Sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn Fitc

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 42 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ CHỐNG Fcγ NGƯỜI GẮN FITC Nguyễn Lê Trang*, Phạm Hoàng Phiệt*, Lê Thị Thanh, Nguyễn Thị Huyền Ngọc, Âu Thị Chi Lan, Nguyễn Thị Nguyệt Thu TÓM TẮT Đặt vấn đề: Việc trang bị phòng thí nghiệm ngày một tốt hơn kèm với đội ngũ những người làm chuyên về hóa miễn dịch hiện có trong phạm vi Tp Hồ chí Minh, chúng tôi tin rằng mình có thể sản xuất được một số sinh phẩm miễn dịch có chất lượng dùng trong phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này chúng tôi đặt mục tiêu là sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn FITC dùng trong miễn dịch huỳnh quang tổ chức. Vật liệu, phương pháp và kết quả: Sơ chế IgG người được thực hiện bằng việc cho tủa tập họp huyết thanh người bình thường trong Ammonium Sulfate 45% bão hòa. IgG sơ chế này được xử ly với Papain để cắt làm Fcγ và Fab. Dùng cột SKAL Agarose-Protein A để thu hồi Fcγ tinh khiết. Kháng nguyên Fcγ người được gây miễn dịch cho thỏ để thu hồi kháng thể thỏ chống Fcγ. Phân lập kháng thể đặc hiệu khỏi globuline miễn dịch chung của thỏ bằng cột SKAL- Fcγ người. Kháng thể thỏ đặc hiệu này được cộng hợp với FITC để có kháng thể huỳnh quang đặc hiệu. Kháng thể huỳnh quang tự sản xuất của chúng tôi có hệ số F/P là 1,8 và hàm lượng IgG là 7,6mg/ml. Sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang tổ chức để phát hiện tự kháng thể thì kháng thể huỳnh quang tự chế của chúng tôi ít nhất cũng tương đương với kháng thể huỳnh quang mà chúng tôi mua từ công ty DAKO. Từ khóa: sắc ký ái lực, miễn dịch huỳnh quang, globuline miễn dịch, Fcγ ABSTRACT PRODUCTION OF FITC CONJUGATED RABBIT ANTI HUMAN FCΓ Nguyen Le Trang, Nguyen Thi Huyen Ngoc, Le Thi Thanh, Au Thi Chi Lan, Nguyen Thi Nguyet Thu, Pham Hoang Phiet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 42 - 46 Background: With the improvement of Laboratory equipments and our team Immunochemical experts available now in HCM city we believe that we are able to produce many immuno reagents commonly used in our laboratory. In this study,we aim to produce the FITC conjugated Rabbit anti human Fcγ. Materials, methods and results: For production of purified human Fcγ, we precipitate a pooled human serum with 45% SAS then digeste the precipitated human IgG with Papain. The purified human Fcγ was obtained from digested IgG by using the Agarose-Protein A Column. Rabbits were immunized with this purified human Fcγ to get antiserum. Then specific Rabbit antibody against human Fcγ were collected by using human Fcγ affinity column. The specific Rabbit antibody was conjugated with FITC to produce fluorescent specific Rabbit antibody anti human Fcγ. Our fluorescent antiserum has the F/P ratio of 1.8 and the IgG concentration of 7.6mg/ml. In Fluorescent Immuno histo chemistry technique to detectect auto antibodies, our fluorescent antiserum is at least as good as those bought from DAKO company.  Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh  Bệnh viện Nhi đồng 2 TP Hồ Chí Minh  Bộ môn Miễn dịch, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh  Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Địa chỉ liên hệ: CN. Lê Thị Thanh ĐT: 0908421927. Email: lethanh_9999@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 43 Key words: affinity chromatography, immunofluorescent, immunoglobulin. MỞ ĐẦU Phát hiện sự có mặt của globuline miễn dịch người được sử dụng để chẩn đoán trong nhiều bệnh lý nhiễm khuẩn và bệnh tự miễn. Cho đến nay chúng ta vẫn phải nhập thuốc thử của ngước ngoài với giá không rẻ và phải chờ đợi sau khi đặt hàng. Với việc trang bị máy móc về hóa miễn dịch hiện nay của các phòng nghiên cứu, các bệnh viện cùng với đội ngũ cán bộ chuyên ngành hóa miễn dịch sẵn có vvchúng tôi nghĩ rằng chúng ta hoàn toàn có khả năng tự sản xuất được một số sản phẩm sinh học thông dụng cho chẩn đoán miễn dịch với chất lượng không thua kém các sản phẩm mua từ nước ngoài. Trong nghiên cứu này chúng tôi đặt mục đích là sản xuất được kháng thể đa dòng của thỏ gắn FITC chống Fcγ người là thí điểm ban đầu. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các hóa chất và vật liệu chuyên biệt dung trong nghiên cứu này bao gồm: - Cột sắc ký ái lực Agarose – Protein A của hãng BioRad. - Tá dược FCA và FIA của hãng Sigma. - CNBr – Sepharose hoạt tác dạng khô của hãng Amersham. - Papaine (Mercuripapain) hãng Sigma. - FITC của hãng Sigma (mã P3125). - Kháng thể thỏ chống chuỗi nặng gamma người cộng hợp FITC của hãng DAKO (có hệ số F/P = 2,65 và hàm lượng IgG là 3mg/ml) dùng để so sánh. Các hóa chất thông thường để pha đệm các loại mua của hãng Amersham, Sigma. Tập hợp huyết thanh người bình thường được tích lại từ các đối tượng kiểm tra sức khỏe mà kết quả bình thường và âm tính với HBsAg, anti HCV và anti HIV được giữ trong tủ lạnh sâu – 20oC đến lúc sử dụng. Các công đoạn của quá trình sản xuất Fcγ người được thực hiện như sau: - Sơ chế IgG người: huyết thanh người sau khi đã rã đông được tập hợp lại và ly tâm 6000 vòng/30 phút. Hút phần trong và loại bỏ cặn. Phần huyết thanh này được pha loãng ½ trong đệm Sodium Phosphate 0,1M – pH 7.2. Khuấy nhẹ trên máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng và từ từ nhỏ vào trong huyết thanh dung dịch Ammonium Sulfate bão hòa một thể tích để có độ bão hòa là 45% - Huyết thanh sẽ hình thành tủa lắng xuống. Để dung dịch qua đêm ở 4 oC. - Hôm sau loại bỏ nước trong và rửa lại tủa trong dung dịch Ammonium Sulfate 45% và ly tâm loại bỏ nước trong giữ tủa. Tiếp đến ta cho tan tủa với đệm Sodium Phosphate 0,05M – pH 7,2 với một thể tích bằng hoặc nhỏ hơn thể tích huyết thanh ban đầu. Chú ý cần cho đệm vào từ từ và lắc nhẹ để tủa tan dần và hoàn toàn. Ly tâm bỏ cặn và lấy nước trong. Để loại sạch muối Ammonium Sulfate ta thẩm tích trong đệm Phosphate qua đêm ở 4 oC ( cũng có thể loại trừ muối Ammonium Sulfate bằng cách cho dung dịch đi qua cột sắc ký lọc Sephadex G25 Superfine). Tiếp theo ta ly tâm lấy nước trong. Đây chính là IgG sơ chế để thực hiện giai đoạn tiếp theo. Kiểm tra mức tinh khiết của IgG trên điện di SDS – PAGE và xác định hàm lượng IgG bằng đo ở bước song 280nm. - Tinh chế Fcγ người: Dung dịch IgG người sơ chế được cân