Tác dụng bảo vệ gan của viên xích linh chi

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 91 TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA VIÊN XÍCH LINH CHI Nguyễn Thị Thu Hương*, Tất Hiến Khoa*, Nguyễn Minh Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Theo Y học cổ truyền phương Đông, nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) có nhiều tác dụng như: chống oxy hóa, tăng cường trí nhớ, chữa viêm gan, chống lão hóa, điều hoà miễn dịch, chống khối u, bảo vệ phóng xạ,... Đề tài thực hiện các nghiên cứu gây tổn thương gan cấp và mạn trên chuột nhắt trắng để khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi, nhằm góp phần cho việc phòng và điều trị các bệnh lý về gan có căn nguyên do gốc tự do. Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng 25 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Thiết kế nghiên cứu gồm 3 thực nghiệm: 1) Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình gây tổn thương gan cấp bằng cách tiêm phúc mạc carbon tetrachlorid (CCl4) liều 1 ml/kg, 2) Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình tổn thương gan cấp và mạn bằng paracetamol liều uống 300 mg/kg và 3) Khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình tổn thương gan mạn bằng cyclophosphamid liều tiêm phúc mạc 150 mg/kg. Các chỉ tiêu khảo sát gồm: hoạt độ men gan GOT và GPT, hàm lượng bilirubin toàn phần trong huyết tương, hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) và glutathion (GSH) trong gan. Kết quả: Viên Xích linh chi liều 2 viên/kg có tác dụng bảo vệ gan trước tổn thương do CCl4 ở các chỉ tiêu sinh hóa máu (giảm men gan GPT và hàm lượng bilirubin) và sinh hóa tế bào. Viên Xích linh chi có tác dụng bảo vệ gan trước tổn thương oxy hóa cấp hay mạn gây bởi paracetamol qua việc giảm phân suất tử vong, điều chỉnh về bình thường sự tăng men gan GPT, làm tăng hàm lượng enzym chống oxy hóa nội sinh GSH trong gan chuột, dẫn đến làm giảm sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan. Tương tự, viên Xích linh chi liều 2 viên/kg thể trọng chuột có tác dụng bảo vệ gan trước tổn thương oxy hóa gây bởi thuốc hóa trị liệu ung thư cyclophosphamid thông qua việc làm tăng hàm lượng GSH và giảm sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan. Tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi tương tự như thuốc đối chiếu silymarin. Kết luận: Từ kết quả nghiên cứu tác dụng theo hướng bảo vệ gan trên các mô hình thực nghiệm cho thấy viên Xích linh chi có thể được sử dụng hỗ trợ để làm giảm tác dụng phụ do các thuốc hóa trị liệu ung thư và có hiệu quả bảo vệ gan cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như bị các bệnh lý về gan. Từ khóa: Viên Xích linh chi, tác dụng bảo vệ gan, carbon tetrachlorid, paracetamol, cyclophosphamid ABSTRACT HEPATOPROTECTIVE EFFECTS OF MIKEI RED REISHI CAPSULES Nguyen Thi Thu Huong, Tat Hien Khoa, Nguyen Minh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 91 - 99 Aims of study: Ganoderma lucidum (known as Lingzhi in China and Reishi in Japan) has become one of the natural sources in the treatment of leukemia, carcinoma, hepatitis, lipid metabolism disorders, and diabetes. This mushroom is now being used to complement or sometimes substitute in modern medicine. This study was carried out to evaluate the hepatoprotective effects of “Mikei Red Reishi Essence” capsules on liver damage caused by ∗ Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp. Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu Tác giả liên lạc: PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Hương ĐT: 38292646 Email: huongsam@hotmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 92 toxic chemical or medicines. Materials and Methods: Animals: 5 - 6 weeks old Swiss albino male mice, weighing 25 ± 2 g, were purchased from Institute of Vaccines and Biomedicines, Nha Trang City. Experimental setting: Experimental study on hepatoprotective effects of Mikei Red Reishi Essence capsules were carried out using hepatotoxicity models caused by carbon tetrachloride, paracetamol and cyclophosphamide. Plasma transaminase GOT and GPT, total bilirubin, hepatic malonyl dialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) contents were used as observation parameters. Results: Red Reishi Capsules at dose of 2 capsules/kg had a protective effect on liver injury induced by carbon tetracloride and show significant efficiency on plasmic and cellular biochemical parameters (decreased enzyme GOT, bilirubin, MDA content and increased GSH). Red Reishi capsules expressed their hepatoprotective effects in both treatment and prevention before paracetamol-induced oxidative damage in liver by through the adjustment to the normal level of liver enzyme GPT elevation in plasma, the increased levels of endogenous antioxidant enzymes GSH in mouse liver, leading to reduce MDA increase in the liver. Red Reishi capsules also expressed their hepatoprotective effect on long-term liver oxidative damage caused by paracetamol. Red Reishi Capsules helped protect well the liver functions resulting in lower mortality rate than that of the control mice. The results also showed that Red Reishi Capsules proved a protective effect on the liver in oxidative damage caused by the chemotherapy anticancer agent cyclophosphamide through the increase of endogenous antioxidant enzyme GSH levels in mouse liver, resulting in reduction of MDA levels in the liver. According to the results of experimental study. Red Reishi Capsules had the same protective effect with silymarin, a positive control, on the liver damage. Conclusion: The research results towards the hepatoprotective effects in experimental models showed that Red Reishi capsules were able to be used in reducing the side effects of anticancer chemotherapy drugs and effective in the protection for patients with liver cancer and liver diseases. Keywords: Mikei Red Reishi Essence capsules, hepatoprotective effect, carbon tetrachloride, paracetamol, cyclophosphamide. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay môi trường ô nhiễm, thực phẩm không an toàn, lạm dụng thuốc, rượu cùng lối sống không lành mạnh dẫn đến tần suất các bệnh lý tổn thương gan có căn nguyên do gốc tự do ngày càng cao. Việc chứng minh hiệu quả điều trị của các chế phẩm đi từ dược liệu phục vụ cho việc phòng và điều trị các bệnh lý về gan có căn nguyên do gốc tự do là vấn đề có ý nghĩa cấp thiết trong cả hai lĩnh vực y và dược. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh nấm Linh chi (Ganoderma lucidum (Fr.) Karst) có tác dụng chống oxy hóa, kích thích hoạt động của hệ miễn dịch, làm giảm các tác dụng phụ do các thuốc hóa trị liệu ung thư và có hiệu quả trị liệu tốt cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như bị các bệnh lý về gan (3). Các chế phẩm từ nấm Linh chi xuất hiện rất nhiều trên thị trường với các dạng thuốc hoặc thực phẩm chức năng nhằm mục đích tăng cường sức khỏe, nâng cao thể trạng và hỗ trợ trong điều trị một số bệnh lý. Một trong những sản phẩm đó là viên nang Xích Linh chi- Mikei Red Reishi Essence của công ty TNHH NIKKEI, Nhật Bản. Liệu đây có là một giải pháp bảo vệ và chữa trị gan hiệu quả trong những trường hợp tổn thương gan mạn và nhất là ngộ độc gan cấp? Để giải quyết mục tiêu này, đề tài thực hiện các nghiên cứu gây tổn thương gan cấp và mạn trên chuột nhắt trắng để khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Viên Xích linh chi-Mikei Red Reishi Essence (gọi tắt là viên Xích linh chi) được sản xuất bởi Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 93 Công ty NIKKEI, Nhật Bản. Viên Xích linh chi được đóng gói 2,5 g/gói, 250 mg/1 viên x 10 viên. Tất cả mẫu thử đều cùng một lô sản xuất với số lô là 1140 và hạn dùng 10/4//2015. Thành phần trong mỗi viên gồm: Chất chiết Xích linh chi (80%) và Dextrin (20%). Viên được tháo bỏ vỏ nang, cân trọng lượng bột viên của 10 viên và lấy khối lượng trung bình của 01 viên. Khối lượng trung bình của 01 viên là 250 ± 10 mg. Bột viên được hòa trong nước cất và được cho uống hàng ngày vào thời điểm 8-9 giờ sáng. Các liều thử nghiệm được quy theo số lượng viên uống/kg thể trọng chuột. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng đực (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 25 g ± 2 g) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, nuôi trong điều kiện ổn định về chế độ dinh dưỡng. Hóa chất-Thuốc đối chiếu Carbon tetrachlorid–CCl4 dạng lỏng (China), paracetamol (Anqiu Luan Pharmaceutical Co., Ltd, China), dầu oliu (Spain), cyclophosphamid, malonyl dialdehyd, glutathion, acid thiobarbituric, thuốc thử Ellman và silymarin (Sigma Co. Ltd, USA). Các bộ kit định lượng transaminase GOT, GPT và bilirubin của Human Co. Ltd., Germany. Thời gian cho uống mẫu thử hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 8 ngày, sau đó tiêm phúc mạc với CCl4 liều 1 ml/kg pha trong dầu oliu (Bảng 1). Tiêm 3 lần vào ngày 1, ngày 3, ngày 5 sau khi cho uống. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng thì tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột để định lượng GOT, GPT, bilirubin và mổ tách lấy gan chuột đem định lượng malonyl dialdehyd (MDA) và glutathion (GSH). Phương pháp nghiên cứu Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetrachlorid (2). Bảng 1. Bố trí thí nghiệm gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetrachlorid. Nhóm Lô N = 10-15 Mẫu thử uống Gây tổn thương gan Bình thường CCl4 (-) Chứng bình thường Nước cất Tiêm dầu oliu Thử 1 Xích linh chi, liều 1 viên/kg Thử 2 Xích linh chi, liều 2 viên/kg Đối chiếu Silymarin, liều 100 mg/kg Bệnh lý CCl4 (+) Chứng bệnh lý Nước cất Tiêm CCl4 liều 1ml/kg pha trong dầu oliu Thử 1 Xích linh chi, liều 1 viên/kg Thử 2 Xích linh chi, liều 2 viên/kg Đối chiếu Silymarin, liều 100 mg/kg Mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol (acetaminophen) Bảng 2. Bố trí thí nghiệm gây tổn thương gan cấp và mạn bằng paracetamol. Nhóm Lô N = 10-15 Mẫu thử uống Bình thường Chứng Nước cất Thử Xích linh chi, liều 2 viên/kg Đối chiếu Silymarin, liều 100 mg/kg Bệnh lý PARA (+) Chứng bệnh lý Nước cất Thử Xích linh chi, liều 2 viên/kg Đối chiếu Silymarin, liều 100 mg/kg Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol và phác đồ điều trị Nhóm bình thường: Không gây độc. Các lô cho uống 3 lần tại các thời điểm 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ sau khi gây lô. Nhóm bệnh lý: Gây độc bằng uống paracetamol một liều duy nhất liều 300 mg/kg. Các lô tiến hành cho uống sau 1 giờ, 6 giờ, 24 giờ gây độc. Một giờ sau lần cho uống cuối cùng thì tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột để định Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 94 lượng GOT, GPT và mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH. Mô hình gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol và phác đồ dự phòng. Thời gian cho uống mẫu thử hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 8 ngày. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng, chuột được gây độc bằng uống paracetamol một liều duy nhất 300 mg/kg. Sau khi gây độc 3 giờ thì tiến hành lấy máu tĩnh mạch đuôi chuột để định lượng GOT, GPT và mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH. Mô hình gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol. Thời gian cho uống paracetamol hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 14 ngày. Một giờ sau khi gây độc bằng uống paracetamol liều 300 mg/kg mỗi ngày, chuột được uống mẫu thử. Trước khi gây độc vào ngày 8, lấy máu chuột định lượng GOT và GPT. Sau đó chuột được gây độc và uống mẫu thử. Vào ngày 14, sau lần cho uống mẫu thử cuối cùng thì tiến hành mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH. Mô hình gây tổn thương gan bằng cyclophosphamid (1, 6). Bảng 3. Bố trí thí nghiệm gây tổn thương gan