Tác động của chiết xuất từ hạt nhãn trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây chằng nha chu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 1 TÁC ĐỘNG CỦA CHIẾT XUẤT TỪ HẠT NHÃN TRÊN KHẢ NĂNG SỐNG, DI CHUYỂN VÀ TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO DÂY CHẰNG NHA CHU Nguyễn Thu Thuỷ*, Aree Wanasuntronwong**, Rudee Surarit** TÓM TẮT Mở đầu: Các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ cây cỏ đã trở thành một hướng quan trọng trong điều trị bệnh vùng miệng bao gồm viêm nướu và viêm nha chu. Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) đã được nghiên cứu về khả năng ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh lí, tuy nhiên chưa có trong lĩnh vực này. Mục tiêu: Nghiên cứu tác động của CXHN trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của tế bào dây chằng nha chu (TBDCNC) bằng các kĩ thuật cơ bản. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm MTT được dùng để đánh giá khả năng sống và tăng trưởng của TBDCNC trong nuôi cấy; khả năng di chuyển được đánh giá bằng chương trình Image Pro Plus Program và đếm tế bào trong vùng đánh dấu. Kết quả: Nồng độ ức chế 50% (IC50) của CXHN trên TBDCNC là 1,47 mg/ml sau 24 giờ và 0,15 mg/ml sau 48 giờ. CXHN nồng độ 1 mg/ml ức chế sự di chuyển của tế bào nhưng tác động này giảm khi liều lượng giảm. Cả hai nông độ đều có vẻ ức chế sự tăng trưởng của TBDCNC. Kết luận: CXHN ảnh hưởng trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của TBDCNC, tác động giảm khi nồng độ giảm. Với khả năng kháng viêm, đây là một chất tiềm năng trong điều trị bệnh nha chu, tuy nhiên cần các nghiên cứu khác với các nồng độ khác nhau để đi đến kết luận. Từ khoá: chiết xuất từ hạt nhãn, tế bào dây chằng nha chu, khả năng sống, di chuyển, tăng trưởng. ABSTRACT EFFECTS OF LONGAN SEED EXTRACT ON SURVIVAL, MIGRATION AND PROLIFERATION OF PERIODONTAL LIGAMENT CELLS Nguyen Thu Thuy, Aree Wanasuntronwong, Rudee Surarit * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 19 - Supplement of No 2 - 2015: 1 - 5 Background: Traditional herbal medicine has become an important orientation in treatment of oral diseases including gingivitis and periodontitis. The Longan seed extract (LSE) has been studied for their potential application in numerous diseases, but not yet in this field. Objectives: The aim of this study was to investigate the effects of LSE on the viability, the migration and the proliferation of periodontal ligament cells (PDLCs) by using basic techniques. Materials and methods: The MTT assay was used to assess the cytotoxicity and the proliferation of PDLCs in culture; the cell migration was estimated by using Image Pro Plus Program and by counting the number of cells in the migration area. Results: The IC50 of LSE on PDLCs was approximately 1.47 mg/ml after 24 hours and 0.15 mg/ml after 48 hours of incubation. The LSE at 1 mg/ml inhibited the migration of PDLCs but the effect was reduced with lower dose. The LSE both at 1 mg/ml and 0.05 mg/ml seemed to be inhibitive on the proliferation of PDLCs. Conclusion: The LSE has effect on the survival, migration and proliferation of PDLCs. In considering its * Bộ môn Nha chu, Khoa Răng Hàm Mặt- Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Bộ môn Sinh học