Tác dụng chống oxi hóa của cao chiết diệp hạ châu – râu mèo trên thực nghiệm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 170 TÁC DỤNG CHỐNG OXI HÓA CỦA CAO CHIẾT DIỆP HẠ CHÂU – RÂU MÈO TRÊN THỰC NGHIỆM Đỗ Thị Quỳnh Nga*, Nguyễn Phương Dung* TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Cho tới nay, đã có một số công trình nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ acid uric máu (do ức chế xanthin oxidase) của Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.), cũng như tác dụng tăng thải acid uric qua nước tiểu và chống oxi hóa của Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.). XO là một chất oxi hóa xúc tác trong quá trình tạo ra acid uric máu. Đề tài này được thực hiện với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxi hóa, ức chế XO của cao chiết từ Diệp hạ châu và Râu mèo trên chuột nhắt trắng. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Cao đặc Diệp hạ châu đắng do Trung tâm dược liệu Miền trung sản xuất. Cao khô Râu mèo do công ty dược phẩm BV Pharma cung cấp. Nghiên cứu in vitro: Khảo sát hoạt tính ức chế xanthin oxidase (XO) của cao Diệp hạ châu, cao Râu mèo và cao phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo với các tỷ lệ phối hợp khác nhau. Xác định khả năng ức chế peroxi hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl diadehyd (MDA). Kết quả: Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo ở tỷ lệ phối hợp 4:1 có hoạt tính ức chế XO với IC50 là 43,83µg/ml. Tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần cao khô Râu mèo cho hiệu quả ức chế oxi hóa tối ưu nhất, ở nồng độ 50µg/ml là 66,79% tương đương với hoạt tính của trolox ở nồng độ 5mM (63,49%). Kết luận: Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo có hoạt tính ức chế XO, có tác dụng chống oxi hóa trên thực nghiệm. Kết quả này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng cao chiết phối hợp này trong điều trị tăng acid uric máu và các rối loạn khác do chất oxi hóa gây ra. Từ khóa: Diệp hạ châu đắng, Râu mèo, ức chế XO, chất oxi hóa, tác dụng chống oxi hóa. ABSTRACT THE ANTIOXIDATIVE EFFECT OF PHYLLANTHUS AMARUS – ORTHOSIPHON STAMINEUS EXTRACT IN VITRO Do Thi Quynh Nga, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 170 - 174 Objectives: There have been researches proven the hypouricemic and diuretic effect of Phyllanthus amarus, the diuretic effect and uric excretion of Orthosiphon stamineus. Xanthine oxidase is an enzyme that catalyses in uric acid producing process. Our study was done with the aim of surveying antioxidative effect of coordinated extract from Phyllanthus amarus and Orthosiphon stemineusin vitro. Methods: Aqueous extract of Phyllanthus amarus was produced by The Central of Research and Manufacture Mien Trung. Dry extract of Orthosiphon stamineus was provided by BV Pharma Company. In vitro study: Surveying the xanthine oxidase (XO) inhibitory activity of extract from Phyllanthus amarus, extract from Orthosiphon stamineus and coordinated extract from Phyllanthus amarus and Orthosiphon stamineus. Surveying the inhibition of lipid peroxidation using malonyl diadehyde (MDA) test. Results: The in vitro study confirmed that coordinated extract in 4:1 ratio has XO inhibitory activity with IC50 at 43.83 µg/ml. Coordinated extract in 1:1 ratio has optimal inhibitory effect, at50μg/ml concentrationis ∗ Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Đỗ Thị Quỳnh Nga ĐT: 0984128211 Email: dtquynhngath@hotmail.com.