bằng trong đệm Sodium Phosphate 0,1M – pH 7,0 có 0,01M Cystein và 2mM Na2EDTA. Tính hàm lượng IgG trong dung dịch để cho Papain với tỷ lệ Papain/IgG = 1/100. Ủ dung dịch ở 37 oC trong 4 giờ, môi trường này thuận lợi cho xúc tác phản ứng cắt phân tử của papain để cho 1 Fcγ và 2 Fab. Ngưng phản ứng bằng cách cho thêm vào dung dịch các tinh thể iodoacetamide để đạt nồng độ 0,1 mg/ml. Tiếp theo ta thẩm tích dung dịch này trong Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 44 đệm Sodium phosphate 0,1M – pH 7,0 ở 4 oC qua đêm. - Thu hồi Fcγ tinh chế với cột sắc ký ái lực (SKAL) Agarose-Protein A. Rửa cột SKAL Agarose Protein A với 25ml đệm gắn (Sodium phosphate 0,02M – pH 7,4 tiếp đến cho dần dung dịch IgG người đã xử lý Papain đi qua cột và rửa tiếp với đệm gắn. Theo dõi sắc ký đồ về lượng protein đi ra từ cột đến khi sạch thì chuẩn bị cho thì giải hấp Fcγ tinh chế. - Đệm giải glycin 1M – pH 3,0: dưới tác dụng của pH thấp và nồng độ phân tử cao, các lực liên kết yếu giữa Fcγ và Protein A bị tách ra và Fcγ theo đệm giải ra ngoài cột. Để Fcγ không bị phân hủy bởi pH thấp của đệm giải ta chuẩn bị sẵn ở ống hứng mỗi ống 1ml đệm trung hòa TRIS 1M – pH 9,0. Thẩm tích dung dịch thu hồi Fcγ trong đệm Sodium phosphate 0,05M – pH7,2 qua đêm ở 4oC. Đo độ protein được giải ra ở bước song 280nm và kiểm tra mức tinh khiết với điện di SDS – PAGE. Gây miễn dịch trên thỏ với kháng nguyên Fcγ người: Thỏ 1 năm tuổi có trọng lượng trên 2kg được sử dụng để gây miễn dịch. Dung dịch kháng nguyên Fcγ trong PBS có thể tích 0,5ml được làm thành nhũ tương nước trong dầu (water in oil) với 0,5ml tá được Freund và tiêm vào trong da dọc theo 2 bên cột sống, mỗi bên 2 dãy và mỗi dãy 10 điểm ( mỗi điểm 25l). Mỗi lần tiêm cách nhau 4 tuần với tổng số 7 lần tiêm gồm 1 lần gây mẫn cảm và 6 lần tiêm nhắc. Lượng kháng nguyên tiêm được giảm dần theo thứ tự liều tiêm như sau 100g, 100g, 50g, 25g, 20g, 20g và 20g. Với tá dược lần đầu là Freund hoàn chỉnh (FCA)và sau đó là Freund không hoàn chỉnh(FIA). Sau lần tiêm nhắc thứ hai 2 tuần lấy máu thử hiệu giá kháng thể chống Fcγ bằng kỹ thuật Ouchterlony. Chỉ sử dụng các thỏ có hiệu giá kháng thể từ 1/16 trở lên mà thôi. Sau lần tiêm nhắc 3, 4, 5 ba tuần lấy máu mỗi thỏ khoảng 50ml và tiếp tục nuôi dưỡng và sau lần tiêm nhắc thứ sáu 3 tuần thì lấy máu toàn bộ. Máu lấy được ly trích huyết thanh và cho tủa trong Ammonium Sulfate như trên để sơ chế IgG thỏ. - Để thu được IgG thỏ đặc hiệu chống Fcγ người chúng tôi dùng dung dịch IgG thỏ sơ chế trong đệm Sodium phosphate đi qua cột SKAL- Fcγ do chúng tôi tự tạo ra(1). Kháng thể thỏ đặc hiệu được giữ lại và chỉ thoát ra khi sử dụng đệm giải. Cách tiến hành như khi thực hiện với cột Agarose - Protein A đã trình bày ở trên. Cộng hợp FITC lên kháng thể đặc hiệu thỏ: Dung dịch IgG thỏ đặc hiệu (đậm độ protein 8,8mg/ml) được khuấy nhẹ rồi từ từ cho đệm Sodium Bicarbonate 0,5M – pH 9,0 vào để pH đạt đến 8,5. Tiếp theo từ từ cho dung dịch FITC trong cồn tuyệt đối (50mg/500ml) để đạt đậm độ FITC 2mg/ml và để khuấy từ 4 oC qua đêm. Hôm sau đem thẩm tích dung dịch trong đêm PBS pH 7,2 ở 4 oC một ngày và cho qua cột Sephadex G25. Phân khúc