Realtime PCR định lượng RNA Mycobacterium Leprae có thể theo dõi khả năng vi khuẩn tồn lưu và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh phong

Bàn về sự hiện diện 16S rRNA và mRNA hsp18 trong các trường hợp bệnh nhân có ENL kéo dài tái diễn, sự tồn lưu các RNA này có phải từ các vi khuẩn đang hoạt động hay từ vi khuẩn “đang ngủ”? Một nghiên cứu đã xem xét vai trò in vitro của hsp18 M. leprae về sự tồn tại trong ký chủ cho rằng biểu hiện gen hsp18 có thể là một trong những yếu tố thuận lợi để M. leprae tồn tại kiên trì khi bị tác động và cơ chế phosphoryl hóa protein 18kDa là để cảm nhận và thích nghi với những thay đổi từ môi trường [10]. Ranque B (2007) nói rằng tồn lưu vi khuẩn sống là nguyên nhân của PƯP và tiếp tục duy trì MDT có thể làm giảm nguy cơ PƯP [11]. Tại Ấn Độ trên 23,5% các trường hợp bệnh phong tái phát có 15,1% bệnh nhân có ENL tái diễn từ 4 lần trở lên; hoặc việc rút ngắn MDT còn 12 tháng đã tăng gần gấp đôi tỷ lệ ENL từ trung bình đến nặng [12]. Saunderson PR (2011), cho rằng PƯP và viêm dây thần kinh là một vấn đề nghiêm trọng hơn cả tái phát, các đợt ENL nghiêm trọng và kéo dài hơn ở những bệnh nhân nhận MDT liều 12 tháng so với bệnh nhân nhận MDT 24 tháng, mặc dù tần số ENL là tương tự [12]. Báo cáo này cũng cho thấy: tồn lưu lượng 16S rRNA và mRNA hsp18 đo được trong các trường hợp có ENL kéo dài tái diễn, vì vậy nên xem xét chế độ điều trị MDT đối với các trường hợp này; và cần phải tính đến khả năng còn sống của vi khuẩn đặc biệt trong trường hợp có tình trạng ENL kéo dài tái diễn.

8 trang | Chia sẻ: hachi492 | Lượt xem: 18 | Lượt tải: 0

Bạn đang xem nội dung tài liệu Realtime PCR định lượng RNA Mycobacterium Leprae có thể theo dõi khả năng vi khuẩn tồn lưu và đánh giá hiệu quả điều trị bệnh phong, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 5(/7,0(351/151027(5,80/(35( 2 7( 7(22,. 11,.81721/8 1 , ,(88 ,(875(1321 Nguyễn Phúc Như Hà*1, Trần Lê Minh Đức1, Nguyễn Khánh Hòa1, Phạm Thị Hoàng Bích Dịu1, Nguyễn Thanh Tân1, Trần Xuân Việt1, Yuji Miyamoto2, Masanori Kai1, Vũ Tuấn Anh1 TÓM TẮT Theo dõi 56 bệnh nhân phong MB, phát hiện tại 11 tỉnh thuộc Miền Trung - Tây Nguyên Việt Nam, từ 4/2015 đến 6/2016, được điều trị liệu trình MDT 12 tháng, theo dõi định lượng các dấu ấn phân tử liên quan đến khả năng sống của Mycobacterium leprae là RLEP-DNA, 16S rRNA và mRNA gen hsp18, đánh giá sự thay đổi nhằm tiên lượng khả năng sống của vi khuẩn phong trong quá trình điều trị; Xác định mối liên quan giữa các chỉ số nói trên với nguy cơ xảy ra phản ứng phong và tình trạng phản ứng phong kéo dài, tái diễn nhằm theo dõi, đánh giá hiệu quả điều trị bệnh phong. Kết quả cho thấy: lượng 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae có thể tăng hoặc giảm trong một số thời điểm trong quá trình điều trị mà không phụ thuộc vào lượng DNA- RLEP. Lượng mRNA hsp18 hiện diện tại thời điểm chẩn đoán là có liên quan đến