bằng cyclophosphamid. Nhóm Lô N = 10-15 Mẫu thử uống Gây tổn thương gan Bình thường CY (-) Chứng Nước cất Không Thử Xích linh chi, liều 2 viên/kg Đối chiếu Silymarin, liều 100 mg/kg Bệnh lý CY (+) Chứng bệnh lý Nước cất Tiêm cyclophosphamid liều 150 mg/kg Thử bệnh lý Xích linh chi, liều 2 viên/kg Đối chiếu bệnh lý Silymarin, liều 100 mg/kg CY: Cyclophosphamid Thời gian cho uống hằng ngày trong khoảng 8-9 giờ sáng và liên tục trong 8 ngày sau khi tiêm cyclophosphamid. Vào ngày thứ 8, một giờ sau lần cho uống cuối cùng mổ tách lấy gan chuột đem định lượng MDA và GSH trong gan. Xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) và glutathion (GSH) trong gan chuột (4, 7). MDA: Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 %. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vđ 3 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy 2 ml dịch trong, cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 100oC trong 15 phút và đo quang ở λ = 532 nm. Hàm lượng MDA (nM/g protein) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA. GSH: Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 %. Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) vđ 3 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 60 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy 1 ml dịch trong cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman là 5,5’– dithiobis–(2–nitrobenzoic acid) và thêm đệm EDTA phosphat vđ 3 ml. Để 3 phút ở nhiệt độ phòng và sau đó tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 412 nm. Hàm lượng GSH (nM/g protein) được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Số liệu thực nghiệm thể hiện bằng số trung bình (M) ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Xử lý số liệu bằng phần mềm MS Excel 2007, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One– Way ANOVA và Student-Newman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat-98). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05 so với lô chứng tương ứng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 95 KẾT QUẢ Kết quả khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình gây tổn thương gan cấp bằng carbon tetrachlorid Ở nhóm không tiêm CCl4 (-), hàm lượng MDA và GSH ở các lô thử và lô đối chiếu không có khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Bảng 4. Hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong mô hình gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid . Nhóm Lô N Hàm lượng MDA (nM/g protein) Hàm lượng GSH (nM/g protein) CCl4 (-) Chứng bình thường 12 78,07 ± 3,29 12640,88 ± 292,57 Lô thử 1 10 77,23 ± 2,93 13194,96 ± 206,79 Lô thử 2 10 78,98 ± 5,61 11766,36 ± 592,06 Đối chiếu 10 95,63 ± 8,92 12235,50 ± 512,84 CCl4 (+) Chứng bệnh lý 10 117,12 ± 6,28 # 10435,10 ± 713,90 # Lô thử 1 11 103,28 ± 10,19 13923,85 ± 1159,93 * Lô thử 2 15 80,96 ± 5,36 * 16697,73 ± 1345,39 * # Đối chiếu 15 81,96 ± 5,33 * 13580,89 ± 697,75 * (*) P< 0,05 so sánh với các lô chứng bệnh lý. (#) P< 0,05 so sánh với lô chứng bình thường Ở nhóm có tiêm CCl4 (+), lô chứng bệnh lý (được tiêm CCl4) có hàm lượng MDA tăng và hàm lượng GSH giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường (không tiêm), khẳng định CCl4 đã có tác dụng gây tổn thương oxy hóa gan. Lô thử tiêm CCl4 và uống viên Xích linh chi liều 1 viên/kg có hàm lượng MDA giảm so với lô chứng bệnh lý nhưng không đạt ý nghĩa thống kê. Hai lô thử tiêm CCl4 và uống viên Xích linh chi liều 2 viên/kg và lô đối chiếu silymarin có hàm lượng MDA giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. So với lô chứng bệnh lý, thì các lô thử tiêm CCl4 và uống viên Xích linh chi và lô đối chiếu đều cho thấy có sự tăng hàm lượng GSH trong gan đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Ngoài ra, không có sự khác biệt về thống kê giữa lô thử uống viên Xích linh chi liều 1 viên/kg và lô đối chiếu, nhưng hàm lượng GSH ở lô thử 2 (uống viên Xích linh chi 2 viên/kg trước