Thiết lập chất chuẩn Diosgenin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 303 THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN DIOSGENIN Phạm Quỳnh Khoa*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng và đánh giá phương pháp định lượng bằng HPLC cho chất chuẩn diosgenin. Thiết lập chất chuẩn diosgenin thông qua thẩm định liên phòng thí nghiệm tại 3 phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP/ISO. Phương pháp: Khảo sát phương pháp định lượng diosgenin trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC. Đánh giá chất lượng và thẩm định chất chuẩn diosgenin dựa vào các hướng dẫn của ISO Guide 31; 34; 35 và ISO 13528:2005. Kết quả: Xây dựng quy trình định lượng diosgenin trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC đạt các yêu cầu đánh giá. Kiểm tra và đánh giá chất lượng chuẩn diosgenin theo đầy đủ các tiêu chí đánh giá chất chuẩn như xác định bộ dữ liệu hóa lý (điểm chảy, phổ UV-Vis, phổ IR, phổ MS và phổ NMR), đánh giá tạp chất liên quan (HPLC và DSC), định tính, định lượng, độ đồng nhất giữa các lọ chuẩn và xác định giá trị ấn định theo ISO. Kết luận: Kết quả thẩm định cho thấy chất chuẩn diosgenin thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt tiêu chuẩn cơ sở chất chuẩn gốc (Primary Reference Standard). Từ khóa: Thiết lập chất chuẩn đối chiếu, diosgenin, ISO Guide, thẩm định. ABSTRACT ESTABLISHMENT OF DIOSGENIN AS A REFERENCE STANDARD Pham Quynh Khoa, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 303 - 309 Objectives: Establishing and validating an HPLC method for quantitative analysis of diosgenin. Establishment of diosgenin as a reference standard through inter-laboratory validation at three independent GLP/ISO laboratories. Methods: The HPLC quantitative process of diosgenin was established using an RP8 comlumn and detection at the wavelength of 203 nm. The quality valuation was carried out based on guidelines of ISO Guide 31; 34; 35 and ISO 13528:2005. Results: The established HPLC method for diosgenin satisfied all requirements of a trustworthy quantitative analysis. The reference standard was evaluated based on criteria including determination of chemical and physical criteria (such as melting point, UV-Vis, IR, MS and NMR spectrum), related impurities (HPLC and DSC), qualitative and quantitative test, homogeneity among the bottles and assignment of value. Conclusions: The established reference standard diosgenin is of high quality and meets the requirement for a primary standard. Keywords: Establishment of reference standard, diosgenin, ISO Guide, validation. ĐẶT VẤN ĐỀ Chất chuẩn đối chiếu hết sức cần thiết cho công việc, nghiên cứu, đánh giá chất lượng thuốc. Yêu cầu chất chuẩn, nhất là các chất chuẩn từ dược liệu, ngày càng cao nhưng hiện nay, phần lớn chất chuẩn sử dụng ở Việt Nam chủ yếu phải nhập từ nước ngoài với giá thành cao, thời gian đặt hàng kéo dài vài tuần thậm chí ∗ Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: GS.TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908988820 Email: ducng@hcm.vn.vnn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 304 vài tháng. Một số chất chuẩn từ dược liệu không có trên thị trường. Tại Việt Nam, bên cạnh hệ thống chất chuẩn do Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm Nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh thiết lập, một số đơn vị nghiên cứu khoa học (viện, trường ) đã phân lập được một số chất chuẩn từ dược liệu nhưng việc sử dụng còn