Phát hiện tỉ lệ tương đối cao đột biến gen H-Ras và gen P53 trong ung thư hốc miệng ở người Việt Nam

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 128 PHÁT HIỆN TỈ LỆ TƯƠNG ĐỐI CAO ĐỘT BIẾN GEN H-RAS VÀ GEN P53 TRONG UNG THƯ HỐC MIỆNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM Nguyễn Thị Hồng* TÓM TẮT Mở đầu: Gen ras là một trong những oncogen thường bị đột biến nhất trong các ung thư ở người. Trong một nghiên cứu trước đây (năm 2002), chúng tôi đã tìm thấy 44,4% ung thư hốc miệng (UTHM) có đột biến gen p53. Điều này gợi ý khả năng có sự hoạt hóa oncogen ras gây ung thư, nhất là ở trường hợp không có đột biến gen đè nén bướu p53. Mục tiêu: Khảo sát tỉ lệ và kiểu đột biến của gen H-ras trong UTHM. Phương pháp: Giải trình tự chuỗi DNA của gen H-ras tại các exon 1 và 2 trong 18 ca ung thư tế bào gai ở hốc miệng. Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang. Kết quả: Ngoài 8 ca có đột biến gen p53 đã tìm thấy, kết quả phát hiện thêm 3 ca có đột biến gen H-ras, chiếm tỉ lệ 16,7%. Trong 3 đột biến này, có 1 đột biến thêm 3 nucleotid (GGC) giữa codon 10 và codon 11 tạo ra thêm glycin (10Gly11) trong khung, 1 đột biến sai nghĩa tại codon 12 (GGC>AGC) và 1 đột biến sai nghĩa tại codon 13 (GGT>CGT) làm thay đổi axít amin. Tất cả đột biến này đều xảy ra ở bệnh nhân nữ có thói quen nhai trầu, ung thư ở giai đoạn trễ, độ ác tính mô học thấp, và không có đột biến gen p53. Ngoài ra, có 5 đột biến im lặng (27,8%) biểu hiện đa hình nucleotid đơn (SNP) C81T. Tổng cộng trong 18 ca UTHM, có 4 ca (22,2%) đột biến trên cả hai gen p53 và H-ras, tuy nhiên chỉ có đột biến gen p53 kiểu sai nghĩa hoặc ghép nối sai còn đột biến gen H-ras là đột biến im lặng. Kết luận: Đột biến gen H-ras có thể giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư hốc miệng ở người Việt Nam. Từ khóa: Đột biến gen H-ras, đột biến gen p53, oncogen, gen đè nén bướu, UTHM. ABSTRACT DETECTION OF RELATIVELY HIGH INCIDENCE OF H-RAS MUTATIONS AND P53 MUTATIONS IN ORAL CANCER IN VIETNAMESE Nguyen Thi Hong* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 128 - 133 Background: The ras gene is one of the most commonly detected mutated oncogenes in human cancers. Our previous study (2002) showed that 44.4% had mutation in p53 tumor suppressor gene. We thus hypothesized that the ras oncogene could be activated, especially in cases without p53 mutation. Objectives: To investigate the incidence and patterns of H-ras mutation in oral cancer. Methods: In this cross-sectional study, DNA samples obtained from the same 18 primary oral squamous cell carcinomas were screened for mutations of hot spots in exons 1 and 2 of the H-ras gene by DNA sequencing. Results: Besides p53 mutations found in 8 cases, the H-ras mutations were detected in 3 cases (16.7%). In these three H-ras mutations, one was an insertion of three nucleotide (GGC) between codons 10 and 11 resulting in in-frame insertion of glycine (10Gly11), one was a missense mutation in codon 12 (GGC>AGC) and one was a missense mutation in codon 13 (GGT>CGT) resulting in amino acid changes. These H-ras mutations were only *: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Thị Hồng, ĐT: 0903810003; Email: nguyopat@hcm.vnn.