miệng, Khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thu Thuỷ ĐT: 01208505265 Email: ngthuthuy20@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 2 anti-inflammatory effect and paying attention to the concentration in use, other studies are in need to explore the application potential of this extract in treatment of periodontal diseases based on inexpensive natural products. Key words: Longan seed extract, periodontal ligament cells, survival, migration, proliferation. ĐẶT VẤN ĐỀ Tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy tình trạng vệ sinh răng miệng ở nhóm tuổi 35 – 44 kém với nhiều vôi răng, mảng bám; hầu hết các đối tượng có ít nhất một vị trí có mất bám dính ≥ 2 mm. Ở Thái Lan, tỉ lệ viêm nha chu nhẹ, trung bình và nặng lần lượt là 30,5, 53,6 và 15,9(10). Ở cả hai nước, các loại thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ cây cỏ đã trở thành một hướng trong nỗ lực quốc gia nhằm tăng cường sức khoẻ cộng đồng ở vùng nông thôn, trong đó bao gồm sức khoẻ răng miệng nói chung và mô nha chu nói riêng(12,9). Chiết xuất từ hạt nhãn (CXHN) chứa polysaccharides có tác động kháng oxy hoá in vitro phụ thuộc vào nồng độ(3). Liều khẩn cấp và liều lập lại của CXHN dùng theo đường uống đã được kết luận là không gây độc, từ đó có thể sử dụng an toàn dưới kiểm soát trong các nghiên cứu độc tính dài hạn và/hoặc thử nghiệm lâm sàng(13). CXHN hiện đang được nghiên cứu về khả năng chống ung thư(5,6), kháng nấm(7), chống mệt mỏi(15), nhưng chưa từng được tìm hiểu về khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh vùng miệng. Mặt khác, các tác động của CXHN in vitro trên tế bào nuôi cấy, đặc biệt là trên tế bào dây chằng nha chu (TBDCNC), cũng chưa được đánh giá đầy đủ. Do đó, mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm hiểu tác động của CXHN trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của TBDCNC bằng các thử nghiệm cơ bản. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy tế bào TBDCNC của Đơn vị cung cấp tế bào nuôi cấy Hoa Kỳ (American Type Culture Collection, ATCC), được nuôi trong môi trường Dulbecco biến đổi (Dulbecco’s Modified Eagle Medum, DMEM) chứa 90% DMEM, 10% huyết thanh phôi thai bò (Fetal Bovine Sreum, FBS), 1% kháng sinh. Cấy chuyển khi mật độ tế bào dày đặc, các tế bào kết dính với nhau. Chuẩn bị dung dịch CXHN CXHN do Phòng thí nghiệm Đại học Chulalongkorn, Thái Lan cung cấp, sau đó được pha loãng với Dimethyl sulfoxide (DMSO) để tạo thành dung djch CXHN với nồng độ khác nhau. Tác động của CXHN trên khả năng sống của TBDCNC TBDCNC được gieo vào bảng mẫu siêu nhỏ (microtiter plates, 96 well plates) với mật độ 20.000 tế bào/well. Đếm tế bào bằng buồng đếm hematocytometer (Improve Neubauer®). Các bảng mẫu sau đó được ủ ấm trong máy ủ CO2 (37o C, 5% CO2, độ ẩm 100%) trong 24 giờ để đạt mức bão hoà. Dung dịch CXHN với nồng độ 5 mg/ml, 1 mg/ml, 0,1 mg/ml và 0,01 mg/ml được cho vào well (4 well cho mỗi nồng độ). Dung dịch đệm phosphate saline (Phosphate buffer saline, PBS) được đặt vào well trắng. Chlorhexidine 0,12% được dùng làm chứng dương và môi trường nuôi dưỡng dùng để làm chứng âm. Tiếp tục đặt bảng mẫu vào tủ ủ trong 24 giờ và 48 giờ. Khả năng sống của tế bào được xác định bằng thử nghiệm MTT. Đọc kết quả với quang phổ kế ở bước sóng 540 nm. Lập