nguy cơ xảy ra phản ứng phong ENL trong quá trình MDT (OR=12,8, [2,06<OR<93,97] p=0,00087). Đến thời điểm hoàn thành điều trị có đến 25,5% và 19,1% bệnh nhân còn đo được lượng 16S rRNA và mRNA gen hsp18; tìm thấy mối liên quan giữa sự hiện diện 2 chỉ dấu phân tử này tại thời điểm kết thúc liệu trình MDT và khả năng ENL kéo dài tái diễn (OR=17,06; [2,48<OR<149,02]; và OR =13,67 [2,17<OR<98,79]). Đánh giá lâm sàng để quyết định thời điểm ngừng liệu trình MDT cần xem xét khả năng vi khuẩn tồn lưu sống dựa trên chỉ dấu 16S rRNA và mRNA hsp18 đặc biệt trên những bệnh nhân phong có ENL kéo dài, tái diễn. Từ khóa: Mycobacterium leprae, ENL, 16S rRNA, mRNA hsp18, bệnh phong, MDT. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh phong là bệnh nhiễm trùng mãn tính do Mycobacterium leprae gây nên, bệnh có thể để lại tàn tật nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời, chính những tàn tật này làm cho người bệnh bị kỳ thị. Mục tiêu của kiểm soát bệnh phong là giảm thiểu tàn tật bằng việc phát hiện bệnh sớm, trị liệu đầy đủ; điều trị phản ứng phong (PƯP) kịp thời và thích hợp nhằm ngăn chặn biến chứng do bệnh phong gây ra, đưa bệnh nhân hòa nhập với cộng đồng. Đa hóa trị liệu (MDT) đã mang lại nhiều thành công cho chương trình phòng chống bệnh phong trên thế giới và tại Việt Nam, tuy nhiên số 1 Bệnh viện Phong Da liễu Trung Ương Quy Hòa, Việt Nam 2 Trung tâm nghiên cứu Phong, Viện Quốc Gia các bệnh nhiễm khuẩn Nhật Bản *Tác giả chính: Nguyễn Phúc Như Hà Địa chỉ: Bệnh viện Phong Da liễu Trung Ương Quy Hòa. Số 1 Chế Lan Viên, Quy Nhơn, Bình Định Điện thoại: 0914462762 Email: nguyenphucnhuha@gmail.com DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC lượng bệnh nhân mới vẫn phát hiện hàng năm, điều trị bệnh nhân có PƯP nặng, kéo dài, tái diễn gặp nhiều khó khăn, bệnh phong tái phát hoặc kháng thuốc là khó chẩn đoán, khó kiểm soát. Trong quá trình điều trị bệnh phong nhóm MB, một lượng lớn vi khuẩn vẫn tồn tại rất lâu tại thương tổn da. Trên phết nhuộm Ziehl Neelsen, vi khuẩn bắt màu đồng đều được cho là còn sống, dạng hạt và đứt khúc được xem là vi khuẩn chết, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào chứng minh điều đó [1]. Ngoài ra, DNA vi khuẩn tồn tại một thời gian dài sau khi vi khuẩn chết, kỹ thuật PCR đã phát hiện DNA vi khuẩn phong ở mô da bệnh nhân đến vài năm sau khi đã hoàn thành MDT [2,3]. Bệnh nhân phong MB có nguy cơ lây truyền cao, phác đồ MDT được khuyến cáo là 12-24 tháng, tùy vào tình trạng lâm sàng mà thời điểm ngừng điều trị do bác sĩ quyết định, vì vậy cần thiết có thêm các bằng chứng phân tử hổ trợ lâm sàng để chọn thời điểm ngừng MDT một cách đúng đắn và thuyết phục. Đáp ứng với điều kiện của môi trường sống, vi khuẩn nói chung có thể thay đổi chuyển hóa, điều hòa các hoạt động tế bào, một trong số các hoạt động đó là điều hòa hoạt động gen, thể hiện qua lượng RNA, là các chỉ thị cho khả năng sống của