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 129 found in female patients with betel chewing habit, advanced stage of the tumor, and low grade of malignancy, but without p53 mutation. We also found silent mutations of H-ras gene, with C81T single nucleotide polymorphism (SNP), in 5 of 18 tumors (27.8%). Altogether, 4 cases (22.2%) had simultaneously H-ras mutation (silent mutation) and p53 mutation (missense or abberant splicing mutation). Conclusion: H-ras gene mutation could play an important role in the tumorigenesis of oral carcinoma in Vietnamese patients. Key words: H-RAS mutation, p53 mutation, oncogene, tumor suppressor gene, oral cancer. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư hốc miệng (UTHM) là một trong mười loại ung thư thường gặp nhất(9). Mặc dù cùng có thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai trầu – yếu tố nguy cơ UTHM, nhưng chỉ có một số người có thói quen này bị ung thư. Điều này cho thấy các yếu tố di truyền có thể góp phần thúc đẩy sự sinh ung thư. Việc tìm ra những biến đổi di truyền là cần thiết để tạo ra các chất ức chế trong liệu pháp đích điều trị đặc hiệu ung thư. Trong các ung thư ở người, gen đè nén bướu p53 thường bị đột biến nhất. Trong một nghiên cứu trên 18 ca ung thư ở hốc miệng (năm 2002), chúng tôi đã phát hiện 8 ca có đột biến gen p53, chiếm tỉ lệ 44,4%(6). Nhiều trường hợp không có đột biến ở gen đè nén bướu p53 gợi ý khả năng đột biến ở oncogen. Trong các oncogen, gen ras thường bị đ ột biến nhất(9,10). Họ gen ras, gồm có 3 gen là H-ras, K-ras và N-ras, mã hóa protein p21 (p21ras). Protein này định vị ở màng tế bào, giữ vai trò trung tâm điều hòa các đường dẫn truyền tín hiệu tế bào. Đường dẫn truyền tín hiệu Ras-Raf- MEK-ERK hiện đang là điểm đích hấp dẫn cho điều trị ung thư(9). Để đánh giá đột biến gen H-ras trong UTHM, nghiên cứu này nhằm các mục tiêu sau: - Xác định tỉ lệ đột biến gen H-ras trong UTHM. - Khảo sát đồng đột biến gen H-ras và đột biến gen p53 trong UTHM. - Khảo sát đột biến H-ras với một số đặc điểm lâm sàng-giải phẫu bệnh của UTHM. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu Gồm 18 ca ung thư tế bào gai ở hốc miệng chưa điều trị đặc hiệu, được điều trị tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM tháng 7 và 8/2000. Thiết kế nghiên cứu Cắt ngang mô tả. Các phương pháp thực hiện Ly trích DNA Ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết ở bướu nguyên phát bằng bộ ly trích QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại các exon của gen p53 và gen H-ras Nghiên cứu chỉ khảo sát đột biến từ exon 5 đến exon 8 của gen p53 do đa số (87%) đột biến gen p53 xảy ra trong những exon này(2). Dùng 4 cặp mồi để khuếch đại các exon 5, 6, 7 và 8 của gen p53. Trình tự các nucleotid của các đoạn mồi và phản ứng PCR đã được