Thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của tinh dầu ba loài ngải sậy An Giang

151 THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA TINH DẦU BA LOÀI NGẢI SẬY AN GIANG Trần Công Luận∗ ,Nguyễn Thị Phương Thảo*,Trần Thu Hoa∗∗ TÓM TẮT Mục ñích nghiên cứu: Thực hiện các khảo sát về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu ba loài Ngải sậy An Giang, gồm Ngải sậy củ nhỏ (SN), Ngải sậy củ lớn (SL) và Ngải sậy Campuchia (SC) Phương pháp nghiên cứu: Chiết tách tinh dầu bằng kỹ thuật lôi cuốn hơi nước, phân tích thành phần tinh dầu bằng phương pháp GC/MS. Phương pháp Sulforhodamin B (SRB) khảo sát khả năng gây ñộc tế bào HeLa và DNA phân mảnh ñể khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis. Phương pháp khuếch tán trên bản thạch ñể thử hoạt tính kháng nấm. Kết quả: Xác ñịnh ñược thành phần hoá học trong tinh dầu của ba loài Ngải Sậy. Tinh dầu SL chứa hàm lượng zerumbon cao và có tác dụng chống phân bào trên dòng tế bào ung thư tử cung HeLa ở nồng ñộ ức chế 50% là 5,81 ± 0,47 µg/ml so với của tinh dầu SN là 17,19 ± 2,73 µg/ml, ñồng thời thể hiện tính cảm ứng trong quá trình apoptosis trên tế bào HeLa. Tinh dầu ba loài Ngải sậy, ñặc biệt là Ngải sậy Campuchia có hoạt tính kháng nấm tốt trên một số loại nấm da và Candida albicans (MIC từ 0,3125 µl/ml ñến 2,5 µl/ml). Kết luận: Tinh dầu ba loài Ngải sậy thuộc chi Zingiber có thành phần các cấu tử khác nhau, ñặc biệt Ngải sậy củ lớn chứa hàm lượng zerumbon cao (52,4%). Có thể phát triển Ngải sậy củ lớn làm nguồn nguyên liệu chiết zerumbon, dùng ñể phòng chống ung thư. Từ khóa: Essential oil, Zingiberaceae, cytotoxic activity, apotosis, antifungal properties ABSTRACT CHEMICAL COMPONENTS AND SOME BIOLOGICAL ACTIVITIES OF ESSENTIAL OILS FROM THREE SPECIES “NGAI SAY” AT AN GIANG PROVINCE Tran Cong Luan, Nguyen Thi Phuong Thao, Tran Thu Hoa Objectives: Study on chemical components and bioactivities from the essential oils of three species “Ngai say” at An Giang province, include Ngai say cu nho (SN), Ngai say cu lon (SL) and Ngai say Campuchia (SC). Methods: The essential oils obtained by steam distillation of their rhizomes. The chemical components was analysedt by means of GC/MS method. The cytotoxic properties was examined by sulfohrodamine method and apoptogenic effects on HeLa cells by DNA fragmentation technique and antifungal properties was tested by semi-solid agar dilution method. Results: Chemical components of essential oils from rhizomes of three Zingiber species “Ngai say” were identified by GC/MS: SL essential oil contained 52.4% zerumbone and showed significantly antiproliferative activity upon HeLa cells with IC50 of 5.81 ± 0.47 µg/ml in comparison with IC50 of 17.19 ± 2.73 µg/ml of SN essential oil. All three essential