Quy trình định týp gen CagA và VacA của Helicobacter pylori bằng phương pháp multiplex polymerase chain reaction

185 QUY TRÌNH ĐỊNH TÝP GEN CagA VÀ VacA CỦA Helicobacter pylori BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION Hồ Huỳnh Thùy Dương, Nguyễn Tuấn Anh, Trần Thiện Trung Địa chỉ liên lạc: PGS TS BS Trần Thiện Trung, Bộ môn Ngoại, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, ñiện thoại: 0903645659, Email: tranthientrung @ yahoo.com TÓM TẮT Chúng tôi xây dựng quy trình phát hiện và ñịnh týp gen cagA và vacA của vi khuẩn Helicobacter pylori (H. pylori) trong bệnh phẩm dựa trên kỹ thuật multiplex PCR. Quy trình ñược xây dựng bao gồm các bước kiểm tra mẫu, phát triển phương pháp tách chiết DNA, tối ưu hóa phản ứng multiplex PCR và xác ñịnh ñộ nhạy của phản ứng. Tiếp theo, quy trình ñược kiểm tra trên một số mẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày. Kết quả cho thấy quy trình có khả năng phát hiện và ñịnh týp chính xác gen cagA và vacA của vi khuẩn H. pylori một cách nhanh chóng và ñơn giản. Quy trình ñã ñược xây dựng thành công, có khả năng phát triển thành một phương pháp chẩn ñoán nhanh, chính xác và có thể ñược sử dụng như một công cụ nghiên cứu dịch tễ học sự nhiễm H. pylori, và tìm hiểu mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA với các biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày. ABSTRACT PROTOCOL FOR THE DETECTION OF VACA GENOTYPES AND CAGA GENE OF HELICOBACTER PYLORI FROM GASTRIC BIOPSIES BY A NOVEL MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION ASSAY We set up a multiplex PCR-based protocol for the detection and genotyping of cagA and vacA genes. The protocol includes clinical samples selection, DNA extraction, multiplex PCR optimization and sensitivity determination. The set up protocol was then applied to some gastric cancer and gastritis biopsies. We showed that this can be a rapid and simple method to detect and genotype H. pylori in clinical samples. The multiplex PCR protocol can be developed into a rapid and accurate diagnostic kit as well as a tool to study H. pylori infection epidemiology and the relationship between cagA and vacA genotypes with clinical manifestations in patients. ĐẶT VẤN ĐỀ Helicobacter pylori (H. pylori), xoắn khuẩn Gram âm có trong dạ dày người, ñược chứng minh là có liên quan ñến các bệnh về dạ dày-tá tràng và ung thư dạ dày (7). Các chủng H. pylori khác nhau có thể có ñộc tính khác nhau trong quá trình gây bệnh trên người (2). Nhiều gen của H. pylori ñược chọn ñể phát hiện sự hiện diện của vi khuẩn này trong bệnh phẩm (urease, rRNA 16S, gen bám-adhesion gene). Trong nghiên cứu này, chúng tôi quan tâm ñến hai gen cagA (cytotoxin- associated gene) và vacA (vacuolating toxin gene) vì sản phẩm của chúng ñược coi là hai yếu tố ñộc lực chủ yếu có khả năng gây bệnh và ñặc trưng của vi khuẩn H. pylori (1, 4). Sự kết hợp các týp gen khác nhau giữa hai gen này có thể liên quan ñến biểu hiện lâm sàng khác nhau ở người bệnh. Gen cagA có thể không có