mô tả trong y văn (Sakai 1992)(7). Đối với DNA của gen H-ras, trình tự các đoạn mồi và phản ứng PCR khuếch đại exon 1 và exon 2 thực hiện như đã nêu trong y văn (Munirajan 1998, Murugan 2008)(4,5). Mỗi đợt thí nghiệm luôn có chứng dương đã biết cho kết quả PCR (+) và một chứng âm thay thế mẫu DNA bằng nước cất. Kết quả PCR được đánh giá bằng cách điện di trên gel. Giải trình tự chuỗi DNA Tinh sạch sản phẩm PCR. Thực hiện PCR qua 25 chu kỳ nhiệt để khuếch đại đoạn gen cần giải trình tự. Sau đó, sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự chuỗi DNA bằng Big Dye Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 130 Terminator v 1.1 cycle sequencing kit ở máy giải trình tự ABI-Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem). Tất cả các mẫu đều được thực hiện PCR hai lần, gồm 1 lần PCR với đoạn mồi cùng chiều và 1 lần PCR với đoạn mồi ngược chiều. KẾT QUẢ Đột biến gen p53 8 ca có đột biến gen p53, chiếm tỉ 44,4%. Về exon đột biến, 2 ca đột biến ở exon 5; 2 ca ở exon 7; 3 ca ở exon 8 và 1 ca ở hai exon 7 và 8. Không đột biến ở exon 6 (Bảng 1). Tổng cộng phát hiện được 9 đột biến trong 8 ca, trong đó có 7 đột biến điểm sai nghĩa (77,8%) và 2 đột biến ghép nối sai (22,2%). Tỉ lệ đột biến gen p53 trong nhóm bệnh nhân có thói quen nhai trầu (57,1%), hút thuốc (42,9%) cao hơn ở nhóm không có những thói quen trên (25%). Tỉ lệ đột biến gen p53 ở nhóm bệnh nhân dưới 60 tuổi, ung thư giai đoạn trễ, độ ác tính mô học trung bình, tăng cao hơn ở nhóm bệnh nhân trên 60 tuổi, giai đoạn sớm, độ mô học thấp (Bảng 2). Đột biến gen H-ras Đột biến gen H-ras xảy ra trong 7 ca (38,9%), trên exon 1, bao gồm (Bảng 1): - 1 ca đột biến thêm 3 nucleotid (GGC) vào giữa codon 10 và codon 11 nên tạo ra thêm 1 axít amin là glycin (10Gly11) trong khung. - 1 ca đột biến điểm sai nghĩa tại codon 12 (GGC>AGC) và đột biến im lặng tại codon 27. - 1 ca đột biến điểm sai nghĩa tại codon 13 (GGT>CGT). - 4 ca đột biến im lặng C81T tại codon 27 biểu hiện đa hình nucleotid đơn (SNP). Không kể đột biến im lặng, tỉ lệ đột biến gen H-ras trong mẫu nghiên cứu này là 16,7%. Tổng cộng có 8 đột biến trong 7 ca. Trong đó, có 5 đột biến im lặng không làm thay đổi protein (62,5%) và 3 đột biến làm thay đổi protein (37,5%). Trong 3 ca đột biến này, có 2 ca đột biến điểm (66,7%). Tất cả 3 ca này đều xảy ra ở bệnh nhân nữ, trên 60 tuổi, có thói quen nhai trầu, ung thư ở giai đoạn trễ, bướu có độ ác tính mô học thấp và không có đột biến gen p53 (Bảng 3). Đồng đột biến p53 và H-ras Có 4 ca (22,2%) đột biến xảy ra trên cả hai gen p53 và H-ras. Tuy nhiên, chỉ có đột biến gen p53 kiểu sai nghĩa hoặc ghép nối sai trong khi đột biến gen H-ras là đột biến im lặng. Bảng 1: Đột biến gen H-ras và đột biến gen p53 trong 18 ca UTHM ST T Tuổi Giới Thói quen Vị trí Độ mô học Giai đoạn Đột biến H-ras (exon 1-2) Đột biến p53 (exon5-8) Nucl- eotid Codon Axit Amin Kiểu đột biến 1 75 Nữ Nhai trầu Má 1 III 30_3 1 insGGC 10Gly11 Thêm (-) 2 75 Nữ Nhai trầu* Nướu 1 IV 34 81 GGC-AGC CAT-CAC G12S H27H Sai