hạn chế trong phạm vi cơ sở và được thẩm định đầy đủ. Vì vậy cần xây dựng hệ thống chất chuẩn với chất lượng cao hơn để có thể áp dụng rộng rãi trong phạm vi cả nước; từ đó giúp tiết kiệm chi phí, thời gian mua chuẩn từ nước ngoài nhưng vẫn đảm bảo kết quả kiểm nghiệm đáng tin cậy và hiệu quả để làm cơ sở kiểm tra chất lượng chế phẩm đông dược và dược liệu làm thuốc. Diosgenin là một sapogenin steroid được ứng dụng để bán điều chế các thuốc steroid. Nó là aglycon của nhiều saponin steroid có trong các dược liệu như Củ mài (Dioscorea spp), Tỳ giải (Dioscorea tokoro Makino), Mía dò (Costus speciosus (Koenig) Smith)(4) nên có thể ứng dụng vào việc kiểm định các dược liệu này và các chế phẩm chứa chúng. Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu này thực hiện đề tài “Thiết lập chất chuẩn diosgenin” với nguyên liệu diosgenin tinh khiết điều chế từ Mía dò (3) nhằm góp phần thiết lập một chất chuẩn từ dược liệu và thông qua đó từng bước xây dựng một quy trình chung thiết lập và đánh giá chất chuẩn đạt tiêu chuẩn cơ sở của một chất chuẩn gốc, tiến tới xây dựng chất chuẩn đạt chất lượng ở mức quốc gia. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Diosgenin đã được phân lập và tinh chế từ cao Mía dò chuẩn hóa do Ban Nghiên cứu Khoa học – Thư viện, Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất từ cây Mía dò (Costus speciosus (Koenig) Smith, Costaceae). Lô Dios.Ref.012012. Số lượng: 15,5 g ; lô đóng gói 100 lọ, mỗi lọ 10 mg. Chất đối chiếu, trang thiết bị, hóa chất, dung môi Chất đối chiếu diosgenin: Chuẩn thứ cấp (SH) của công ty Chromadex (Mỹ), số lô 00004915-227, hàm lượng 98,5%. Trang thiết bị: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC-20A (Nhật), detector PDA. - Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR- 8201PC (Nhật). - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz NMR (Mỹ). - Máy đo khối phổ Bruker µQ-TOF MS (Mỹ). Hóa chất, dung môi phù hợp với mục đích sử dụng. Phương pháp nghiên cứu Xây dựng quy trình định lượng HPLC cho diosgenin. Tiến hành đánh giá các chỉ tiêu bao gồm tạp chất liên quan, định tính và xác định cấu trúc như sắc ký lớp mỏng, điểm chảy, phổ IR, phổ UV, phổ MS, phổ NMR và định lượng. Thẩm định chất chuẩn liên phòng thí nghiệm tại 3 phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP/ISO và thiết lập chất chuẩn theo các hướng dẫn của ISO Guide 31; 34; 35 và ISO 13528:2005. Xây dựng quy trình định lượng diosgenin trong nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Điều kiện sắc ký: Cột: C8 150 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm. Pha động: Acetonitril – H2O (90:10). Detector: UV 203 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/ phút. Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Thể tích bơm: 20 µl. Dung môi pha mẫu: Pha động. Dung dịch chuẩn: Cân khoảng 10,0 mg diosgenin chuẩn cho vào bình định mức 50 ml. Thêm pha động, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 305 sung pha động đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch thử Cân khoảng 10,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 50 ml. Thêm pha động, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Tiến hành Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ, tính hàm lượng (%) diosgenin (nguyên trạng) trong mẫu thử so với chuẩn. Đánh giá quy trình định lượng Quy trình được đánh giá: Tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng và ứng dụng để xác định hàm lượng diosgenin trong nguyên