lại thử nghiệm 2 lần với kết quả không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Kết quả chỉ được chấp nhận khi hệ số biến thiên dưới 15%. Tác động của CXHN trên khả năng di chuyển của TBDCNC TBDCNC được cấy vào bảng mẫu 24 well (24 well plates) với mật độ 50.000 tế bào/well, ủ trong tủ ủ CO2 trong 48 giờ để đạt mức bão hoà. Sau đó, dùng đầu pipette 1000 μl vạch một đường ngang qua trung tâm đáy well. Kiểm tra dưới kính hiển vi cho thấy không còn tế bào trong vùng vạch. Thêm 500 μl dung dịch CXHN với nồng độ 1 mg/ml và 0,05 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 3 mg/ml vào các well (4 well cho mỗi nồng độ). Theo dõi sự di chuyển tế bào sau 3, 6 và 24 giờ. Sau 24 giờ, rửa tế bào với PBS 1X, cố định với methanol trong 2 phút, rửa lại 2 lần trước khi nhuộm với xanh toludine (toludine blue 0,25%). Chụp hình dưới kính hiển vi. Đo vùng tế bào di chuyển với chương trình Image Pro Plus Program, sau đó đếm tế bào trong vùng xác định bằng đường vạch đầu pipette. Tác động của CXHN trên sự tăng trưởng TBDCNC Cấy TBDCNC vào bảng mẫu 96 well với mật độ 2.000 tế bào/well. Sau khi ủ 24 giờ, cho dung dịch CXHN nồng độ 1 mg/ml và 0,05 mg/ml vào các well (4 well cho mỗi nồng độ). Chlorhexidine 0,12% dược dùng làm chứng âm và yếu tố tăng trưởng cho nguyên bào sợi của người (human fibroblast growth factor, hFGF basic/FGF2) 0,2 μg/ml được dùng làm chứng dương. Ủ bảng mẫu trong tủ ủ và thực hiện thử nghiệm MTT sau 1, 3, 6, 7 ngày. Đọc kết quả với quang phổ kế với bước sóng 540 nm. Lập lại thử nghiệm 2 lần với kết quả không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Kết quả chỉ được chấp nhận khi hệ số biến thiên dưới 15%. Phân tích số liệu Xác địnhh kiểu phân phối số liệu bằng test Kolmogorov Smirnov. Sử dụng test one-way ANOVA và test one-way Kruskal-Wallis trong chương trình SigmaStat version 3.5 để phân tích thống kê. Giá trị p ≤ 0,05 được xem là có ý nghĩa thống kê. KẾT QUẢ Tác động của CXHN trên khả năng sống của TBDCNC Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory concentration 50%, IC50) là nồng độ của một mẫu có thể ức chế sự sống của 50% số lượng tế bào trong những điều kiện xác định. IC50 của dung dịch CXHN sau 24 giờ và 48 giờ lần lượt là 1,47 mg/ml và 0,15 mg/ml. Tác động của CXHN trên khả năng di chuyển của TBDCNC Bảng 1. Diện tích vùng di chuyển của TBDCNC sau 24 giờ ủ với các dung dịch Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Diện tích vùng di chuyển Trung bình  sai số chuẩn (mm 2 ) P Dung dịch dinh dưỡng (DMEM + 10% FBS + 1% kháng sinh) (Chứng âm) 0,25  0,05 hFGF basic/FGF2 (Chứng dương) 0,0002 0,31  0,03 p<0,05 * CXHN 1,00 0,06  0,01 p<0,05 * 0,05 0,19  0,03 p<0,05 * * So sánh với nhóm chứng âm, test one-way ANOVA Bảng 2. Số lượng TBDCNC trong vùng di chuyển sau 24 giờ ủ với các dung dịch Dung dịch Nồng độ (mg/ml) Số lượng TBDCNC Trung bình  Sai số chuẩn (tế bào) P Dung dịch dinh dưỡng (Chứng âm) 304,00  12,92 hFGF basic/FGF2 (Chứng dương) 0,0002 385,67  27,84 p<0,05 * CXHN 1,00 49,17  4,80 p<0,05 * p<0,05 * 0,05 169,17  4,92 * So sánh với nhóm chứng âm, test one-way ANOVA Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 4 Tác động của CXHN trên sự tăng trưởng TBDCNC Biểu đồ 1. Ảnh hưởng của dung dịch CXHN trên sư tăng trưởng của TBDCNC BÀN LUẬN Trong thí nghiệm đầu tiên về ảnh hưởng của CXHN trên khả năng sống của TBDCNC, IC50 của dung dịch CXHN sau 24 giờ và 48 giờ lần lượt là 1,47 mg/ml và 0,15 mg/ml. Kết quả này bổ sung cho nhận định tác động của CXHN thay đổi theo nồng độ của Jiang và cs.