oils, especially SC, showed antifungal activity against skin fungi and Candida albicans (MIC from 0.3125 µl/ml to 2.5 µl/ml). Conclusion: The percentage of chemical components in essential oils from rhizomes of three Zingiber species “Ngai say” was difference; especially zerumbone in SL (52.4%). The high production yield is an encouragement to An Giang province for developing SL to supply original source of zerumbone to be used for the prevention or treatment of cancer. Key words: Essential oil, Zingiberaceae, cytotoxic activity, apotosis, antifungal properties ĐẶT VẤN ĐỀ Họ Gừng ở Việt Nam có từ 17 ñến 20 chi và trên gần 100 loài. Các cây họ Gừng ñã ñược sử dụng từ lâu ñời. Người ta dùng thân rễ của chúng ñể làm thuốc như Riềng nếp giúp tiêu hóa, ñau bao tử; dùng Nghệ trị ñau dạ dày, làm mau lành vết thương; Gừng giúp tiêu hóa trị ho, ñau bụng[9]. Ngoài ra, các tác dụng kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu các loài thuộc họ Gừng cũng ñược quan tâm nghiên cứu ở trên thế giới[2,3,4,6,7]. Dựa trên kết quả các nghiên cứu trước ñây về một số cây họ Gừng ở vùng Bảy Núi – Tịnh Biên - An Giang, kết quả cho thấy tác dụng ñộc tế bào của tinh dầu Ngải sậy là mạnh nhất, tiếp nối kết quả các này chúng tôi ñi sâu vào thu thập và nghiên cứu thành phần tinh dầu, cơ chế kháng ung thư và khả ∗ Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM ∗∗ Đại học Y Dược Tp. HCM Địa chỉ liên hệ: TS. Trần Công Luận ĐT: 0903671323 Email: congluan53@gmail.com 152 năng kháng nấm của tinh dầu loại Ngải sậy này. Vấn ñề ñặt ra là trong quá trình thu mẫu chúng tôi phát hiện có ñến ba loài ñược người ñịa phương gọi là “Ngải sậy”, gồm Ngải sậy Campuchia, Ngải sậy củ nhỏ (giống với mẫu Ngải sậy trong các nghiên cứu trước ñây) và Ngải sậy củ lớn. Tuy cùng ñược gọi là Ngải sậy, nhưng ba loại này có nhiều ñiểm khác nhau ban ñầu về hình dạng, màu sắc, mùi vị. Đây là một trong những khó khăn lớn khi sử dụng, phát triển các cây thuốc theo kinh nghiệm dân gian. Với mong muốn phát huy tiềm lực cây thuốc của Việt Nam, ñặc biệt là nguồn Ngải ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của tinh dầu 3 loại Ngải sậy này. ĐỐI TƯỢNG –PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Thân rễ tươi của ba loài Ngải sậy gồm Ngải sậy củ nhỏ (SN), Ngải sậy củ lớn (SL) và Ngải sậy Campuchia (SC) thu hái tại vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 3/2009, ñược công ty Cổ Phần Xuất Nhập Khẩu Y Tế Domesco Đồng Tháp cung cấp. Các mẫu ñược ñịnh danh ñến tên chi là Zingiber và ñược lưu mẫu ở Trung tâm Sâm và Dược liệu Tp. HCM. Phương pháp nghiên cứu: - Chiết tách tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước với bộ Clevenger từ 500g thân rễ tươi của ba loài Ngải sậy thu ñược 2,4 ml (0,48%); 3,8 ml (0,76%), 7,1 ml (1,42%) lần