106.16.181.09. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Drummond TG et al (2003). Electrochemical DNA sensors, Nature Biotechnology, 1192-1199. 2. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003). Sinh học phân tử. Nxb Giáo Dục. 3. Huy.T.Q., Thuy N.T.T., Tam P. D, Tuan M. A., and Chien N.D (2007). Investigation of electrochemical DNA sensor for biomedical Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 233 application. Proceedings of the 2sd International Conference on Biomedical Engineering, 273 – 278. 4. Lazcka O et al (2007). Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosensors and Bioelectronics 22, 1205–1217. 5. Mahy BWJ and Kangro HO (1995). Virology Methods Manual. Academic Press. 6. Malhotra BD et al. Recent trends in biosensors (2005). Current applied physics 5, 92-97. 7. Patolsky, F., Zheng, G., Hayden, O., Lakadamyali, M., Zhuang, X., Lieber, C.M., (2004). Electrical detection of single viruses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101, 14017-14022. 8. Phuong Dinh Tam, Nguyen Van Hieu, Nguyen Duc Chien, Mai Anh Tuan, (2009). DNA Sensor Development Based on Multi Wall Carbon nanotubes for label- free Influenza Virus (Type A) Detection. Volume 350, Issues 1-2, 118-124. 9. Pinar KA, Burcu M et al (2004). Electrochemical DNA biosensor for the detection and discrimination of herpes simplex Type I and Type II viruses from PCR amplified real samples. Analytica Chimica Acta 518, 69–76. 10. Ye Y.K.., Zhao J.H (2003). Electrochemical behavior and detection of hepatitis B virus DNA PCR production at gold electrode. Biosensors and Bioelectronics 18, 1501-1508.