nghĩa Im lặng (-) 3 80 Nữ Nhai trầu Má 1 IV 37 GGT-CGT G13R Sai nghĩa (-) 4 53 Nam Hút thuốc Lưỡi 2 III 81 CAT-CAC H27H Im lặng Exon 5 5 69 Nữ Nhai trầu* Má 2 III 81 CAT-CAC H27H Im lặng Exon 8 6 70 Nam Hút thuốc Sàn m. 2 III 81 CAT-CAC H27H Im lặng Exon 7, 8 7 51 Nữ Nhai trầu* Má 1 IV 81 CAT-CAC H27H Im lặng Exon 8 8 52 Nữ Nhai trầu* Môi 1 IV (-) Exon 5 9 40 Nữ Không Má 2 IV (-) Exon 7 10 82 Nam Hút thuốc Lưỡi 1 III (-) Exon 7 11 73 Nữ Nhai trầu Má 1 II (-) Exon 8 *: Nhai trầu kèm xỉa thuốc lá Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 131 Bảng 2: Đột biến gen p53 và lâm sàng-giải phẫu bệnh UTHM Đặc điểm Tổng 18 ca Đột biến p53 8 ca (44,4%) Không đột biến p53 10 ca (55,6%) Tuổi ≤60 7 4 (57,1) 3 (42,9) >60 11 4 (36,4) 7 (63,6) Giới tính Nam 7 3 (42,9) 4 (57,1) Nữ 11 5 (45,5) 6 (54,4) Thói quen Nhai trầu 7 4 (57,1) 3 (42,9) Hút thuốc 7 3 (42,9) 4 (57,1) Không 4 1 (25,0) 3 (75,0) Vị trí Lưỡi 7 2 (28,6) 5 (71,4) Má 6 4 (66,7) 2 (33,3) Sàn miệng 2 1 (50,0) 1(50,0) Môi 2 1 (50,0) 1 (50,0) Nướu 1 0 (0) 1 (100) Giai đoạn I và II 3 1 (33,3) 2 (66,7) III và IV 15 7 (46,6) 8 (53,3) Độ mô học Độ 1 11 4 (36,4) 7 (63,6) Độ 2 7 4 (57,1) 3 (42,9) Bảng 3: Đột biến gen H-ras và lâm sàng-giải phẫu bệnh UTHM Đặc điểm Tổng 18 ca Đột biến H-ras 3 ca (16,7%) Không đột biến Hras 12 ca (83,3%) Tuổi ≤60 >60 7 11 0 (0) 3 (27,3) 7 (100) 8 (72,7) Giới tính Nam Nữ 7 11 0 (0) 3 (27,3) 7 (100) 8 (72,7) Thói quen Nhai trầu Hút thuốc Không 7 7 4 3 (42,9) 0 (0) 0 (0) 4 (57,1) 7 (100) 4 (100) Vị trí Lưỡi Má Sàn miệng Môi Nướu 7 6 2 2 1 0 (0) 2 (33,3) 0 (0) 0 (0) 1 (100) 7 (100,0) 4 (66,7) 2 (100) 2 (100) 0 (0) Giai đoạn I và II III và IV 3 15 0 (0) 3 (20,0) 3 (100) 12 (80,0) Độ mô học Độ 1 Độ 2 11 7 3 (27,3) 0 (0) 8 (72,7) 7 (100) BÀN LUẬN Khảo sát đột biến gen p53 và gen H-ras Hơn 30% ung thư ở người có đột biến trên 1 trong 3 gen ras: K-, N- và H-ras. Để phân tích đột biến gen ras, nghiên cứu này chọn khảo sát gen H-ras, vì đa số đột biến trong UTHM chỉ tìm thấy ở gen H-ras mà rất ít khi ở gen K-ras và N-ras(9). Gen H-ras nằm trên nhiễm sắc thể 11, chứa 4 exon mã hóa protein p21 (p21ras)(10). Nghiên cứu này chỉ phân tích exon 1 và exon 2 của gen H-ras, vì đây là những exon dễ bị đột biến nhất, có nhiều điểm nóng đột biến như codon 12 và 13 trên exon 1 (vùng gắn GTP), codon 61 (vùng GTPase) trên exon 2(8,9,10). Đột biến tại những vị trí này khiến cho protein luôn ở trạng thái được hoạt hóa (đột biến tăng chức năng). Kết quả nghiên cứu cũng tìm thấy đột biến H-ras tại codon 12 và 13. Trong nghiên cứu của Sathyan (2007)(9), đa số đột biến H-ras tại codon 12 (63%), tiếp theo là codon 13 (32%), codon 61 (5%). Gen p53 nằm trên nhiễm sắc thể 17. Việc giải trình tự gen p53 để tìm đột biến phức tạp hơn, mất nhiều thời gian hơn gen H-ras, vì gen p53 dài hơn (11 exon), thường phải khảo sát 4 exon từ exon 5 đến 8 là nơi tập trung đa số (87%) đột biến(2). Tỉ lệ đột biến gen p53 và H-ras Đột biến gen p53 ít xảy ra trong UTHM liên quan thói quen nhai trầu, do thường có tỉ lệ tương