vi khuẩn. Đối với mycobacteria, cơ sở phân tử cho rằng sự tồn tại rRNA và mRNA trong quá trình điều trị là bằng chứng vi khuẩn còn sống, có thể chưa đủ liều ảnh hưởng hoặc hoặc kháng thuốc [4,5]. Mục đích của nghiên cứu này là sử dụng kỹ thuật Realtime PCR định lượng DNA-RLEP, 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae từ tổn thương da bệnh nhân phong để đánh giá khả năng tồn lưu vi khuẩn sống dưới tác động của MDT hoặc khả năng kháng MDT; nhằm xác định thời điểm thích hợp để ngừng MDT; Nghiên cứu cũng tìm mối liên quan giữa sự tồn lưu vi khuẩn với khả năng xảy ra PƯP; với tình trạng kéo dài tái diễn của PƯP, nhằm hỗ trợ bác sĩ lâm sàng theo dõi, tiên lượng và đánh giá điều trị bệnh phong một cách hiệu quả. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả và nghiên cứu phòng thí nghiệm 2.2 Bệnh nhân, mẫu nghiên cứu và nội dung ng- hiên cứu 56 bệnh nhân phong MB mới, phát hiện từ 4/2015 đến 6/2016, tại 11 tỉnh khu vực Miền Trung - Tây Nguyên, điều trị MDT liệu trình 12 tháng (loại trừ bệnh nhân phong mắc kèm bệnh nhiễm mycobacteria khác). Mẫu gồm 202 mẫu sinh thiết da thương tổn phong, lấy tại 4 thời điểm: trước điều trị (T0); đã điều trị 1 tháng (T1), đã điều trị 6 tháng (T6) và lúc kết thúc điều trị 12 tháng (T12). Lưu giữ trong RNAlater ở -80oC đến khi li trích DNA và RNA. Sử dụng kỹ thuật Realtime PCR, đo lượng DNA-RLEP, 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae trong mẫu bệnh phẩm. Đánh giá xu hướng và mức độ thay đổi lượng DNA và RNA qua tỉ lệ % giữa các lần lấy mẫu sau so với khi chưa điều trị. Đánh giá trên từng bệnh nhân và trên quần thể bệnh nhân nghiên cứu; Xác định khả năng M. leprae “còn sống” qua sự tồn lưu các RNA. Đồng thời phân nhóm bệnh nhân theo tình trạng và thời điểm xảy ra PƯP, tìm mối liên quan giữa sự tồn lưu RNA và khả năng xảy ra PƯP, khả năng PƯP kéo dài, tái diễn trong quá trình điều trị. Lượng DNA, RNA là số lượng bản sao biểu diễn hàm số Log10. Tỉ số RNA/DNA gen 16S rRNA và hsp18 nhận định lượng RNA gen tương ứng. Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC Sử dụng tỉ số RNA/DNA để hạn chế sai lệch lượng RNA nếu khối lượng mẫu khác nhau. Phân tích dữ liệu bằng thuật toán thống kê SPSS, mô tả giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn với biến số có phân phối chuẩn, hoặc trung vị (khoảng tứ phân vị) đối với biến có phân phối lệch. Mô hình tuyến tính đánh giá sự thay đổi các biến. Mối tương quan phân tích theo OR. 2.3 Các kỹ thuật phòng xét nghiệm Thực hiện tại khoa Sinh học Phân tử, bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy Hòa. Li trích Nucleic Acide (NA) M. leprae từ mảnh sinh thiết da: sử dụng bộ sinh phẩm DNaesy và RNaesy (Invitrogen), NA sau khi li trích bảo quản -80oC với RNA và -20oC với DNA. RT-PCR chuyển RNA thành cDNA: bộ sinh phẩm “ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover” (ToYoBo, Nhật Bản), chứa enzyme phiên mã ngược (mutant M-MLV), enzyme loại bỏ DNA, mồi ngẫu nhiên và mồi oligo dT. Phản ứng kiểm soát được thực hiện ở mỗi mẫu để xác định DNA đã bị loại bỏ, kiểm chứng cho phản ứng định lượng RNA. Realtime PCR định lượng DNA- RLEP, 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae, thiết bị 7500 Fast Amplied Biosystem, phần mềm phân tích 7500- v2.3. Độ nhạy xác định là 10 copies của plasmid tái tổ hợp pGEMT101, cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu Phong - Viện Quốc gia các bệnh nhiễm khuẩn Nhật Bản. Mồi P2 và P3 chọn từ trình tự gen 16S rRNA M. leprae, sản phẩm 171bp [5]. Mồi hsp18-F và hsp18-R chọn từ trình tự gen hsp18 M. leprae, sản phẩm 148bp [2]. Mồi RLEP-F và RLEP-R chọn từ vùng RLEP 37 copies đặc hiệu của M. leprae, sản phẩm 76bp [6]. 3. KẾT QUẢ 3.1 Sự thay đổi DNA-RLEP, 16S rRNA và mRNA hsp18 của M. leprae trên từng bệnh nhân Sử dụng mô hình ảnh hưởng hỗn hợp (Mixed- eects model), giả định mức NA ban đầu T0 là 1=100%, mức thay đổi đánh giá bằng tỉ lệ % của lần lấy mẫu sau so với thời điểm T0. Mỗi biểu đồ biểu diễn xu hướng thay đổi lượng NA cho từng bệnh nhân, 3 biểu đồ tương ứng với sự thay đổi của RLEP-DNA, 16S rRNA và mRNA gen hsp18 trên 56 bệnh nhân. DNA-RLEP 16S rRNA mRNA hsp18 Biểu đồ 1. Sự thay đổi DNA-RLEP, 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae trên từng bệnh nhân trong quá trình điều trị DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3.2 Sự phân bố và tỉ lệ thay đổi lượng DNA-RLEP, 16R rRNA và mRNA gen hsp18 trung bình của bệnh nhân nghiên cứu trong quá trình điều trị Bảng 1. Sự phân bố và tỉ lệ thay đổi lượng DNA-RLEP, 16R rRNA và mRNA gen hsp18 trung bình của bệnh nhân nghiên cứu trong quá trình điều trị Thời điểm % (+) Giá trị trung bình mẫu NC Tỉ lệ thay đổi so với T0 Biểu đồ 2 .Sự phân bố và xu hướng thay đổi theo tỉ lệ DNA - RLEP log10 (%) T0 100 5,05 ± 1,22 100± 0,0 T1 100 4,91 ± 1,21 97,94 ± 20,9 T6 100 4,11 ± 1,20 82,14 ± 21,5 T12 100 3,58 ± 1,22 64,97 ± 26,4 p<0,001 R2 = 0,33 y= -2,9x+100,3 16R rRNA rRNA/DNA % T0 100 0,93 ± 0,48 100± 0,0 T1 100 0,82 ± 0,47 72,59 ± 59,8 T6 100 0,57 ± 0,47 64,07 ± 51,3 T12 25,5 0,27 ± 0,47 28,51 ± 42,5 χ 2 =65.012, p = 4.986e-14 y = -5.1x +90.3 R2 =0,22 mRNA hsp18 mRNA/DNA % T0 64,3 0,519 ± 0,399 100 ± 0,0 T1 58,1 0,296 ± 0,399 43,43 ± 65,5 T6 25,0 0,150 ± 0,269 22,17 ±35,0 T12 19,1 0,079 ± 0,250 13,42 ± 38,8 χ 2 =56.629, p = 3.084e-12 y = -5,6x +71.6 R2=0,25 100% số mẫu cho kết quả (+) với DNA cả 3 gen tại 4 thời điểm lấy mẫu; không giống DNA, định lượng 16S rRNA tại T12 còn 25,5% bệnh nhân còn đo được lượng 16S rRNA. Khác hơn đối với mRNA gen hsp18 là chỉ có 64% mẫu dương tính tại T0 và tại T12 còn 19,2% số mẫu còn dương tính. Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3.3 Mối liên quan giữa thời điểm xảy ra PƯP, tình trạng PƯP và hiện diện 16S rRNA và mRNA gen hsp18 Có 39/56 bệnh nhân phong có PƯP xảy ra, hầu hết là PƯP loại II, ENL, được phân 3 nhóm theo thời điểm xảy ra ENL (bảng 2). Đến thời điểm T12, còn có 15 trường hợp có ENL vẫn kéo dài (>12 tuần điều trị ENL) và tái diễn (>1 đợt điều trị ENL) trong quá trình MDT. Bảng 2. Nhóm bệnh nhân theo thời điểm xảy ra PƯP Thời điểm xảy ra PƯP Số BNn=56 OR χ2 = 3,621 p=0,047 Nhóm 1: PƯP xảy ra trước khi điều trị bệnh phong (PƯP(T0). 20 (35,7%) 1,33 Nhóm 2: PƯP xảy ra trong quá trình MDT (PƯP(#) Tháng thứ I: 4 bệnh nhân Tháng II đến VI: 8 bệnh nhân Tháng VI-XII: 7 bệnh nhân 19 (33,9%) 1,27 Nhóm 3: không có PƯP xảy ra (PƯP(-); 12 (21,4%) 1 Bảng 3. Mối liên quan giữa thời điểm xảy ra ENL, tình trạng ENL và mRNA hsp18 và 16S rRNA mRNA hsp18 (+) tại thời điểm T0 Dương tính Âm tính Cộng BN OR=7,2 (1,38<OR<41,63) p=0,0055 ENL xảy ra trước MDT 15 5 20 Không có ENL xảy ra 5 12 17 mRNA hsp18 (+) tại thời điểm T0 OR=12,8 (2,06<OR<93,97) p=0,00087 ENL xảy ra trong MDT 16 3 19 Không có ENL xảy ra 5 12 17 mRNA hsp18 vẫn còn (+) đến kết thúc MDT Dương tính Âm tính Cộng BN OR =17,06 (2,48<OR<149,02 p=0,00016 ENL kéo dài tái diễn 7 8 15 Không còn ENL 2 39 41 16S rRNA vẫn còn (+) đến kết thúc MDT Dương tính Âm tính Cộng BN OR =13,67 (2,17<OR<98,79 p=0,0003 ENL kéo dài tái diễn 6 3 9 Không còn ENL 6 41 47 Đối với gen 16S rRNA không phân tích liên quan với trường hợp ENL xảy ra trước MDT vì 100% mẫu biểu hiện có 16S rRNA Dương tính tại thời điểm T0. DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 4. BÀN LUẬN 4.1 Xu hướng và sự thay đổi DNA-RLEP, 16S rRNA và mRNA hsp18 của M. leprae trên từng bệnh nhân Trên hầu hết bệnh nhân phong lượng DNA- RLEP giảm dần, rất chậm, xu hướng chung là giống nhau. Điều này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết về sự tồn lưu DNA của các vi sinh vật nói chung và mycobacteria nói riêng, rằng DNA có thể tồn lưu một thời gian dài sau sự chết đi của vi khuẩn [2, 3]. Sự thay đổi 16S rRNA và mRNA hsp18 của M. leprae là khác nhau trên mỗi bệnh nhân, khác nhau trên từng thời điểm, khác nhau ở mỗi gen và không phụ thuộc lượng DNA (Biểu đồ 1), như vậy khả năng hoạt động của M. leprae trên mỗi vật chủ là hoàn toàn khác nhau, có thể phụ thuộc vào đáp ứng miễn dịch và khả năng dung nạp thuốc của vi khuẩn trên vật chủ đó, vì vậy gây nên bệnh cảnh lâm sàng khác nhau mặc dù cùng liệu trình MDT [4,5]. 4.2 Sự phân bố và tỉ lệ thay đổi lượng DNA- RLEP, 16S rRNA và mRNA hsp18 trung bình của bệnh nhân nghiên cứu trong quá trình điều trị Một số nghiên cứu về sự thay đổi 16S rRNA của M. leprae trong MDT, thực hiện trên số lượng mẫu nhỏ hoặc thử nghiệm in vitro, cũng đã đưa ra những nhận xét: Alejandra N (2009) định lượng 16S rRNA và mRNA gen sodA trên mẫu lâm sàng qua tỉ số 16S rRNA/DNA-RLEP và mRNA sodA/DNA-RLEP cũng cho thấy tỉ lệ 16S rRNA và mRNA sodA giảm trong MDT [6]. Giả định sự hiện diện như là một chỉ dấu ấn phân tử cho khả năng còn “sống” của vi khuẩn, thì kết quả nghiên cứu này biểu 16S rRNA hiện sự “chết” của