lượt với SN, SL và SC. - Phân tích thành phần tinh dầu bằng kỹ thuật GC/MS trên máy Máy GC: Agilent technology 5973 inert. Điều kiện thực hiện GC/MS: Cột HP 5 MS – 0,25 µm×30 m; khí mang He; ñầu dò MS. Chương trình nhiệt: 60 ºC trong 2 phút, tăng 6 ºC trong 1 phút ñến 280 ºC giữ trong 30 phút. - Xác ñịnh ñộc tính tế bào trên 3 dòng tế bào: Ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI – H460), và ung thư vú MCF – 7, sàng lọc thô với phương pháp Sulforhodamin B (SRB)[1] của tinh dầu 3 loài Ngải sậy ở nồng ñộ 100 µg/ml, sau ñó xác ñịnh IC50. Dựa trên kết quả IC50 tiếp tục khảo sát khả năng cảm ứng apoptosis bằng phương pháp DNA phân mảnh[1] Thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử của Bộ Môn Di Truyền, khoa sinh học, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp.HCM. - Xác ñịnh hoạt tính kháng nấm bằng phương pháp khuếch tán trong bản thạch[2]. Xác ñịnh nồng ñộ ức chế tối thiểu MIC bằng phương pháp pha loãng trong môi trường Sauboroud bán rắn. Các vi nấm thử gồm Candida albicans ATCC 10231, Candida nonalbicans 051, Candida albicans 955, Candida nonalbicans 279, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton terestres, Trichophyton tonsurans. KẾT QUẢ Thành phần tinh dầu phân tích bằng GC/MS Kết quả phân tích GC/MS cho thấy các tinh dầu có thành phần rất khác nhau về số lượng và hàm lượng của các hợp chất cấu thành (Bảng 1). Cụ thể trong tinh dầu SN có 30 hợp chất với 3 thành phần chính là eucalyptol (18,1%), L-terpinen-4-ol (18,4) và epiglobulol (12,7%). Trong tinh dầu NL có 21 hợp chất với thành phần chủ yếu là zerumbon (52,4%), hợp chất này có tiềm năng ñể làm thuốc phòng và ñiều trị ung thư [4]Trong tinh dầu NC có 25 hợp chất với L-terpinen-4-ol chiếm ưu thế (30,6%). Bảng 1. Thành phần hóa học trong 3 loại tinh dầu Stt Thành phần hóa học SN SL SC 1 1-Isopropyl-4- methylbicyclo[3.1.0]hex-2-en 0,367 - 0,868 2 1R-α-pinen 2,675 1,706 2,155 3 Camphen 2,392 7,065 0,425 4 Sabinen 5,910 - 8,779 5 L-β-pinen 7,830 0,2 - 6 Pseudopinen 0,605 - 7,830 7 Terpinolen 0,151 - - 8 Eucalyptol 18,101 - - 9 γ-terpin 0,43 - - 10 5-Isopropyl-2- methylbicyclo[3,1,0]hexan-2-ol 0,640 - 1,267 11 β-cis-terpineol 0,284 - 0,939 12 Trans,1-methyl,4-(1- methylethyl),2-cyclohexen-1-ol. 0,51 - - 13 Cis,1-methyl,4-(1- methylethyl),2-cyclohexen-1-ol. 0,567 - 1,875 14 Borneol 0,677 0,29 - 15 L-terpinen-4-ol 18,415 - 30,593 16 5-Caranol, (1S,3R,5S,6R)-(-)- 4,7,7- 2,308 - - 153 Trimethylbicyclo[4,1,0]heptan- 2-ol 17 δ-elenen 1,545 - - 18 Elixen 1,494 - - 19 β-cuveben 0,441 - - 20 α- himachalen 0,548 - - 21 Epiglobulol 12,736 - - 22 Elemol 0,523 - - 23 Isoaromadendrene epoxid 0,408 0,965 24 Cubenol 0,42 - - 25 Guaiol 0,563 - - 26 α-eudesmol 0,258 - - 27 Guaien 0,874 - - 28 γ-eudesmol 6,951 - 29 1,1,4,7-Tetramethyl- 