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 171 equivalent to 66.79% of Trolox activity at a concentration 5mM (63.49%). Conclusion: The coordinated extract of Phyllanthus amarus and Orthosiphon stamineus has XO inhibitory activity, antioxidative effect invitro. These results will be the basis for researches and applications in the treatment of hyperuricemia and other disorders caused by oxidants. Keywords: Phyllanthus amarus Schum et Thonn, Orthosiphon stamineus Benth, xanthine oxidase inhibitory activity, oxidant, antioxidative effect. ĐẶT VẤN ĐỀ Gốc tự do là sản phẩm của quá trình oxi hóa các chất trong cơ thể. Tuổi càng cao thêm vào đó là thói quen lạm dụng độc chất (thuốc lá, cà phê, dược phẩm...), dinh dưỡng sai lầm làm cho lượng gốc tự do trong cơ thể càng tăng lên nhiều. Khi có sự tăng quá nhiều gốc tự do sẽ gây ra tình trạng viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh, đục thuỷ tinh thể, thoái hóa hoàng điểm ở mắt, tăng nguy cơ các bệnh ung thư và nhất là sớm xuất hiện hiện tượng lão hoá. Một trong những gốc tự do thường gặp là XO – một gốc tự do chịu trách nhiệm một khâu trong quá trình tạo ra acid uric máu. Mà tăng acid uric máu là một dạng rối loạn chuyển hóa thường gặp, chiếm tỉ lệ từ 2,6 – 47,2% ở các dân số khác nhau và có xu hướng ngày càng gia tăng. Trong đó, trên 90% là tăng acid uric máu đơn thuần không có triệu chứng lâm sàng. Trước đây, khi nói tới tăng acid uric máu thường người ta chỉ nghĩ tới bệnh gout, tuy nhiên hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu bệnh l ý quan trọng khác như: tăng huyết áp, bệnh mạch máu não, bệnh lý chuyển hóa, bệnh thận, tiền sản giật. Diệp hạ châu và râu mèo là hai cây thuốc nam đã được chứng minh là có tác dụng chống oxi hoá rất cao và có khả năng ức chế XO độc lập. Đề tài này được thực hiện với mục đích tìm hiểu tác dụng chống oxi hóa, ức chế XO của cao chiết từ XO Diệp hạ châu và Râu mèo để làm cơ sở cho những nghiên cứu chế phẩm tiếp theo. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Cao đặc Diệp hạ châu được chiết xuất từ lá cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), trồng theo tiêu chuẩn VietGAP. Cao được chiết bằng thiết bị chiết đa năng tại Trung tâm dược liệu Miền trung, với 3 thành phần chính là phyllanthin > 2000 mg/kg, hypophyllanthin > 1000 mg/kg và nirantin > 1500 mg/kg. Độ ẩm của cao là 29,87%. Cao khô Râu mèo được chiết xuất từ cây Râu mèo (Orthosiphon aristatus (Blume.) Miq.), họ Hoa môi (Lamiaceae), do công ty dược phẩm BV Pharma cung cấp, với thành phần chính là sinensetin > 0,2%. Độ ẩm của cao là 3,39%. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino, khỏe mạnh, 5 – 6 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Pasteur TP. HCM và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Thuốc thử nghiệm Thuốc đối chiếu: Allopurinol 300 mg (công ty Domesco, Việt Nam, số đăng ký VNB-4166-05, số lô 010111, hạn sử dụng 170114). Hoá chất: Xanthin (Sigma, USA); xanthin oxidase (Sigma); oxonat kali (Sigma Aldrich, USA); kit định lượng acid uric (uric acid liquicolor, Human ltd.Co., Đức); nước cất, NaCl 0,9%, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid); đệm phosphat 50 mM, pH = 7,4; đệm EDTA phosphat 50 mM, pH = 7,4. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 172 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu in vitro xác định hoạt tính ức chế xanthin oxidase(3) Xanthin oxidase (XO) có tác dụng xúc tác phản ứng oxi hóa xanthin thành uric acid, đồng thời hình thành gốc tự do. Ta sử dụng phương pháp trắc quang để khảo sát khả năng ức chế enzym XO của các mẫu thử thông qua mật độ quang của sản phẩm acid uric hình thành. Acid uric có bước sóng hấp thu cực đại tại 290nm. Chất có khả năng ức chế XO càng cao càng ức chế sự hình thành uric acid, do đó mật độ quang đo được sẽ giảm. Quy trình thử hoạt tính ức chế xanthin oxidasetheo bảng sau: Mẫu trắng được tiến hành tương tự nhưng thay enzym và mẫu thử bằng đệm. Mẫu chứng có dịch enzym nhưng không có mẫu thử mà thay bằng đệm. Sử dụng allopurinol làm chất đối chứng dương. Đo mật độ quang ở bước sóng 290 nm liên tục mỗi 3 phút trong 30 phút tính từ lúc cho xanthin vào cuvet. Khả năng chống oxi hóa của các hợp chất được tính dựa trên phần trăm ức chế (%I) xác định theo công thức: Với: Ac là giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu thử (control). As là giá trị mật độ quang của dung dịch có chứa mẫu thử (sample). Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần, ứng với mỗi nồng độ ta tính được 3 giá trị phần trăm ức chế (%I). Lấy trung bình 3 giá trị % I từ đó ta sẽ xác định được giá trị phần trăm ức chế ứng với từng nồng độ khảo sát. Mỗi mẫu thử được pha thành bốn nồng độ khác nhau: 100;50;25;10μM. Nếu hoạt tính của mẫu thử ức chế trên 50%ở 10 μM thì sẽ được thử tiếp ở các nồng độ nhỏ hơn 5;2;1;0,5;0,2μM để tìm ra giá trị IC50. Giá trị IC50 μg/ml (nồng độ có khả năng ức chế 50%) của mẫu được tính dựa trên đồ thị hồi quy tương quan giữa nồng độ (Cpư) và khả năng ức chế (I%). Khả năng ức chế peroxi hóa lipid.(2, 1) Xác định khả năng ức chế peroxi hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng MDA, là sản phẩm của quá trình peroxi hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin có đỉnh hấp thu cực đại ở λ = 532 nm. 0,1ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não và đệm phosphate 50 mM vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 370C trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ 1000C. Làm lạnh và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 532 nm. Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được dùng làm chất đối chiếu. Công thức tính phần trăm (%) hoạt tính chống oxi hóa (HTCO): HTCO (%) = 100 )( × − C TC OD ODOD ODC: Mật độ quang mẫu đối chứng (DMSO). ODT: Mật độ quang mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo khác nhau. Cách tính IC50: Vẽ đồ thị biểu diễn tỷ lệ % I% = (1 – Ac/As) x 100 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 173 khả năng dập tắt gốc tự do của chất cần thử nghiệm bằng phần mềm Excel. Từ đồ thị, nội suy ra giá trị nồng độ dập tắt gốc tự do IC50 bằng cách tính phương trình hồi quy tuyến tính có dạng y = ax + b và thế y = 50 để suy ra IC50. Phương pháp xử lý số liệu thống kê thực nghiệm Dùng phần mềm Stata 10.0 để tính các giá trị thống kê mô tả: số trung bình, độ lệch chuẩn. Ứng dụng phép kiểm t – Student độc lập để so sánh 2 số trung bình của 2 lô khác nhau trong cùng một thời điểm. Ứng dụng phép kiểm one way Anova để đánh giá sự khác biệt về trị số acid uric của các lô thử nghiệm trong cùng một thời điểm. KẾT QUẢ Tác dụng ức chế xanthin oxidase của các tỷ lệ phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo khác nhau Thuốc đối chiếu allopurinol có khả năng ức chế XO ở nồng độ rất thấp và cho kết quả IC50 = 0,063 μg/ml. Cả 9 công thức phối hợp đều thể hiện tác dụng ức chế XO, thứ tự khả năng ức chế giảm dần là: 4DHC:1RM >3DHC:1RM > 2DHC:1RM > 1DHC:2RM > 1DHC:3RM > 2DHC:5RM > 1DHC:4RM > 1DHC:1RM. Trong đó, các công thức phối hợp 4DHC:1RM, 3DHC:1RM, 2DHC:1RM có khả năng ức chế XO mạnh hơn cao độc vị Diệp hạ châu và cao độc vị Râu mèo. Bảng 1: Kết quả thử hoạt tính ức chế xanthin oxidase STT Tên mẫu Phần trăm ức chế IC50 (µg/mL) 100 (µg/mL) 50 (µg/mL) 25 (µg/mL) 10 (µg/mL) 1 4DHC:1RM 71,0 ± 1,5 52,2 ± 3,5 43,23 ± 0,45 16,7 ± 2,7 43,83 2 3DHC:1RM 61,2 ± 2,9 41,6 ± 1,4 21,84 ± 0,78 8,76 ± 