khi tiêm CCl4) lại tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô thử uống viên Xích linh chi liều 1 viện/kg và lô đối chiếu, cho thấy viên Xích linh chi liều 2 viên/kg có hiệu quả rõ rệt trên hàm lượng GSH trong gan, hiệu quả hơn cả silymarin. Bảng 5. Hàm lượng bilirubin toàn phần, hoạt độ GOT và GPT trong mô hình gây tổn thương gan bằng carbon tetraclorid. Nhóm Lô N Bilirubin (mg/dL) GOT(U/l) GPT(U/l) CCl4 (-) Chứng bình thường 12 0,35 ± 0,048 47,0 ± 3,67 51,17 ± 4,53 Lô thử 2 10 0,356 ± 0,073 44,0 ± 4,04 54,09 ± 2,65 Đối chiếu 10 0,410 ± 0,079 41,25 ± 3,51 60,6 ± 2,89 CCl4 (+) Chứng bệnh lý 10 0,917 ± 0,105# 44,5 ± 2,99 143,0 ± 11,70# Lô thử 1 11 0,489 ± 0,186* 42,75 ± 2,82 79,4 ± 4,92* Lô thử 2 15 0,317 ± 0,056* 37,75 ± 2,99 78,6 ± 8,16* Đối chiếu 15 0,342 ± 0,048* 42,7 ± 4,24 66,8 ± 6,73* (*) P< 0,05 so sánh với các lô chứng bệnh lý. (#) P< 0,05 so sánh với lô chứng bình thường Nhận xét bảng 5: Hàm lượng bilirubin ở các lô của nhóm không tiêm CCl4 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở nhóm tiêm CCl4, hàm lượng bilirubin của lô chứng bệnh lý tăng cao gần 3 lần và đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Còn các lô thử uống viên Xích linh chi 1 viên/kg hay 2 viên/kg và lô đối chiếu có sự giảm hàm lượng bilirubin về mức bình thường, giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Viên Xích linh chi liều 2 viên/kg có hiệu quả rõ rệt trên hàm lượng bilirubin trong máu, tương đương với thuốc đối chiếu silymarin. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 96 Hoạt độ GOT ở các lô của nhóm không tiêm CCl4 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở nhóm tiêm CCl4, hoạt độ GOT của lô chứng bệnh lý không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Các lô thử uống viên Xích linh chi 1 viên/kg hay 2 viên/kg và lô đối chiếu silymarin đều có hoạt độ GOT không khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường và lô chứng bệnh lý. Do đó, mô hình gây độc bằng CCl4 không ảnh hưởng rõ rệt trên chỉ tiêu GOT. Hoạt độ GPT ở các lô của nhóm không tiêm CCl4 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở nhóm tiêm CCl4, hoạt độ GPT của lô chứng bệnh lý tăng cao gần 3 lần và đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Còn các lô thử uống viên Xích linh chi 1 viên/kg hay 2 viên/kg và lô đối chiếu có sự giảm hoạt độ GPT đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Kết quả khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình tổn thương gan cấp bằng paracetamol Hàm lượng MDA và GSH trong gan Bảng 6. Hàm lượng MDA trong mô hình gây tổn thương gan bằng paracetamol cấp. Nhóm Lô N Hàm lượng MDA (nM/g protein) Hàm lượng GSH (nM/g protein) PARA-Điều trị Chứng bình thường 10 83,23 ± 4,35 13214,81 ± 419,82 Chứng bệnh lý 12 151,32 ±14,25# 9537,90 ± 524,09# Lô thử (2 viên/kg) 12 93,28 ± 5,68* 12211,72 ±812,34* Đối chiếu 10 105,82 ± 9,94* 11162,43 ± 564,79* PARA- Dự phòng Chứng bình thường 10 83,23 ± 4,35 13214,81 ± 419,82 Chứng bệnh lý 12 218,11 ±18,10# 4518,90 ± 349,02# Lô thử (2 viên/kg) 15 165,08 ± 1,99# 6731,92 ± 691,29* Đối chiếu 14 126,17 ± 8,09# 7152,80 ± 777,61* (*) P< 0,05 so sánh với các lô chứng bệnh lý. (#) P< 0,05 so sánh với lô chứng bình thường Nhận xét bảng 6: Ở nhóm điều trị, hàm lượng MDA ở lô thử uống viên Xích linh chi và ở lô đối chiếu giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Mặt khác, có thể thấy mẫu thử viên Xích linh chi có hiệu quả ngăn chặn quá trình peroxy hóa lipid tế bào gan tương tự như silymarin. Ở nhóm dự phòng, hàm lượng MDA ở lô chứng bệnh lý cao hơn rất nhiều so với lô chứng bình thường, hơn 2,5 lần. Tương tự như kết quả ở nhóm điều trị, hàm lượng MDA ở các lô thử uống viên Xích linh chi và lô đối chiếu trước 8 ngày cũng giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý, nhưng vẫn còn cao hơn nhiều so với lô chứng bình thường. Thực hiện t-test giữa hai lô thử và đối chiếu cho thấy có sự khác biệt thống kê giữa