vi khuẩn từ thời điểm T6 đến T12 (100% số mẫu dương tính tại T6, đến T12 đã giảm xuống còn 25,5% Dương tính (Bảng 1), tuy nhiên đến 12 tháng MDT vẫn còn 25,5% trường hợp tồn lưu 16S rRNA hay tồn lưu vi khuẩn “sống”. Gue Tae Chae (2002) định tính mRNA hsp18 tại các thời điểm 0, 3 và 12 tháng, cho thấy mRNA đã âm tính tại thời điểm 12 tháng của MDT [3]. Grace L. Davis (2013) đánh giá tác động của Rifapicin, dựa trên lượng mRNA của gen esxA và hsp18 của M. leprae gây nhiễm trên gan chân chuột trần, nhận định: lượng DNA-RLEP và mRNA là giống nhau tại thời điểm 4 tháng, tuy nhiên đến thời điểm 8 tháng thì lượng mRNA của vi khuẩn đã giảm đi đáng kể [7]. Giả định về khả năng còn sống của M. leprae biểu hiện bởi lượng 16S rRNA và mRNA hsp18 thì những bệnh nhân còn đo được lượng RNA tại thời điểm T12 được giải thích như thế nào? liệu những chủng vi khuẩn này có khả năng chết trong thời gian tiếp theo hay không? hay có khả năng còn sống và tăng sinh trở lại gây tái phát bệnh do vi khuẩn phong tồn lưu? những trường hợp này có nên theo dõi như là một tình trạng chưa đủ liều MDT tác động lên vi khuẩn và cần thiết kéo dài liệu trình MDT? Thời điểm quyết định ngưng MDT nên chăng xem xét sự tồn lưu các chỉ dấu phân tử 16S rRNA và mRNA hsp18. 4.3 ENL và mối liên quan với 16S rRNA và mRNA hsp18 trong quá trình điều trị Kết quả Bảng 3 cho thấy: Có mối liên quan giữa biểu hiện hsp18 và sự xuất hiện ENL. Bệnh nhân phong tại thời điểm ban đầu đã có ENL có liên quan với mRNA hsp18 dương tính tại T0, tần suất nguy cơ là 7,2 lần so với nhóm Âm tính; Tương tự, những bệnh nhân phong nếu có xét nghiệm mRNA hsp18 dương tính thì nguy cơ xảy ra ENL trong quá trình điều trị cao gấp 12,8 lần so với nhóm bệnh phong có mRNA hsp18 Âm tính tại T0; Dellagostin OA (1995) cho rằng kháng nguyên 18kDa, được mã Số26(Tháng08/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC hóa bởi gen hsp18, được kích hoạt phiên mã trong quá trình tăng trưởng nội bào và có liên quan đến sự sống còn của M. leprae trong các đại thực bào [8], Nirmala Lini (2009), định lượng mRNA gen hsp18 của M. leprae của 47 bệnh nhân phong trong MDT cho thấy: một lượng đáng kể hsp18 mRNA cũng được tìm thấy trong các trường hợp có PƯP, phát hiện này đưa ra một đề xuất là cần xem xét liệu trình MDT trong các trường hợp có PƯP để loại bỏ mầm bệnh còn sót lại, cũng có thể là một phương pháp tốt để kiểm soát các PƯP muộn và tái phát [3]. Như vậy: mRNA hsp18 Dương tính tại thời điểm ban đầu, là một chỉ dấu có thể dự báo nguy cơ xảy ra ENL trong quá trình điều trị. Đây là cơ sở để đề xuất nên giám sát, điều trị sớm PƯP, tương tự như nghiên cứu Bernink (1997) về can thiệp điều trị phòng ngừa PƯP để phòng chống tổn hại thần kinh [9]. Bàn về sự hiện diện 16S rRNA và mRNA hsp18 trong các trường hợp bệnh nhân có ENL kéo dài tái diễn, sự tồn lưu các RNA này có phải từ các vi khuẩn đang hoạt động hay từ vi khuẩn “đang ngủ”? Một