chảy ra trước là IgG thỏ cộng hợp với FITC còn FITC tự do (không cộng hợp với protein) ra sau. Dung dịch IgG thỏ cộng hợp FITC được quét trên máy quang phổ với bước sóng từ 250 nm đến 600nm. Từ kết quả này tính được tỷ lệ F/P (phân tử FITC/phân tử IgG) và nồng độ IgG. F/P = (2,77 x Abs 495) / [Abs 280 – (0,35 x Abs 495)] Và IgG (mg/ml) = [Abs280 – (0,35 x Abs 495)] / 1,4 Các hệ số 2,77 và 0,35 được sử dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất FITC (Sigma) mà chúng tôi sử dụng. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Từ 100ml tập hợp huyết thanh người bình thường qua tủa trong Ammonium Sulfate chúng tôi thu được khoảng 430mg IgG người sơ chế. Kỹ thuật tủa này là đơn giản, không Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 45 đòi hỏi máy móc và thiết bị phức tạp mà lại cho phép tiến hành với một số lượng lớn huyết thanh (2). Tuy nhiên IgG sơ chế có độ tinh khiết không cao như chúng ta thấy trên kiểm tra qua điện di SDS – PAGE cả trước và sau xử lý với β-mercaptoethanol. Tuy nhiên nguyên liệu IgG sơ chế này đủ để tiến hành phân cắt với papain và từ đó thu hồi Fcγ người tinh khiết vì chúng tôi còn sử dụng cột SKAL Agarose – Protein A để tinh chế sau đó. Sử dụng 87mg IgG người sơ chế xử lý với papain trong môi trường thích hợp và dùng cột SKAL Agarose – Protein A để thu hồi Fcγ người tinh khiết (1). Kết quả thu hồi của chúng tôi là 29mg Fcγ. So sánh với lượng đưa vào chúng tôi thu lại 29/87= 33,3%; tỷ lệ này rất phù hợp với lý thuyết vì khi phân cắt phân tử IgG sẽ cho 1/3 là Fcγ còn 2/3 là ở dạng Fab(8). Chính nhờ liên kết đặc hiệu của Protein A với thụ thể Fc nên đã cho phép bước chuẩn bị IgG người không bắt buộc có độ tinh khiết cao. Trong quá trình gây miễn dịch trên thỏ. Thoạt đầu chúng tôi nuôi 4 thỏ ở 6 tháng tuổi có trọng lương trên 1kg song sau 6 tháng chỉ 3 thỏ đạt trên 2 kg và được sử dụng để gây miễn dịch. Tiêm kháng nguyên trong tá dược Freund phải được chuẩn bị ở dạng nước trong đầu mới gây được áp ứng miễn dịch tốt. Đặc điểm khi tiêm chúng tôi sử dụng nhiều mũi tiêm (40 mũi tiêm mỗi lần) với thể tích tiêm chỉ 25ul mỗi mũi.Thể tích nhỏ để tránh gây hoại tử tại chỗ nhất là ở mũi đầu khi dùng tá dược là FCA. Mặt khác việc tiêm lặp lại nhiều lần với lượng kháng nguyên giảm dần tạo điều kiện để có các dòng kháng thể có đặc hiệu cao và ái lực tốt. Sau 2 lần tiêm nhắc cả 3 thỏ đều đạt hiệu giá kháng thể từ 1/32 đến 1/64 nên đều được sử dụng để bào chế IgG thỏ đặc hiệu chống Fcγ người bằng cột SKAL Sepharose- Fcγ người (3). Kết quả số máu lấy được từ 3 thỏ là 577ml và chiết ra được 300ml huyết thanh. Tổng lượng IgG thỏ sơ chế ước tính là 2800mg. Sử dụng 117mg IgG thỏ sơ chế để chiết ra IgG thỏ đặc hiệu chúng tôi thu được 36,5mg IgG thỏ đặc hiệu (31,2%). Đây là một tỷ lệ cao chứng tỏ đáp ứng miễn dịch trên thỏ rất tốt.Tiến hành cộng hợp FITC vào kháng thể chúng tôi sử dụng trong đệm Sodium Bicarbonate ở độ kiềm cao đã được nhiều tác giả áp dụng(4). Sau khi tiến hành cộng hợp IgG đặc hiệu với FITC và qua cột SKL Sephadex G25,từ hàm lượng IgG ban đầu là 8,8 mg/L ta thu được IgG cộng hợp có hàm lượng IgG là 7,6 mg/ml (tỷ lệ thu hồi 86%) và có