đối thấp ở nhiều nước châu Á phổ biến thói quen nhai trầu như Ấn Độ (17-21%), Myanmar (17,5%), Papua New Guinea (10%), Đài Loan (5,4%)(2,3,6). Tuy nhiên, chúng tôi đã phát hiện đột biến gen p53 trong UTHM với tỉ lệ tương đối cao 44,4% mặc dù trong mẫu nghiên cứu này cũng có 38,9% bệnh nhân có thói quen nhai trầu. Tỉ lệ này gần tương tự tỉ lệ đột biến gen p53 khá cao ở Nhật Bản (63%), Mỹ (53%), Pháp (67%) - nơi mà hút thuốc và uống rượu được xem là những yếu tố nguy cơ chính(1,2,7). Ngược lại, đột biến gen H-ras thường gặp trong UTHM ở người nhai trầu. Đột biến gen H- Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 132 ras chiếm tỉ lệ 12,5-35% ở Ấn Độ, và liên quan với thói quen nhai trầu(4,8,9), nhưng lại có tỉ lệ thấp 0-5% ở Anh, Nhật, Mỹ(7,9). Nghiên cứu này phát hiện tỉ lệ đột biến gen H-ras trong UTHM là 16,7%, và tất cả các ca đột biến đều có thói quen nhai trầu. Sự thay đổi nhiều về tỉ lệ đột biến gen p53 và ras trong UTHM giữa các nước chủ yếu do sự khác biệt về thói quen nguy cơ(1,10). Ngoài ra, có thể do sự khác nhau về kỹ thuật phát hiện, vị trí ung thư, chế độ dinh dưỡng, tình trạng răng miệng. Tỉ lệ tương đối cao 38,9% không có đột biến gen p53 và gen H-ras gợi ý UTHM còn do sự biến đổi của những gen và protein khác trong tế bào (như MDM2) hay do virus sinh ung thư (như virus gây bướu nhú ở người HPV). Trong UTHM, tỉ lệ đột biến gen p53 (44,4%) cao hơn tỉ lệ đột biến gen H-ras (16,7%). Nhìn chung, đột biến gen đè nén bướu p53 và oncogen H-ras tương đối phổ biến trong UTHM ở người Việt Nam. Kiểu đột biến gen p53 và H-ras Đa số đột biến trên gen p53 và trên gen H-ras là đột biến điểm. Đột biến trên gen p53 thường gặp đột biến sai nghĩa (87,5%) sản xuất protein p53 bị mất chức năng. Trong khi trên gen H-ras, thường gặp đột biến im lặng (62,5%) hơn đột biến sai nghĩa (25%) và đột biến thêm vào (12,5%). Tuy nhiên, nếu xét riêng đột biến làm thay đổi protein, đa số đột biến H-ras vẫn là đột biến sai nghĩa (66,7%). Theo y văn(2), nitrosamin trong thuốc lá nhai có thể alkylat hóa DNA ở vị trí nucleotid guanin (G) và thymin (T) dẫn tới chuyển vị G:C>A:T. Benzopyren trong khói thuốc lá có thể gây đột biến chuyển dạng G:C>T:A. Trong nghiên cứu này, đột biến chuyển vị (G:C>A:T) và đột biến chuyển dạng (như G:C>C:G) đều gặp trong đột biến gen p53 cũng như gen H-ras. Trong 2 ca đột biến sai nghĩa trên gen H-ras, một ca nhai trầu kèm xỉa thuốc có đột biến dạng chuyển vị G:C>A:T. Tất cả 5 đột biến im lặng hay đa hình nucleotid đơn (SNP) C81T giống nhau trên gen H-ras đều ở những bệnh nhân thường sử dụng thuốc lá (gồm 4 ca nhai trầu-xỉa thuốc và 1 ca hút thuốc), và cũng đều có đột biến chuyển vị (C:G>T:A). Kết quả phù hợp với y văn, cho thấy khả năng N-nitrosamin trong thuốc lá nhai hay xỉa gây đột biến gen H-ras. Đột biến gen H-ras và lâm sàng UTHM Đa số các nghiên cứu cho rằng đột biến gen p53 không liên quan với tuổi, giới tính, giai đoạn TNM, thói quen hút thuốc, nhai trầu; tuy nhiên cũng có nghiên cứu tìm thấy đột biến gen p53 liên quan với