liệu. Đánh giá đồng nhất lọ Theo ISO Guide 35: Các lọ được xem là đồng nhất khi n S r < ubb với Sr = withinMS ubb= 0n MSMS withinamong − Trong đó, n0 = n = 2. Tuy nhiên, trong thực tế bất đẳng thức trên khó có thể đạt được. Nếu trường hợp n S r > ubb, áp dụng công thức chuyển đổi sau để tính ubb ubb = 4 2 . withinMS within n MS υ Khi đó, các lọ được xem là đồng nhất khi thỏa mãn bất đẳng thức sau (2): 0 2 22 n s su n MSMS r bbbb withinamong +≤≤ − Xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm (CoA) Giá trị ấn định x*(n) được chọn khi giá trị s* không thay đổi sau n lần tính; sử dụng giá trị ấn định x*(n) để đánh giá từng kết quả phân tích theo test-z, loại bỏ các kết quả phân tích có |z| > 2,0; chọn các giá trị |z| ≤ 2,0, tính giá trị trung bình (1). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sắc ký lớp mỏng Sau khi sắc ký qua ba hệ dung môi khác nhau như trên, vết diosgenin điều chế cho một vết có màu sắc và Rf tương ứng với vết của diosgenin đối chiếu, đồng thời mẫu diosgenin điều chế sạch vì không lẫn các tạp kèm theo. Điểm chảy Kết quả trung bình đo điểm chảy diosgenin là 205 oC nằm trong giới hạn cho phép (204 – 207 oC). Phổ IR Phổ hồng ngoại (KBr, FTIR-8210 PC) cho các đỉnh hấp thu tương ứng với các nhóm chức: 3384,8 cm-1: Nhóm chức –OH. 1647,1 cm-1: Nối đôi C=C trong vòng. 1053,1 cm-1: -C-O-C- trong vòng. Phổ HR-MS Hình 1: Phổ HR-MS của diosgenin điều chế Phổ HR-MS của diosgenin điều chế cho pic ion (M + Na)+ 437,3051 m/z ; phù hợp với công thức phân tử C27H42O3 của diosgenin. Phổ NMR Phổ 1H-NMR Phổ 1H-NMR của mẫu điều chế đo ở 500 MHz trong dung môi CDCl3 cho các tín hiệu proton phù hợp với diosgenin: 4 tín hiệu proton ở 0,77 ppm (3H, s), 0,785 ppm (3H, s), 0,973 ppm (3H, d, J = 7 Hz), 1,02 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 306 ppm (3H, s) có thể gán lần lượt cho các nhóm – CH3 ở vị trí 27; 18; 21 và 19. Hình 2: Phổ 13C-NMR của diosgenin điều chế 1 tín hiệu proton ở 3,368 ppm (1H, t, J = 11 Hz), có thể gán cho H – 3. 1 tín hiệu proton ở 3,47 ppm (2H, m) có thể gán cho các proton ở vị trí 26. 1 tín hiệu proton ở 4,380 ppm (1H, q, J = 8 Hz và 7 Hz) có thể gán cho H – 16. 1 tín hiệu proton ở 5,336 ppm (1H, t-like, J = 3 Hz) có thể gán cho H – 6. Phổ 13C-NMR Hình 3: Phổ 1H-NMR của diosgenin điều chế So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của diosgenin điều chế (125 MHz, d = ppm, CDCl3) với diosgenin theo tài liệu (5) Bảng 1: So sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của diosgenin điều chế (125 MHz, δ = ppm, CDCl3) với diosgenin theo tài liệu C Diosgenin điều chế Diosgenin (5) C Diosgenin điều chế Diosgenin (5) 1 37,41 37,2 15 32,02 31,8 2 31,63 31,6 16 80,99 80,7 3 71,89 71,5 17 62,32 62,1 4 42,46 42,2 18 16,43 16,3 5 140,99 140,8 19 19,57 19,7 6 121,57 121,3 20 41,79 41,6 7 32,23 32,0 21 14,65 14,5 8 31,57 31,4 22 109,44 109,9 9 50,27 50,1 23 31,81 31,4 10 36,82 36,6 24 28,98 28,8 11 21,05 20,9 25 30,47 30,3 12 39,97 39,8 26 67,01 66,7 13 40,44 40,2 27 17,27 17,1 14 56,71 56,5 Nhận xét: Dữ liệu phổ 13C-NMR của diosgenin điều chế phù hợp với diosgenin theo tài liệu. Tạp chất liên quan Phương pháp HPLC dựa vào phần trăm diện tích pic Bảng 2: Kết quả xác định tạp chất liên quan diosgenin. tR tạp chất (phút) Hàm lượng tạp (%) 4,88 0,12 10,23 0,27 Tổng 0,39 Nhận xét: Hàm lượng tạp chất có trong mẫu diosgenin điều chế tính theo phần trăm diện tích pic là 0,39% (< 2%). Quét nhiệt vi sai Độ tinh khiết mẫu diosgenin điều chế là 98,32 mol%. Đánh giá