hệ số F/p là 1,8. Tiến hành song song kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang tổ chức để phát hiện kháng thể tự miễn lớp IgG bằng kháng thể huỳnh quang của hang DAKO và của chúng tôi trên các bệnh Lupus đỏ hệ thống, bệnh Graves(6,7,9). Có 3 mẫu âm tính và 15 mẫu dương tính đều phù hợp. Độ pha loãng của kháng thể DAKO là 1/40 và của chúng tôi là 1/120 (có độ sáng tương đương hoặc của chúng tôi còn sáng hơn). Tuy nhiên do hàm lượng IgG thỏ trong kháng thể huỳnh quang của chúng tôi cao hơn (7,6 mg/ml so với 3 mg/ml) nên tính đậm độ kháng thể ở thức pha loãng sử dụng thì 2 loại là tương đương: của DAKO là 0,075 mg/ml và của chúng tôi là 0,063 mg/ml. Theo ước tính của chúng tôi việc sản xuất trong nước giá thành sản phẩm chỉ khoảng 50% hay thấp hơn so với mua của nước ngoài. KẾT LUẬN Với đội ngũ cán bộ và máy móc trang bị hiện có chúng tôi đã bào chế thành công kháng thễ thỏ đặc hiệu Fcγ người gắn FITC có chất lượng ít nhất cũng tương đương với sản phẩm chúng tôi vẫn mua ở nước ngoài để sử dụng (từ công ty DAKO). Các kỹ thuật hóa miễn dịch được sử dụng bao gồm tủa IgG trong Ammonium Sulfate, cắt phân tử IgG với Papain, SKAL Agorose – Protein A và SKAL Fcγ để tinh chế Fcγ người và IgG thỏ đặc hiệu chống Fcγ người. Tiến trình của quá trình cộng hợp IgG đặc hiệu với FITC không gặp một trỏ ngại lớn nào.Việc sử dụng kháng thể huỳnh quang tự chế này trong các kỹ thuật Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 46 miễn dịch huỳnh quang mô học được thực hiện theo quy trình thường quy của phòng thí nghiệm. Hiện nay chúng tôi đã sử dụng hoàn toàn kháng thể huỳnh quang tự chế trong xét nghiệm thường quy về hóa mô miễn dịch huỳnh quang. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Fahey J.L. (1967). Chromatographic separation of immunoglobulins in method of immunology. 321-332, Chase M & WIlliams C.A . Academic Press inc: Newyork. 2. Heide K., Schwick H.G. (1973). Salt fractionation of immunoglobulins in immunochemistry. DM.Weir. Chapter 6. Blackwell Scientific Publication. 3. Hermanson G.T., Krishna A., Mallia P.K (1992). Smith immobilized affinity Ligand Techniques chapter 3. Academic press. 4. Hudson L., Hay FiC. (1980). Practical immunology, chapter 7. Isolation and structure of immunoglobulins. Blackwell Scientific. 5. Nguyễn Thị Huyền Ngọc (2010). Thu thập IgG người lành làm kháng nguyên để tạo kháng thể đặc hiệu. Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học khoa học tự nhiên,Thành phố Hồ chí Minh. 6. Rose Noel R., Mackay Ian R. (1998). The Autoimmune Diseases. Chapter 17: Systemic Lupus Erythematosus. Acadamic Press, Third Edition. 7. Rose Noel R., Mackay Ian R. (1998). The Autoimmune Diseases. Chapter 22: Autoimmune Thyroid Diseasee. Acadamic Press, Third Edition. 8. Stanworth DR., Turner M.W. (1986). Immunochemical analysis of human and rabbit immunoglobulins and their subunits in immunochemistry. Chapter 12, D.M. Weir. Blackwell Scientific Publications. 9. Stites D.P. , Terr Abba I. , Parslow Tristam G. (1994). Basic and Clinical Immunology. Chapter 12: Clinical Laboratory Methods for detection of Antigens and Antibodies. Appleton & Lange.