1a,2,3,4,4a,5,6,7b-octahydro- 1H-cyclopropa[e]azulen 3,579 - - 30 β-eudesmol 7,788 1,862 - 31 Tricyclen - 0,104 - 32 3-caren - 1,052 - 33 Eucalyptol - 2,678 - 34 Camphor - 3,678 - 35 β-caryophyllen - 0,553 - 36 α-caryophyllen - 9,271 - 37 5,5-dimetyl-4-(3-methyl-1,3- butadienyl)-1- Oxaspiro[2.5]octan - 0,271 - 38 Caryophyllene oxid - 2,122 - 39 1,5,5,8-Tetrametyl-12- oxabicyclo[9.1.0]dodeca-3,7- dien - 6,197 - 40 Aromadendrene oxid-(2) - 5,054 - 41 Hydroxy-Neoisolongifolan - 0,824 - 42 4-methylene-1-methyl-2-(2- methyl-1-propen-1-yl)-1-vinyl Cycloheptan - 0,654 - 43 Aromadendrene oxid-(2) - 1,268 - 44 Diepicedrene-1-oxid - 1,826 - 45 Zerumbon - 52,361 - 46 α-thujien - - 0,493 47 5-Isopropyl-2- methylbicyclo[3.1.0]hex-2-en - - 0,963 48 α-terpinen - - 4,722 49 β-cymen - - 1,490 50 β-phellandren - - 4,938 51 γ-terpinen - - 8,066 52 Terpinolen - - 2,112 53 Trans-1-metyl-4-(1- methylethyl)-2-cyclohexen-1-ol - - 1,267 54 Gaiacylacton - - 0,202 55 1,2-Methoxy-4-methyl-6-[(1E)-1-propenyl]phenol - - 0,199 56 α-zingiberen - - 0,504 57 3,5,5-Trimetyl-9-metylen- 2,4a,5,6,7,8,9,9a-octahydro- 1H-benzo[a]cyclohepten - - 0,123 58 4-Butyl-1,2-dimethoxybenzen - - 0,097 59 β-sesquiphellandren - - 1,019 60 2-Allyl-1,4-dimethoxy-3-methyl-benzen - - 3,301 61 2-Methoxy-4-metyl-6-[(1E)-1-propenyl]phenol - - 0,886 Tổng số thành phần 30 21 25 Hoạt tính kháng ung thư 154 Kết quả thử nghiệm sàng lọc sơ bộ ở nồng ñộ 100 µg/ml, trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư phổi NIC – H460, ung thư vú MCF - 7, cho thấy tinh dầu SN và SL có khả năng gây ñộc tế bào mạnh nhất, và ưu thế nhất trên dòng tế bào ung thư phổi NIC –H460 (Bảng 2) Bảng 2. Khả năng gây ñộc tế bào của ba loại tinh dầu. Tỉ lệ gây ñộc tế bào (%) Dòng tế bào ung thư Lần thử nghiệm Tinh dầu SN Tinh dầu SL Tinh dầu SC 1 84,052 74,596 45,690 2 83,183 74,673 44,604 3 83,406 72,635 44,396 Hela Trung bình 83,456 ± 0,45 72,637 ± 1,48 44,824 ± 0,69 1 93,620 75,781 45,964 2 94,471 71,406 45,565 3 95,238 76,190 57,440 NIC –H460 Trung bình 94,450 ± 0,81 73,697 ± 2,65 48,679 ± 6,72 1 79,217 69,478 49,728 2 83,361 73,002 54,232 3 85,389 74,573 51,992 MCF – 7 Trung bình 82,832 ± 3,15 72,514 ± 2,61 52,592 ± 2,3 Hình thái tế bào HeLa sau khi cảm ứng với tinh dầu ñược trình bày trong Hình 1. Hình thái của tế bào thay ñổi do cảm ứng với tinh dầu SN và SL khác nhau. Tinh dầu SL làm tế bào co lại, tách khỏi ñáy bình nuôi cấy và chiết quang mạnh hơn tinh dầu SN. Bên cạnh ñó, thành phần cấu tử của hai tinh dầu cũng không giống nhau, ñiều này cho thấy cấu tử có vai trò gây ñộc tế bào trong hai tinh dầu này là khác nhau, cần tiếp tục khảo sát thêm về IC50, khả năng cảm ứng apoptosis ñể có kết luận chính xác hơn về khả năng gây ñộc tế bào của hai tinh dầu này. Trong khi ở mẫu SC, tế bào vẫn