tiên lượng xấu(2,3,6). Các ca đột biến gen H-ras đều xảy ra ở nữ, có thói quen nhai trầu, vị trí ung thư ở niêm mạc má và nướu răng, ung thư ở giai đoạn trễ, bướu có độ ác tính mô học thấp. Trong nghiên cứu của Sathyan trên 152 ca UTHM ở Ấn Độ (2007)(9), đột biến H-ras liên quan có ý nghĩa với giới tính nữ nhiều hơn nam, diễn tiến không tái phát, tiên lượng tốt; nhưng không liên quan với di căn hạch, kích thước bướu, độ ác tính mô học, giai đoạn bệnh. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã phát hiện tỉ lệ tương đối cao đột biến gen p53 (44,4%) và H-ras (16,7%). Như vậy, đột biến gen p53 và H-ras thường hiện diện trong UTHM ở người Việt Nam. Không chỉ đột biến bất hoạt gen đè nén bướu p53, đột biến hoạt hóa oncogen H-ras đều có thể góp phần trong quá trình sinh ung thư ở hốc miệng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chitra G., Chandramouli A., Chanchal C. (2010). “P53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma”. Int J Pharm Biomed Res. 1(3). pp. 117-121. 2. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. (1994). “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clue to cancer etiology and molecular pathogenesis”. Cancer Research. 54. pp. 4855-4878. 3. Hsieh L.L., Wang P.F., Chen I.H., Liao C.T., Chen C.M., Chang C.J.T. (2001). “Characteristics of mutations in the p53 gene in oral squamous cell carcinoma associated with betael quid chewing and cigarette smoking in Taiwaneses”. Carcinogenesis. 22(9). pp. 1497-1503. 4. Munirajan A.K., Mohanprasad B.K.C., Shanmugam G., Tsuchida N. (1998). “Detection of a rare point mutation at Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 133 codon 59 and relatively high incidence of H-ras mutation in Indian oral cancer”. Int J Oncol. 13. pp. 971-974. 5. Murugan A.K., Hong N.T., Fukui Y., Munirajan A.K., Tsuchida N. (2008). “Oncogenic mutations of the PIK3CA gene in head and neck squamous cell carcinomas”. Int J Oncol. 32. pp. 101-111. 6. Nguyễn Thị Hồng, Phạm Hùng Vân, và cộng sự (2002). “Đột biến gen p53 trong ung thư miệng: phát hiện qua kỹ thuật PCR-SSCP”. Tạp chí Y học Tp.HCM. 4(6). Trang 52-57. 7. Sakai E., Rikimaru K., Ueda M., Matsumoto Y., Ishii N., Enomoto S., Yamamoto H. and Tsuchida N. (1992). “The p53 tumor-suppressor gene and ras oncogene mutations in oral squamous-cell carcinoma”. Int J Cancer. 52. pp. 867-872. 8. Saranath D., Chang S.E., Bhoite L.T., Panchal R.G., Kerr I.B, Mehta A.R., Johnson N.W., Deo M.G. (1991). “High frequency of mutation in codon 12 and 61 of H-ras oncogene in chewing tobacco-related human oral carcinoma of India”. Br J Cancer. 63. pp. 573-578. 9. Sathyan K.M., Nalinikumari K.R., Kannan S. (2007). “H-Ras mutation modulates the expression of major cell cycle regulatory proteins and disease prognosis in oral carcinoma”. Modern Pathol. 20. pp. 1141-1148. 10. Süzen S., Parry J.M. (2001). “Analysis of ras gene mutation in human oral tumours by polymerase chain reaction and direct sequencing”. Turk J Med Sci. 31. pp. 217-223.