ở tất cả các chủng H. pyori. Sự hiện diện của gen cagA ở một chủng nào ñó thường có liên quan ñến những hậu quả lâm sàng nghiêm trọng cho người bị nhiễm (3). Protein cagA, có kích thước từ 128 ñến 140 kDa, có khả năng kích thích phản ứng phosphoryl hóa tyrosine trong tế bào ký chủ, dẫn ñến sự tăng sinh bất thường của các tế bào biểu mô dạ dày (9). Trong khi ñó, gen vacA có mặt ở tất cả các chủng H. pylori, cảm ứng hình thành không bào. Cấu trúc gen này chứa ít nhất hai vùng biến ñổi gồm vùng “tín hiệu” và vùng “giữa”. Vùng “tín hiệu” có thể có các týp gen là s1 hoặc s2. Vùng giữa có thể có các týp gen là m1 hoặc m2. Độc lực cao hay thấp của gen vacA phụ thuộc vào các týp gen của 186 hai vùng này. Chủng H. pylori với týp gen s1/m1 tạo ra ñộc tố mạnh hơn và có khả năng gây bệnh cao hơn các chủng khác, trong khi ñó chủng H. pylori với týp gen s2/m2 tạo ra ít hoặc không tạo ra ñộc tố (1). Việc phát hiện và phân týp H. pylori có thể ñược thực hiện bằng nhiều phương pháp như giải trình tự, PCR và lai phân tử với mẫu dò ñặc hiệu. Trong ñó, phương pháp PCR có nhiều ưu ñiểm như ñộ nhạy cao, thao tác nhanh, chi phí thấp. Phương pháp PCR ñã ñược sử dụng thành công ñể phát hiện và phân týp cagA và vacA trực tiếp từ mẫu sinh thiết dạ dày và còn ñược dùng ñể phát hiện H. pylori từ nhiều nguồn mẫu khác nhau như dịch dạ dày, nước bọt, mảng cao răng và phân người (10). Ngoài ra, việc áp dụng kỹ thuật multiplex PCR còn cho phép phát hiện và ñịnh týp ñồng thời các gen vacA và cagA chỉ trong một phản ứng. Nghiên cứu này nhằm xây dựng qui trình multiplex PCR ñể ñịnh týp gen cagA và vacA của H. pylori từ mẫu sinh thiết dạ dày của bệnh nhân viêm và ung thư dạ dày có H. pylori-dương tính. Từ ñó phát triển một phương pháp chẩn ñoán nhanh và chính xác nhiễm H. pylori, ñồng thời cung cấp một công cụ nghiên cứu dịch tễ học nhiễm H. pylori, và một phương pháp ñể tìm hiểu mối liên quan giữa các týp gene cagA và vacA với các biểu hiện lâm sàng ở bệnh nhân ung thư và viêm dạ dày. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh phẩm của bệnh nhân ung thư dạ dày ñược lấy sau phẫu thuật cắt 2/3 dạ dày, và mẫu mô sinh thiết niêm mạc của bệnh nhân viêm dạ dày ñược lấy qua nội soi có kết quả H. pylori-dương tính bằng hai thử nghiệm CLO test hoặc giải phẫu bệnh ñược dùng cho nghiên cứu. Các bệnh nhân này ñược khám và ñiều trị tại Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian từ tháng 12/2008 ñến tháng 4/2010. Mẫu sinh thiết, kích thước khoảng 3-5 mm, giữ trong các eppendorf 1.5mL chứa sẵn dung dịch xử lý mô TS (TE và SDS), sẽ ñược cắt thật nhỏ, sau ñó vortex mạnh trong 10-15 giây và ủ ở nhiệt ñộ 700C trong 20 phút. Thêm vào 10 µL dung dịch proteinase K và ủ tiếp ở nhiệt ñộ 700C trong 20 phút hoặc 700C qua ñêm. Kết thúc giai ñoạn này, có thể tiến hành tách chiết DNA từ mẫu ñã xử lý hoặc giữ ở -200C cho ñến khi tách chiết. Việc tách chiết DNA bộ gen của H. pylori từ mẫu sinh thiết ñã xử lý ñược thực hiện theo nguyên tắc hấp phụ ñặc hiệu DNA lên pha rắn (màng silica). Nguyên tắc này ñã ñược ứng dụng thành công vào bộ kit tách chiết Cột “DNA column-based extraction kit” của chúng tôi và ñược tối ưu hóa cho việc tách chiết DNA từ mẫu mô sinh thiết dạ dày. Tất cả mọi thao tác ñều ñược thực hiện theo ñúng hướng dẫn trong bộ kit của nhà sản xuất. DNA bộ gen H. pylori sau khi tách chiết ñược dùng ñể tiến hành phản ứng multiplex PCR trong hệ thống PCR CFX96TM Real-Time (BioRad). Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U Taq DNA polymerase (Bio-Rad), 200 µM dNTPs, 2 mM MgCl2, 1X PCR Buffer, 200 nM mỗi loại mồi xuôi và ngược (IDT) gồm mồi cagA (8), vacA s1/s2 (6, 8), vacA m1/m2 (6, 8), 50 nM mồi chứng nội hGSTP (glutathione-S-transferase) (5) và 5 µl DNA tách chiết trong tổng thể tích phản ứng là 25µl. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR bao gồm 3 phút 30 giây ở 950C, 40 chu kỳ lặp lại gồm 20 giây ở 940C, 40 giây ở 600C và 40 giây ở 720C, và cuối cùng là 6 phút ở 720C. Sản phẩm nhân bản ñược quan sát qua ñiện di trên gel agarose 3% nhuộm ethidium bromide (0.2mg/mL) với thang phân tử 100 bp (Bio-Rad). Mẫu DNA H. pylori chứng trong các phản ứng PCR là các sản phẩm nhân bản có týp gen cagA (+) vacA s1m1 và cagA (+) vacA s1m2 ñược xác ñịnh bằng phương pháp giải trình tự. KẾT QUẢ 1. Xây dựng quy trình multiplex PCR. Bước ñầu tiên là kiểm tra hoạt ñộng của các mồi (primer) sử dụng ñể phát hiện H. pylori và ñể ñịnh týp các gene vacA và cagA. Kết quả ñiện di các sản phẩm của phản ứng multiplex PCR (hình 1) tương ứng với các kiểu gen cagA (+)/(-) , vacA s1/s2, vacA m1/m2 và gen hGSTP từ mẫu sinh thiết chứa H. pylori của 4 bệnh nhân. 187 Kết quả cho thấy các sản phẩm PCR tạo ra có kích thước phù hợp với kích thước dự kiến: vacA m1/m2 (567/642 bp), cagA (349 bp), vacA s1/s2 (259/286 bp) và hGSTP (192 bp). Tín hiệu thu ñược mạnh và ñặc hiệu, không có sản phẩm ký sinh. Điều này cho thấy bộ mồi gồm 4 cặp mồi sử dụng trong phản ứng multiplex PCR hoạt ñộng tốt với nồng ñộ và chương trình ñã xác ñịnh. Các sản phẩm nhân bản ñược kiểm tra bằng giải trình tự cho thấy phù hợp với trình tự gen của H. pylori ñã công bố (kết quả không trình bày ở ñây). Hình 1: Kết quả multiplex PCR phát hiện và phân týp gen cagA và vacA của H. pylori Giếng (+), chứng dương là DNA H. pylori có kiểu gen cagA (+), vacA s1m2; giếng (-), chứng âm; giếng 1, cagA (-), vacA s1m2; giếng 2, cagA (+), vacA s1m2; giếng 3, cagA (+), vacA s1m1. Giếng 4, cagA (-), vacA s2m2; giếng M, thang phân tử 100-bp (Bio-Rad) Bước tiếp theo, chúng tôi kiểm tra tính phù hợp của hai loại mẫu dùng trong phát hiện H. pylori, mẫu sinh thiết tươi và mẫu sinh thiết ñã xử lý CLO test. Kết quả (hình 2) cho thấy cả hai loại mẫu ñều cho tín hiệu mạnh và ñặc hiệu. Hình 2: Kết quả multiplex PCR trên mẫu mô tươi và mô sau khi thực hiện CLO test 188 Giếng M, thang phân tử 100 bp; giếng (-), chứng âm; giếng (+), chứng dương DNA H. pylori; giếng A, mẫu sinh thiết của người thứ nhất; giếng B, mẫu sinh thiết của người thứ hai. 2. Xác ñịnh ñộ nhạy của phương pháp multiplex PCR, trước tiên chúng tôi