nghiên cứu đã xem xét vai trò in vitro của hsp18 M. leprae về sự tồn tại trong ký chủ cho rằng biểu hiện gen hsp18 có thể là một trong những yếu tố thuận lợi để M. leprae tồn tại kiên trì khi bị tác động và cơ chế phosphoryl hóa protein 18kDa là để cảm nhận và thích nghi với những thay đổi từ môi trường [10]. Ranque B (2007) nói rằng tồn lưu vi khuẩn sống là nguyên nhân của PƯP và tiếp tục duy trì MDT có thể làm giảm nguy cơ PƯP [11]. Tại Ấn Độ trên 23,5% các trường hợp bệnh phong tái phát có 15,1% bệnh nhân có ENL tái diễn từ 4 lần trở lên; hoặc việc rút ngắn MDT còn 12 tháng đã tăng gần gấp đôi tỷ lệ ENL từ trung bình đến nặng [12]. Saunderson PR (2011), cho rằng PƯP và viêm dây thần kinh là một vấn đề nghiêm trọng hơn cả tái phát, các đợt ENL nghiêm trọng và kéo dài hơn ở những bệnh nhân nhận MDT liều 12 tháng so với bệnh nhân nhận MDT 24 tháng, mặc dù tần số ENL là tương tự [12]. Báo cáo này cũng cho thấy: tồn lưu lượng 16S rRNA và mRNA hsp18 đo được trong các trường hợp có ENL kéo dài tái diễn, vì vậy nên xem xét chế độ điều trị MDT đối với các trường hợp này; và cần phải tính đến khả năng còn sống của vi khuẩn đặc biệt trong trường hợp có tình trạng ENL kéo dài tái diễn. 5. KẾT LUẬN Lượng mRNA hsp18 biểu hiện cao tại thời điểm chẩn đoán có thể tiên lượng khả năng xảy ra ENL trong quá trình điều trị. Sử dụng chỉ dấu phân tử 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae có thể nhận định khả năng còn sống của vi khuẩn phong. Tồn lưu các chỉ dấu phân tử này đến thời điểm kết thúc MDT là có liên quan với tình trạng ENL kéo dài, tái diễn trong quá trình điều trị. Các chỉ dấu 16S rRNA và mRNA gen hsp18 nên được sử dụng để hổ trợ bác sỹ lâm sàng quyết định nên kéo dài liệu trình MDT, đặc biệt trên các trường hợp bệnh phong có ENL kéo dài, tái diễn. Kỹ thuật Realtime PCR định lượng 16S rRNA và mRNA gen hsp18 của M. leprae trong quá trình điều trị bệnh phong có thể theo dõi, tiên lượng và đánh giá hiệu quả điều trị PƯP/ điều trị bệnh phong. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. WHO. Microbiology of M. leprae. http:// www.who.int/lep/microbiology/en/. 2. Chae GT, et al. DNA-PCR and RT-PCR for the 18-kDa gene of Mycobacterium leprae to assess the ecacy of multidrug therapy for leprosy. Journal of medical microbiology, 2002; 51(5): 417-422. DALIỄUHỌCSố26(Tháng08/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3. Lini N., Shankernarayan N. P. và Dharmalingam K. Quantitative real-time PCR analysis of Mycobacterium leprae DNA and mRNA in human biopsy material from leprosy and reactional cases. J Med Microbiol, 2009; 58: 753-759. 4. Hui MP, Foley PL, Belasco JG, et al. Messenger RNA degradation in bacterial cells. Annu Rev Genet, 2014; 48: 537–559 5. Martinez Alejandra N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of realtime PCR. Journal of clinical microbiology, 2009; 47(7): 2124-2130. 