0,59 71,36 3 2DHC:1RM 63,3 ± 1,8 34,61 ± 0,99 24,1 ± 1,4 9,6 ± 4,3 76,81 4 DHC 69,05 ± 0,80 48,6 ± 1,9 33,9 ± 2,6 19,7 ± 1,9 84,46 5 RM 57,2 ± 2,2 30,7 ± 1,3 5,9 ± 2,2 2,31 ± 0,81 87,65 6 1DHC:2RM 43,80 ± 0,97 35,04 ± 0,81 19,0 ± 3,0 9,4 ± 1,9 > 100 7 1DHC:3RM 40,97 ± 1,8 20,95 ± 0,82 6,6 ± 1,6 - > 100 8 3DHC:2RM 32,8 ± 1,5 15,3 ± 2,0 2,9 ± 2,3 - > 100 9 2DHC:5RM 32,0 ± 2,2 24,2 ± 2,5 18,9 ± 1,6 5,2 ± 2,3 > 100 10 1DHC:4RM 30,38 ± 0,39 18,7 ± 2,1 9,8 ± 1,9 3,6 ± 2,9 > 100 11 1DHC:1RM 30,09 ± 0,61 17,1 ± 2,7 6,1 ± 3,5 - > 100 allopurinol 0,063 Khả năng ức chế peroxi hóa lipid Bảng 2. Kết quả thử trên test MDA của các tỷ lệ phối hợp cao chiết Diệp hạ châu và Râu mèo Nồng độ (µg/ml) HTCO (%) 1DHC:1R M 2DHC:1R M 3DHC:1R M 4DHC:1R M 5DHC:1R M 2000 91,30 86,72 86,26 84,96 75,88 1000 91,30 80,38 79,01 76,64 76,18 500 90,46 73,82 67,63 65,80 62,82 250 89,16 53,59 57,71 63,36 54,96 100 82,37 30,76 53,82 56,34 45,50 50 66,79 20,38 48,24 46,49 40,23 10 32,52 5,73 24,35 27,02 16,56 Cả 5 tỷ lệ phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo trong nghiên cứu đều thể hiện hoạt tính ức chế peroxi hóa lipid tăng theo nồng độ khảo sát. Trong đó, nhìn sơ bộ cho thấy tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc diệp hạ châu và 1 phần cao khô râu mèo cho hiệu quả ức chế tối ưu nhất. Tỷ lệ phối hợp này đạt hoạt tính chống oxi hoá ở nồng độ 50μg/ml là 66,79% tương đương với hoạt tính của trolox ở nồng độ 5mM (63,49%). Bảng 3. Kết quả thử trên mẫu đối chiếu Trolox/MDA Nồng độ (mM) OD HTCO% 0,1 0,529 4,86 0,5 0,445 19,96 1 0,376 32,37 5 0,203 63,49 10 0,124 77,70 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 174 BÀN LUẬN Khả năng ức chế xanthin oxidase Theo bảng kết quả thử hoạt tính ức chế XO cho thấy, diệp hạ châu ức chế XO nhiều hơn râu mèo và khi kết hợp Diệp hạ châu và Râu mèo theo tỷ lệ 4:1 thì khả năng ức chế XO lại lớn hơn gấp đôi so với độc vị Diệp hạ châu. Mặc dù khả năng ức chế XO của cao chiết phối hợp Diệp hạ châu + Râu mèo tỷ lệ 4:1 nhỏ hơn nhiều so với allopurinol nhưng tác dụng hạ acid uric máu của cao chiết phối hợp Diệp hạ châu + Râu mèo lại không khác biệt so với allopurinol. Điều này chứng tỏ ngoài khả năng ức chế XO, cao chiết phối hợp Diệp hạ châu + Râu mèo còn có thể có tác dụng tăng thải acid uric hoặc làm tiêu uric acid. Khả năng ức chế peroxi hóa lipid Kết quả thử nghiệm cho thấy cả 5 tỷ lệ phối hợp giữa diệp hạ châu và râu mèo trong thử nghiệm đều thể hiện khả năng ức chế tạo MDA rất rõ đặc biệt là tỷ lệ phối hợp 1 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần cao khô Râu mèo. KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra kết luận sau Tỷ lệ phối hợp 4 phần cao đặc Diệp hạ châu và 1 phần Râu mèo thể hiện khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nhất. Cao chiết phối hợp Diệp hạ châu – Râu mèo thể hiện khả năng ức chế tạo MDA in vitro rất rõ. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Antolovich M, Prenzler PD, Patsalides E, McDonald S and Robards K (2002). “Methods for testing antioxidant activity”, Analyst, vol. 127, pp. 183-198. 2. Bộ Y Tế, Viện Dược Liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ dược thảo. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 279 - 293. 3. Mai Thanh Thi Nguyen, Suresh Awale, Yasuhiro Tezuka, Liying Shi (2005). “Hypouricemic Effects of Acacetin and 4,5-O- Dicaffeoylquinic Acid Methyl Ester on Serum Acid uric Levels in Potassium Oxonat – Pretreated Rats”, Biologycal and pharmaceutical Bulletin, pp. 2231 – 2234 Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/10/2013, 15/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014