(3). Kết quả thí nghiệm này gợi ý các nồng độ được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo về tác động của CXHN trên khả năng di chuyển và tăng trưởng của TBDCNC. Đồng thời trong thí nghiệm này, Chlorhexidine nồng độ 0,12% được dùng làm nhóm chứng dương. Dưới 7% TBDCNC tồm tại sau 24 giờ và 48 giờ ủ với dung dịch Chlorhexidine ở nồng độ thường được khuyến cáo dùng làm nước súc miệng trong điều trị bệnh nha chu và sau phẫu thuật miệng(8). Kết quả này tương đồng với một nghiên cứu khác năm 2013 cho thấy dung dịch Chlorhexidine pha loãng làm giảm khả năng di chuyển và tồn tại dài hạn của tế bào(11). Tế bào khi được ủ với dung dịch hFGF basic/FGF2 0.2 μg/ml có vùng di chuyển và số lượng tế bào di chuyển lớn nhất, khi so sánh với dung dịch dinh dưỡng, CXHN 1 mg/ml và 0,05 mg/ml. Điều này khác biệt với nghiên cứu của Zhang và cs. năm 2013 trong đó nhóm tế bào được kích thích với cùng yếu tố tăng trưởng không cho thấy tác động làm tăng khả năng di chuyển(14). Dung dịch CXHN 1 mg/ml có vẻ ức chế sự di chuyển của TBDCNC, tác động này giảm khi nồng độ giảm do diện tích vùng tế bào di chuyển cũng như số lượng tế bào di chuyển trong môi trường nồng độ 1 mg/ml và 0,05 mg/ml khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Trong thí nghiệm về ảnh hưởng của CXHN trên khả năng tăng trưởng của TBDCNC, ở ngày 1 và 3 không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng tế bào còn sống giữa nhóm chứng dương, nhóm chứng âm, dung dịch CXHN 1 mg/ml và 0,05 mg/ml (p>0,05). Tiếp theo, có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm chứng dương và các dung dịch: nhóm chứng âm, CXHN 1 mg/ml, CXHN 0,05 mg/ml (p<0,05). Trong khi đó, không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa dung dịch CXHN 1mg/ml cũng như 0,05 mg/ml và nhóm chứng âm p>0,05). Kết quả thí Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 19 * Phụ bản của Số 2 * 2015 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 5 nghiệm tương tự kết luận của Chung và cs. năm 2010 rằng CXHN ngăn cản sự tổng hợp DNA(1). Như vậy, mặc dù đặc tính kháng viêm, kháng oxy hoá của dung dịch CXHN đã được nhiều nghiên cứu chứng minh và hiện nay dung dịch này đang được tìm hiểu về khả năng ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh toàn thân, cần có những nghiên cứu khác in vitro và in vivo để làm rõ tác động của CXHN trên mô trong miệng, đặc biệt là trên TBDCNC, một cấu trúc cơ bản của mô nha chu và có khả năng ảnh hưởng đến những đáp ứng phản vệ của cơ thể bằng cách tương tác với các tế bào miễn dịch(4). KẾT LUẬN CXHN ảnh hưởng trên khả năng sống, di chuyển và tăng trưởng của TBDCNC, tác động giảm khi nồng độ giảm. Với khả năng kháng viêm, đây là một chất tiềm năng trong điều trị bệnh nha chu, tuy nhiên cần các nghiên cứu khác với các nồng độ khác nhau để đi đến kết luận. Cám ơn: Các kĩ thuật viên Sirinthip Choonate, Duangchewan Puengsurin, Ratchaporn Srichan, Suparporn Mala thuộc Bộ môn Sinh học miệng và Trung tâm hỗ trợ nghiên cứu của khoa Nha, Đại học Mahidol, Thái Lan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chung YC, Lin CC, Chou CC, Hsu CP (2010). The effect of Longan seed polyphenols on colorectal carcinoma cells. Eur J Clin Invest. 