còn bám dính vào ñáy bình Roux ñể tăng sinh, ñồng thời tỉ lệ tế bào chết thấp (44,82%) nên dự ñoán khả năng gây ñộc tế bào của mẫu này không cao, không có tiềm năng so với hai mẫu tinh dầu còn lại. Hình 1. Tác ñộng của các mẫu tinh dầu trên tế bào Hela * . Ghi chú: A- Không xử lý, B- Xử lý với tinh dầu SN, C- Xử lý với tinh dầu SL, C- Xử lý với tinh dầu SC. (*) Vật kính 400X, nồng ñộ chất thử là 100 µg/ml. Kết quả IC50 giúp so sánh một cách ñầy ñủ hoạt tính gây ñộc tế bào giữa các mẫu với nhau. Nếu mẫu tinh dầu nào có giá trị IC50 thấp hơn, tức nồng ñộ ức chế 50% thấp hơn thì tinh dầu ñó có hoạt tính gây ñộc tế bào mạnh hơn. Giá trị IC50 của tinh dầu SN, SL ñược trình bày trong (Bảng 3) Bảng 3. IC50 trên tế bào ung thư cổ tử cung Hela của tinh dầu SN và SL IC50 (µg/ml) Mẫu tinh dầu Lần 1 Lần 2 Lần 3 M ± SD SN 18,15 14,11 19,32 17,19 ± 2,73 SL 5,72 5,39 6,31 5,81 ± 0,47 Nồng ñộ ức chế 50% (IC50) tế bào HeLa của tinh dầu SN là 17,19 ± 2,73 µg/ml, và SL là 5,81 ± 0,47 µg/ml. Theo Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Hoa Kỳ, dich chiết có IC50 <20 µg/ml ñược xem là có tính ñộc tế bào. Ở ñây, cả hai mẫu tinh dầu SL và SN ñều có IC50 < 20 µg/ml nghĩa là có tiềm năng kháng ung thư. Kết quả ñiện di trên gel agarose cho thấy mẫu SN ở nồng ñộ 20 µg/ml gây hiện tượng DNA phân mảnh không rõ rệt, các vạch DNA có hiện nhưng không rõ lắm (Hình 2). Mẫu SL ở nồng ñộ 6 µg/ml ñã gây nên sự phân mảnh DNA bộ gen của tế bào HeLa sau 48 giờ xử lý. Điều này cho thấy SL ñã cảm ứng quá trình apoptosis trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các ñiều kiện khảo sát. A B C D 155 Hình 2. Điện di trên gel agarose của DNA bộ gen tế bào. Ghi chú: Giếng 1 và 6: Thang 100 bp (Bio rad). Giếng 2: Tế bào HeLa không xử lý. Giếng 3: Tế bào HeLa xử lý với campothecin ở nồng ñộ 0,01 µg/ml trong 48 giờ. Giếng 4: Tế bào HeLa xử lý với SN ở nồng ñộ 20 µg/ml trong 48 giờ. Giếng 5: Tế bào HeLa xử lý với SL ở nồng ñộ 6 µg/ml trong 48 giờ. Hoạt tính kháng nấm Kết quả khảo sát sơ bộ kết hoạt tính kháng nấm cho thấy tinh dầu Ngải sậy Campuchia có khả năng kháng nấm tốt nhất trên ña số các chủng nấm da và Candida spp. thử nghiệm. Các nấm da như M. gypseum, T. mentagrophytes bị chuyển sang màu vàng cam khi ñặt ñĩa giấy tẩm mẫu thử là tinh dầu SL. Như vậy, các nấm da này có khả năng cảm ứng với tinh dầu SL tạo sắc tố màu vàng cam. Các nấm da này cũng có khả năng tạo sắc tố với tinh dầu SN, nhưng thấp hơn, chỉ tạo màu vàng nhạt. Tinh dầu SC không có tính chất này. Kết quả MIC trên vi nấm của tinh dầu ba loại Ngải sậy ñược trình bày trong Bảng 4. Bảng 4. Kết quả MIC của tinh dầu ba loại Ngải sậy trên các vi nấm. Nồng ñộ tối thiểu ức chế vi nấm (µl/ml) Vi nấm Tinh dầu SN Tinh dầu SL Tinh dầu SC C. albicans 2,5 - 1,25 C. 051 5 - 2,5 C. 955 > 5 - 