ñịnh lượng hàm lượng DNA bộ gen của H. pylori trong một số mẫu bằng kit ñịnh lượng H. pylori (Primer design). Sau ñó chúng tôi pha loãng mẫu theo bậc mười tới mức pha loãng 1.104 lần và xác ñịnh giới hạn phát hiện của phương pháp cho từng mẫu dựa trên kết quả ñịnh lượng nêu trên. Kết quả trên 3 mẫu (hình 3) cho thấy phương pháp cho phép phát hiện H. pylori lần lượt trong các mẫu là 48 bản sao/phản ứng (tương ứng với 10 bản sao/µL dịch DNA tách chiết), 132 bản sao/phản ứng (26 bản sao/µL DNA tách chiết) và 64 bản sao/phản ứng (12 bản sao/ µL DNA tách chiết). Hình 3. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của phương pháp mPCR. Giếng M, thang phân tử 100 bp; giếng 1, 2, 3, 4, 5: các bậc pha loãng 100, 101, 102, 103, 104 của dịch DNA từ mẫu A; giếng 6, 7, 8, 9, 10, tương tự ñối với mẫu B; giếng 11, 12, 13, 14, 15, tương tự ñối với mẫu C. 3. Áp dụng quy trình multiplex PCR ñể phát hiện týp gen và phân týp của H. pylori trên 30 mẫu bệnh phẩm viêm và ung thư dạ dày. Kết quả ñược trình bày trong bảng 1. Bảng 1. Kết quả multiplex PCR ñịnh týp gen vacA và cagA trên 30 bệnh phẩm Phát hiện H. pylori Định týp gen cagA, vacA Số mẫu (n=30) cagA (+) vacA s1m1 12 cagA (+) vacA s2m2 0 cagA (+) vacA s1m2 10 cagA (+) vacA s2m1 0 cagA (-) vacA s1m1 0 cagA (-) vacA s2m2 1 cagA (-) vacA s1m2 2 Dương tính cagA (-) vacA s2m1 0 Âm tính 5 189 Kết quả cho thấy trong 30 mẫu, quy trình phát hiện ñược 25 mẫu dương tính với H. pylori. Trong số các mẫu dương tính, có 12 mẫu có týp gen là cagA (+), vacA s1m1; 10 mẫu có týp gen là cagA (+), vacA s1m2; 1 mẫu có týp gen là cagA (-), vacA s2m2; và 2 mẫu có týp gen là cagA (-), vacA s1m2. BÀN LUẬN Để phát hiện và ñịnh týp H. pylori bằng PCR, nhiều phương pháp xử lý mẫu và tách chiết ñã ñược dùng với nhiều loại mẫu khác nhau. Với loại mẫu sinh thiết mẫu mô ung thư hoặc mẫu mô từ niêm mạc dạ dày, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết DNA dựa trên nguyên tắc hấp phụ trên pha rắn sau khi so sánh với một số phương pháp khác như phenol : chloroform : isoamyl alcohol, xử lý mô với nhiệt, xử lý cơ học (kết quả không trình bày ở ñây). Phương pháp hấp phụ DNA lên pha rắn an toàn với người sử dụng, có thao tác nhanh, ñơn giản và cho phép thu hồi một lượng lớn DNA tinh sạch. Ngoài ra, việc phát hiện thành công vi khuẩn H. pylori trong mẫu mô sinh thiết ñã xử lý và ñược vùi trong thử nghiệm CLO test, cho thấy kết quả không khác với mẫu mô sinh thiết tươi. Nghiên cứu của chúng tôi có thể cho phép giảm số lượng và số lần lấy mẫu mô sinh thiết trên người bệnh, vì từ một mẫu mô sinh thiết có thể sử dụng cho hai loại xét nghiệm là CLO test và PCR. Phản ứng multiplex PCR dùng phát hiện và ñịnh týp gen của vi khuẩn H. pylori ñạt hiệu quả và ñộ chính xác cao, với cường ñộ tín hiệu ñặc trưng cho từng gen không chênh lệch. Điều này cho thấy các ñiều kiện của phản ứng ñã ñược tối ưu hóa và phù hợp cho sự nhân bản của các gen. Kết quả áp dụng quy trình trên một số bệnh phẩm của bệnh nhân viêm và ung thư dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy ưu thế của týp gen cagA (+), vacA s1m1; và cagA (+), vacA s1m2. KẾT LUẬN Phương pháp multiplex PCR là một kỹ thuật chính xác và nhanh, cho phép phát hiện, và ñịnh danh các týp gen, các phân týp của vi khuẩn H. pylori từ mẫu mô sinh thiết niêm mạc dạ dày qua nội soi; hoặc từ bệnh phẩm phẫu thuật của bệnh nhân ñể phục vụ cho các nghiên cứu về dịch tễ học, bệnh học và ñiều trị. Kết quả của công trình này góp phần vào việc phát triển một phương pháp chẩn ñoán chính xác, ñơn giản và hiệu quả ñể phát hiện nhiễm vi khuẩn từ các chủng H. pylori khác nhau có các yếu tố ñộc lực với khả năng gây bệnh khác nhau ở bệnh nhân mắc các bệnh về viêm dạ dày, loét dạ dày-tá tràng và ung thư dạ dày. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atherton, J. C., P. Cao, R. M. Peek, Jr., M. K. Tummuru, M. J. Blaser, and T. L. Cover. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J Biol Chem 1995, 270:17771-7. 2. Atherton, J. C., R. M. Peek, Jr., K. T. Tham, T. L. Cover, and M. J. Blaser. Clinical and pathological importance of heterogeneity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori. Gastroenterology 1997, 112:92-9. 3. Blaser, M. J., G. I. Perez-Perez, H. Kleanthous, T. L. Cover, R. M. Peek, P. H. Chyou, G. N. Stemmermann, and A. Nomura. Infection with Helicobacter pylori strains possessing cagA is associated with an increased risk of developing adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res 1995, 55:2111-5. 4. De Martel, C., M. Plummer, L. J. van Doorn, J. Vivas, G. Lopez, E. Carillo, S. Peraza, N. Munoz, and S. Franceschi. Comparison of polymerase chain reaction and histopathology for the detection of Helicobacter pylori in gastric biopsies. Int J Cancer 2009. 5. Kangsadalampai, S., P. Rojpibulstit, T. Ratanavalachai, and P. Tomtitchong.. CagA-positive Helicobacter pylori and the gastroduodenal pathology. Thammasat Int. J. Sc. Tech 2005, Vol. 10. 190 6. Kumar, S., A. Kumar, and V. K. Dixit. Direct detection and analysis of vacA genotypes and cagA gene of Helicobacter pylori from gastric biopsies by a novel multiplex polymerase chain reaction assay. Diag Microbiol Infect Dis 2008, 62:366-73. 7. Marshall, B. J. Helicobacter pylori. Am J Gastroenterol 1994, 89:S116-28. 8. Park, C. Y., M. Kwak, O. Gutierrez, D. Y. Graham, and Y. Yamaoka.. Comparison of genotyping Helicobacter pylori directly from biopsy specimens and genotyping from bacterial cultures. J Clin Microbiol 2003, 41:3336-8. 9. Peek, R. M., Jr., M. F. Vaezi, G. W. Falk, J. R. Goldblum, G. I. Perez-Perez, J. E. Richter, and M. J. Blaser. Role of Helicobacter pylori cagA(+) strains and specific host immune responses on the development of premalignant and malignant lesions in the gastric cardia. Int J Cancer 1999, 82:520-4. 10. Rudi, J., A. Rudy, M. Maiwald, D. Kuck, A. Sieg, and W. Stremmel. Direct determination of Helicobacter pylori vacA genotypes and cagA gene in gastric biopsies and relationship to gastrointestinal diseases. Am J Gastroenterol 1999, 94:1525-31.