40(8):713-21. 2. Do LG, Spencer JA, Roberts-Thomson K, Ha DH, Tran TV, Trinh HD (2003). Periodontal disease among the middle-aged Vietnamese population. J Int Acad Periodontol. 5(3):77-84. 3. Jiang G, Wen L, Chen F, Wu F, Lin S, Yang B, Jiang Y (2013). Structural characteristics and antioxidant activities of polysaccharides from longan seed. Carbohydr Polym. 92(1):758- 64. 4. Konermann A, Stabenow D, Knolle PA, Held SA, Deschner J, Jäger A (2012). Regulatory role of periodontal ligament fibroblasts for innate immune cell function and differentiation. Innate Immun. 18(5):745-52. 5. Lin CC, Chung YC, Hsu CP (2012). Potential roles of longan flower and seed extracts for anti-cancer.World J Exp Med. 2(4):78-85. 6. Panyathep A, Chewonarin T, Taneyhill K, Vinitketkumnuen U, Surh YJ (2013). Inhibitory effects of dried longan (Euphoria longana Lam.) seed extract on invasion and matrix metalloproteinases of colon cancer cells. J Agric Food Chem. 61(15):3631-41. 7. Rangkadilok N, Tongchusak S, Boonhok R, Chaiyaroj SC, Junyaprasert VB, Buajeeb W, Akanimanee J, Raksasuk T, Suddhasthira T, Satayavivad J (2012). In vitro antifungal activities of longan (Dimocarpus longan Lour.) seed extract. Fitoterapia. 83(3):545-53. 8. Rath SK, Singh M (2013). Comparative clinical and microbiological efficacy of mouthwashes containing 0.2% and 0.12% chlorhexidine. Dent Res J (Isfahan). 10(3):364-9. 9. Sastravaha G, Yotnuengnit P, Booncong P, Sangtherapitikul P (2003). Adjunctive periodontal treatment with Centella asiatica and Punica granatum extracts. A preliminary study. J Int Acad Periodontol. 5(4):106-15. 10. Torrungruang K, Tamsailom S, Rojanasomsith K, Sutdhibhisal S, Nisapakultorn K, Vanichjakvong O, Prapakamol S, Premsirinirund T, Pusiri T, Jaratkulangkoon O, Unkurapinun N, Sritara P (2005). Risk indicators of periodontal disease in older Thai adults. J Periodontol. 76(4):558-65. 11. Tsourounakis I, Palaiologou-Gallis AA, Stoute D, Maney P, Lallier TE (2013). Effect of essential oil and chlorhexidine mouthwashes on gingival fibroblast survival and migration. J Periodontol. 84(8):1211-20. 12. Wahlberg A (2006). Bio-politics and the promotion of traditional herbal medicine in Vietnam. Health (London). 10(2):123-47. 13. Worasuttayangkurn L, Watcharasit P, Rangkadilok N, Suntararuks S, Khamkong P, Satayavivad J (2012). Safety evaluation of longan seed extract: acute and repeated oral administration. Food Chem Toxicol. 50(11):3949-55. 14. Zhang R, Zhang M, Li CH, Wang PC, Chen F, Wang QT (2013). Effects of basic fibroblast growth factor and vascular endothelial growth factor on the proliferation, migration and adhesion of human periodontal ligament stem cells in vitro. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 48(5):278-84. 15. Zheng SQ, Jiang F, Gao HY, Zheng JG (2010). Preliminary observations on the antifatigue effects of longan (Dimocarpus longan Lour.) seed polysaccharides. Phytother Res. 24(4):622-4. Ngày nhận bài báo: 25/01/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 02/03/2015 Người phản biện: TS Phan Ái Hùng Ngày bài báo được đăng: 10/04/2015