2,5 C. 279 5 - 2,5 Trichophyton mentagrophytes 2,5 5 1,25 Trichophyton rubrum 1,25 1,25 1,25 Trichophyton terestres 0,625 0,3125 0,625 Trichophyton tonsurans 1,25 2,5 0,625 Microsporum canis 3,46 2,5 3,46 Microsporum gypseum 5 5 1,25 Ghi chú: “ – ” không thử MIC. Tinh dầu SC có tác dụng kháng tất cả các loại vi nấm khảo sát khá mạnh, với MIC trong khoảng từ 0,625 µl/ml ñến 1,25 µl/ml, ngoại trừ trên Microsporum canis chỉ có 3,46 µl/ml. Tinh dầu SN cũng kháng tất cả các loại vi nấm khảo sát nhưng yếu hơn. Tinh dầu SL có khả năng ức chế mạnh T. terestres (MIC 0,3125 µl/ml). KẾT LUẬN Tinh dầu ba loài Ngải sậy thuộc chi Zingiber có thành phần các cấu tử khác nhau, ñặc biệt Ngải sậy củ lớn chứa hàm lượng zerumbon cao (52,4%). Tinh dầu Ngải sậy củ lớn và Ngải sậy củ nhỏ có ñộc tính tế bào 1000 bp 100 bp 200 bp 156 cao, trong ñó tinh dầu SL thể hiện tính cảm ứng trong quá trình apoptosis trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa ở các ñiều kiện khảo sát. Tinh dầu cả 3 loại Ngải sậy ñều có hoạt tính kháng nấm tốt trên một số loại nấm da và Candida ssp., ñặc biệt là tinh dầu Ngải sậy Campuchia. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hồ Huỳnh Thùy Dương (2007), Xây dựng và hoàn chỉnh các quy trình dùng trong sàng lọc tính kháng phân bào của cây thuốc ở mức tế bào và phân tử. Sở khoa học và công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, tr. 56 – 60, 24 – 36, 10 – 15. 2. Nguyễn Đinh Nga, Ngô thị Chí Tâm (2002), Sàng lọc dược liệu và tác dụng kháng nấm. Tạp chí Y Học Tp. Hồ Chí Minh, tập 6, phụ bản số 1 3. Huang GC, Chien TY, Chen LG, Wang CC (2005), Antitumor effects of zerumbone from Zingiber zerumbet in P-388D1 cells in vitro and in vivo. Planta Med, 71(3), pp. 219-24 4. Jantan I. , Yasin M.S.M., Chin C., Chen L.L. and Sim Ng Le (2003), Antifungal activity of the essential oils of nine Zingiberaceae spicies. Phar Bio, 41 (5), pp. 392 – 397. 5. Lazono – Chiu M., Nelson P. W., Paetznick V.L. and Rex J.H. (1999), Disk diffusion method for determining susceptibilities of Candida spp. To MK – 0991. Jclin Microbiol. 37(5), pp. 1625 – 1627. 6. Sakinah S.A., Handayani S.T., Hawariah L.P. (2007). Zerumbone induced apoptosis in liver cancer cells via modulation of Bax/Bcl-2 ratio, Cancer Cell Int, pp.7, 4 7. Ueda Jun-ya, Tezuka Y, Banskota A.H., Quan Le Tran, Qui Kim Tran, Harimaya Y., Saiki I, and Kadota S. (2002), Antiproliferative Activity of Vietnamese Medicinal Plants. Biol. Pharm. Bul, 25 (6), pp. 753 – 760. 8. Vichai, V. And Kirtikara, K. (2006), Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxity screening. Nature Protocol, 1 (3). 9. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và ñộng vật làm thuốc ở Việt nam - Tập 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 160-161.