hai lô, nghĩa là silymarin có tác dụng dự phòng và bảo vệ gan trong mô hình gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol tốt hơn viên Xích linh chi (P = 0,013 < 0,05). Bảng 7. Hoạt độ GOT và GPT trong mô hình gây tổn thương gan cấp bằng paracetamol . Nhóm Lô N GOT(U/L) GPT (U/L) PARA- Điều trị Chứng bình thường 10 41,10 ± 1,51 39,30 ± 3,16 Chứng bệnh lý 12 80,70± 13,67# 93,11±14,87# Lô thử (2 viên/kg) 12 52,30 ± 6,04 41,67 ± 6,04* Đối chiếu 10 56,70 ± 5,98 42,27 ± 4,85* (*) P< 0,05 so sánh với các lô chứng bệnh lý. (#) P< 0,05 so sánh với lô chứng bình thường Nhận xét bảng 7: Ở thời điểm sau 24 giờ sau khi uống paracetamol, hoạt độ GOT trong huyết tương chuột tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Ở các lô điều trị bằng viên Xích linh chi hay silymarin, hoạt độ GOT có giảm nhưng không đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Ở thời điểm sau 24 giờ sau khi uống paracetamol, hoạt độ GPT trong huyết tương chuột tăng gấp 3 lần giá trị bình thường và đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường. Ở Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 97 các lô điều trị bằng viên Xích linh chi hay silymarin, hoạt độ GPT giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Kết quả khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình tổn thương gan mạn bằng paracetamol liều uống 300 mg/kg trong vòng 14 ngày Phân suất tử vong của các lô thử và đối chiếu thấp hơn lô chứng bệnh lý. Phân suất tử vong của lô đối chiếu là thấp nhất. Đa số chuột tử vong ở ngày thứ nhất sau 4-6 giờ uống paracetamol liều đầu tiên. Bảng 8. Phân suất tử vong của các lô trong mô hình gây tổn thương gan mạn. Phân suất tử vong (%) Lô Chứng Thử Đối chiếu Số con Tổng số Chết Tổng số Chết Tổng số Chết 22 15 18 8 15 5 Tỷ lệ (%) 68,18 44,44 33,33 Bảng 9. Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột trong mô hình gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol. Nhóm Lô N Hàm lượng MDA (nM/g protein) Hàm lượng GSH (nM/g protein) PARA mạn- 14 ngày Chứng bình thường 10 83,23 ± 4,35 13214,81 ± 419,82 Chứng bệnh lý 7 131,96 ± 14,57# 4800,33 ± 880,33# Lô thử (2 viên/kg) 12 80,10 ± 5,92* 8646,90 ± 1297,35* Đối chiếu 10 71,83 ± 6,98* 10526,93 ± 972,27* (*) P< 0,05 so sánh với các lô chứng bệnh lý. (#) P<0,05 so sánh với lô chứng bình thường Bảng 10. Hoạt độ GPT trong huyết tương chuột ở nhóm gây tổn thương gan mạn bằng paracetamol. Lô N GOT(U/L) GPT(U/L) Chứng bình thường 10 41,10 ± 1,51 39,30 ± 3,16 Chứng bệnh lý 12 41,42 ± 3,52 141,67 ± 39,44# Lô thử (2 viên/kg) 12 39,00 ± 2,43 68,17 ± 7,08* Đối chiếu 12 39,50 ± 3,13 59,50 ± 5,89* (*) P< 0,05 so sánh với các lô chứng bệnh lý. (#) P< 0,05 so sánh với lô chứng bình thường Nhận xét bảng 10: Các số liệu hoạt độ GOT ở các lô không có sự khác biệt về thống kê (P=0,912). Hoạt độ GPT đo được của lô chứng bệnh lý tăng cao đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường đã cho thấy gan có tổn thương. Hoạt độ GPT ở các lô thử và lô đối chiếu giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý cho thấy hiệu quả bảo vệ gan của viên Xích linh chi và silymarin. Kết quả khảo sát tác dụng bảo vệ gan của viên Xích linh chi trên mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid Bảng 11. Hàm lượng MDA và GSH trong gan trên mô hình tổn thương gan bằng cyclophosphamid Nhóm Lô N Hàm lượng MDA (nM/g protein) Hàm lượng GSH (nM/g protein) CY (-) Chứng 14 83,56 ± 4,57 12346,15 ± 385,60 ViênXích linh chi 1 viên/kg 10 77,78 ± 2,93 13194,96 ± 206,80 Silymarin 12 89,78 ± 6,00 12120,72 ± 641,65 CY (+) Chứng 12 206,36 ± 21,17# 7471,31 ± 462,44# ViênXích linh chi 1 viên/kg 10 129,52 ± 9,23* 8623,32 ± 305,13 ViênXích linh chi 2 viên/kg 11 117,12 ± 9,13* 10016,00 ± 449,03* Silymarin 12 127,42 ± 9,01* 9469,65 ± 768,30* CY (-): nhóm chuột bình thường, không tiêm cyclophosphamid. CY(+): nhóm chuột gây tổn thương gan, tiêm cyclophosphamid. #P<0,001 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY(-). *P<0,05 đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng CY(+) tương ứng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 98 Nhận xét bảng 11: Lô chứng tiêm CY, uống nước cất nước sau 8 ngày có hàm lượng MDA tăng 146,96% và hàm lượng GSH giảm 39,49%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bình thường không tiêm CY. Viên Xích linh chi hay silymarin đều không ảnh hưởng đến trị số MDA hay GSH ở gan chuột. Trong khi đó, nhóm CY(+), uống viên Xích Linh chi liều 1 viên/kg hay liều 2 viên/kg thể trọng chuột và lô đối chiếu silymarin đều có mức tăng MDA thấp hơn (từ 37,24 – 43,24%), đạt ý nghĩa thống kê so với lô chuột chứng tiêm cyclophosphamid. Tương tự, viên Xích linh chi 2 viên/kg và silymarin mang lại sự phục hồi một phần chỉ số GSH, tương ứng là 34,06% và 29,42% so với lô chứng tiêm cyclophosphamid, uống nước cất. BÀN LUẬN Carbon tetrachlorid là một trong những độc tố gây nhiễm độc gan mạnh. Sau khi vào cơ thể, carbon tetrachlorid được hệ thống enzym cytochrom P-450 trong gan chuyển hóa thành gốc tự do trichloromethyl (CCl3·), sau đó chuyển hóa thành trichloromethyl peroxyl (Cl3COO·) trong điều kiện hiếu khí (nhiều oxy) và cuối cùng phân hủy thành độc chất phosgen (COCl2). Gốc CCl3· tác động phá hủy các hệ thống chuyển hóa quan trọng như bơm ion canxi, làm giảm nồng độ canxi hấp thu, gây tăng hàm lượng Ca2+ nội bào, làm hoạt hóa một chuỗi các enzym thủy phân phá hủy tế bào. Còn gốc Cl3COO· có ái lực điện tử mạnh, tấn công các acid béo không no dẫn đến sự peroxy hóa lipid màng tế bào và gây chết tế bào (2). MDA gan là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid tế bào gan, hàm lượng MDA trong gan càng cao chứng tỏ gan bị tổn thương oxy hóa càng nặng. Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự tăng cao hàm lượng GPT, bilirubin trong huyết tương và tăng hàm lượng MDA trong gan, song song với giảm hàm lượng chất chống oxy hóa nội sinh GSH trong gan cho thấy carbon tetrachlorid đã gây ra tổn thương gan điển hình. Hàm lượng GSH ở lô uống viên Xích linh chi liều 2 viên/kg thể trọng chuột tăng cao đạt ý nghĩa thống kê so với cả lô bình thường và lô thuốc đối chiếu silymarin cho thấy viên Xích Linh chi ở liều 2 viên/kg có tác dụng hỗ trợ rất tốt cho hệ thống chống oxy hóa nội sinh ở gan, góp phần bảo vệ các tế bào gan. Ngoài ra, viên Xích linh chi liều 2 viên/kg còn đưa về giá trị bình thường các chỉ số GPT, bilirubin trong huyết tương và hàm lượng MDA trong gan, cho thấy hiệu quả bảo vệ gan của viên Xích linh chi trước độc tính của carbon tetrachlorid. 90-95% paracetamol được chuyển hóa ở gan thông qua hai con đường glucuronid hóa và sulfat hóa để tạo ra các chất dễ đào thải ra ngoài bởi thận. Chỉ một phần nhỏ paracetamol được chuyển hóa bởi hệ thống enzym cytochrom P- 450 ở gan để tạo thành các N-acetyl-p-benzo- quinone imine độc (gọi tắt là NAPQI). Nhưng NAPQI sinh ra ở liều dùng paracetamol thông thường rất ít và nhanh chóng bị các nhóm chất có chứa sulfhydryl (như cystein và N- acetylcystein) và glutathion (GSH) trong gan liên kết chặt chẽ tạo ra các tổ hợp không độc và bị đào thải ra ngoài. Khi dùng quá liều paracetamol sẽ sinh ra nhiều NAPQI dẫn đến suy giảm đáng kể glutathion hoặc tạo liên kết cộng hóa trị với các phân tử sinh học như protein, lipid, và acid nucleic của tế bào gan, từ đó gây suy giảm chức năng các tế bào gan, gây nên tổn thương gan với biểu hiện tăng cao các men gan GOT và GPT. Độc tính của paracetamol tăng kéo theo sự suy giảm GSH nội sinh trong gan, do đó gián tiếp làm tăng quá trình peroxy hóa lipid dẫn đến hàm lượng MDA tăng. Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự giảm hàm lượng GSH và tăng hàm lượng MDA trong gan ở lô chứng uống paracetamol so với lô chứng bình thường. Ở nhóm điều trị, kết quả cho thấy hiệu quả tốt của viên Xích linh chi và silymarin lên sự phục hồi GSH trong gan khi hàm lượng GSH của hai lô thử và đối chiếu cao hơn đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh lý. Tương tự, ở nhóm dự phòng cũng chứng tỏ được hiệu quả tốt của viên Xích linh chi và silymarin khi phục hồi lại hàm lượng GSH tăng cao đạt ý nghĩa thống kê so với Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 1 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 99 lô chứng bệnh lý. Như vậy, kết hợp các kết quả cho thấy viên Xích linh chi liều 2 viên/kg thể trọng chuột có tác dụng bảo vệ gan trong cả hai phác đồ điều trị và dự phòng trước tổn thương oxy hóa gây bởi paracetamol thông qua việc điều chỉnh về bình thường sự tăng men gan GPT trong huyết tương, làm tăng hàm lượng chất chống oxy hóa nội sinh GSH trong gan chuột, dẫn đến làm giảm sự gia tăng hàm lượng MDA trong gan. Cyclophosphamid, một thuốc hóa trị hay sử dụng trong phác đồ điều trị ung thư, được biến đổi sinh học tại gan thành 4- hydroxycyclophosphamid và aldophosphamid có tính alkyl hóa, dẫn đến sự hình thành các tác nhân gây độc tế bào như acrolein và chloroacetaldehyd(1). Kết quả thực nghiệm ghi nhận cyclophosphamid làm giảm hàm lượng GSH và tăng hàm lượng MDA trong gan. Điều này cho thấy GSH và những nhóm chất có chứa sulfhydryl với chức năng giải độc đã thông qua hệ thống cytocrom P- 450 tương tác với acrolein, chất chuyển hóa của cyclophosphamid trong cơ thể. Độc tính của cyclophosphamid tăng kéo theo sự suy giảm GSH nội sinh trong gan, do đó gián tiếp làm tăng quá trình peroxy hóa lipid dẫn đến hàm lượng MDA tăng. Lô tiêm cyclophosphamid và uống viên Xích Linh chi ở liều 2 viên/kg trong 8 ngày có tác dụng ức chế sự gia tăng hàm lượng MDA và làm tăng hàm lượng GSH trong gan đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, cho thấy viên Xích Linh chi thể hiện tác dụng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây tổn thương oxy hóa bằng cyclophosphamid. Tác dụng bảo vệ gan của viên Xích Linh chi trong các thực nghiệm gây tổn thương gan do thuốc hay độc chất tương tự như tác dụng của thuốc đối chiếu silymarin, hoạt chất được chiết xuất từ cây Silybum marianum (Cúc gai). KẾT LUẬN Từ kết quả nghiên cứu tác dụng theo hướng bảo vệ gan trên các mô hình thực nghiệm cho thấy viên Xích linh chi có thể được sử dụng hỗ trợ để làm giảm tác dụng phụ do các thuốc hóa trị liệu ung thư và có hiệu quả bảo vệ gan cho các bệnh nhân bị ung thư cũng như bị các bệnh lý về gan. Đề tài này được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của Công ty TNHH TMDVSX Từ Tâm (646M Nguyễn Trãi, Phường 11, Quận 5, TP. HCM). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abraham P, Sugumar E.(2008). Increased glutathione levels and activity of PON1 (phenyl acetate esterase) in the liver of rats after a single dose of cyclophosphamide: a defense mechanism?. Exp. Toxicol. Pathol., 59(5): pp. 301 - 306. 2. Alant Williams and Raymond F. Burk (1990). Carbon tetrachloride hepatotoxicity: an example of free radical-mediated injury, Seminars in Liver Disease, 10(4): pp. 279 -2 81. 3. Boh B., Berovic M., Zhang J., Zhi-Bin L.(2007). Ganoderma lucidum and its pharmaceutically active compounds, Biotechnol. Annu. Rev., pp. 265 - 301 4. Hissin P.J., Hilf R. (1976). A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues, Anal. Biochem., 74: pp. 214 - 226 5. Kanjana Somanawat, Duangporn Thong-Ngam, Naruemon Klaikeaw (2013). Curcumin attenuated paracetamol overdose induced hepatitis, World J. Gastroenterology, 19(12): pp. 962 - 1967 6. Nguyễn Thị Thu Hương, Nguyễn Thị Ngọc Hằng (2010). Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của nấm Linh chi đỏ (Ganoderma lucidum), Tạp chí Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 14, Phụ bản của số 2, tr. 129 - 134. 7. Stroev E. A., Makarova V. G. (1989). Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory. In: Manual in Biochemistry, Moscow Publishers, pp. 243 - 256. Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/10/2013, 21/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014