6. Kang TJ, et al. Comparison of two dierent PCR amplication products (the 18kDa protein gene vs. RLEP repetitive sequence) in the diagnosis of Mycobacterium leprae. Clinical and experimental dermatology, 2003; 28(4): 420-424. 7. Davis G.L, et al. Molecular assays for determining Mycobacterium leprae viability in tissues of experimentally infected mice. PLoS neglected tropical diseases, 2013; 7(8): e2404. 8. Dellagostin O.A, et al. Activity of mycobacterial promoters during intracellular and extracellular growth. Microbiology, 1995; 141(8): 1785-1792. 9. Bernink EH, Voskens JE, et al. Study on the detection of leprosy reactions and the eect of prednisone on various nerves, Indonesia. Leprosy review, 1997; 68(3):225-232. 10. Lini Nirmala, et al. Functional characterization of a small heat shock protein from Mycobacterium leprae. BMC microbiology, 2008; 8(1): 208. 11. Ranque Brigitte, et al. Age is an important risk factor for onset and sequelae of reversal reactions in Vietnamese patients with leprosy. Clinical Infectious Diseases, 2007; 44(1):33-40. 12. Voorend Carlijn GN, Post Erik B, et al. A systematic review on the epidemiological data of erythema nodosum leprosum, a type 2 leprosy reaction. PLoS neglected tropical diseases, 2013; 7(10): e2440. ABSTRACT Follow-up of 56 MB leprosy patients, new detected in 11 provinces in the Central and Highlands of Vietnam, from Apr 2015 to Jun 2016, treated with MDT for 12 months, quantitative monitoring of molecular markers that viability of Mycobacterium leprae are RLEP-DNA, 16S rRNA and hsp18 gene mRNA, evaluating the changing during treatment to determine the relationship between the above indicators changes with the risk of current and situation of prolonged, recurrent of the leprosy reactions, to evaluate the eect of leprosy treatment. The results showed that the amount of 16S rRNA and mRNA hsp18 gene of M. leprae may increase or decrease at some point in the course of treatment irrespective of the amount of RLEP-DNA. The mRNA hsp18 gene present at the time of diagnosis is associated with the risk of ENL happen under MDT (OR = 12.8, [2.06 <OR <93.97]; p = 0, 00087). At the time of completion of MDT (12 months) up to 25.5% and 19.1% of patients still measured 16S rRNA and mRNA hsp18 gene; found a relationship between the presence of two molecular markers at the end of MDT, the presence of these markers relative with risk of persistence and recurrent ENL during MDT (OR = 17.06; [2.48 <OR <149.02] and OR = 13.67 [2.17 <OR <98.79]). Clinical evaluations to determine the time to stop MDT should be considered the viability of M. leprae or the presence of 16S rRNA and the mRNA hsp18, specically in the leprosy patients with persistent, recurrent ENL during MDT. Keywords: Leprosy, Mycobacterium leprae, ENL, MDT, 16S rRNA, mRNA hsp18.

Các file đính kèm theo tài liệu này:

realtime_pcr_dinh_luong_rna_mycobacterium_leprae_co_the_theo.pdf