phương pháp định lượng diosgenin Tính tương thích hệ thống Bảng 3: Các thông số sắc ký ứng với đỉnh diosgenin sau sáu lần tiêm liên tiếp (n = 6). Số lần bơm tR (phút) Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số kéo đuôi 1 5,619 2833568 5430,735 0,984 2 5,615 2832848 5412,480 0,984 3 5,608 2833984 5408,392 0,983 4 5,605 2833774 5359,913 0,983 5 5,601 2833136 5265,265 0,983 6 5,605 2834915 5355,641 0,983 TB 5,609 2833704 5288,738 0,983 RSD 0,116% 0,026% 0,598% 0,052% Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 307 Nhận xét: RSD của thời gian lưu là 0,116% nhỏ hơn 1%; RSD của diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết, hệ số kéo đuôi tương ứng là 0,026%, 0,598% và 0,052% nhỏ hơn 2%. Như vậy hệ thống đạt tính tương thích. Tính đặc hiệu (a) (b) (c) (d) Hình 4. Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu diosgenin (a): Mẫu chuẩn; (b): Mẫu thử; (c) Mẫu trắng; (d): Mẫu thử thêm chuẩn. Thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu thử là 5,6 phút tương đương thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu chuẩn, đồng thời mẫu trắng không có pic trùng với pic diosgenin. Khi thêm một lượng chất chuẩn diosgenin vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic của diosgenin tăng lên so với trước khi thêm chuẩn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic diosgenin trong mẫu chuẩn. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic diosgenin không có các thành phần khác trong tất cả các mẫu. Tính tuyến tính và miền giá trị Bảng 4: Sự tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ Số thứ tự Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh trung bình 1 98,5 1443842 2 197 2852224 3 354,6 5052617 4 394 5591961 5 433,4 6124276 6 492,5 6919295 Hình 5: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ diosgenin. Kiểm tra tính tương thích phương trình hồi quy: y = 13911x + 96494. t = 3,79 > t0,05 = 2,78: Hệ số 96494 có ý nghĩa. F = 37788 > F0,05 = 7,708: Phương trình trên tương thích. Nhận xét: R2 = 0,9999 > 0,995, như vậy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ diosgenin. Độ lặp lại Tiến hành định lượng 6 mẫu khác nhau cho kết quả: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 308 Bảng 5: Kết quả độ lặp lại của phương pháp định lượng diosgenin (n = 6). Số lần xác định Hàm lượng (%) Số liệu thống kê 1 98,95 n = 6 = 98,885% SD = 0,081; RSD = 0,082% e = ± 0,085 µ = 98,885 ± 0,085 (α = 0,05) 2 98,88 3 98,97 4 98,87 5 98,9 6 98,74 Nhận xét: Hàm lượng trung bình của diosgenin là 98,885%, RSD bằng 0,082% nhỏ hơn 2,0%. Độ đúng Bảng 6: Kết quả đánh giá độ đúng phương pháp định lượng diosgenin. Mẫu Mức hàm lượng Lượng thêm vào (mg) Lượng tìm thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 1 80% 8 7,76 97 2 8 7,77 97,13 3 8 7,75 96,88 4 100% 10 9,72 97,2 5 10 9,73 97,3 6 10 9,71 97,1 7 120% 12 11,65 97,08 8 12 11,66 97,17 9 12 11,67 97,25 Nhận xét: Tỉ lệ hồi phục của các mẫu ở từng nồng độ đều nằm trong khoảng giới hạn 95,0 – 105,0%. Kết luận phương pháp đạt độ đúng. Đánh giá đồng nhất lọ Số lọ cần lấy để đánh giá đồng nhất lọ: = 11 lọ. Lấy ngẫu nhiên các lọ theo phần mềm Excel, số thứ tự các lọ sẽ lấy để định lượng là 100, 74, 12, 38, 49, 22, 56, 23, 60, 9, 29; mỗi lọ kiểm tra 2 lần. Bảng 7: Kết quả định lượng diosgenin điều chế đánh giá đồng nhất lô STT Lọ số Lần 1 (%) Lần 2 (%) 1 100 98,95 98,87 2 74 98,88 98,82 3 12 98,97 98,91 4 38 98,87 98,8 5 49 98,9 98,84 6 22 98,74 98,92 7 56 98,69 98,76 8 23 98,73 98,66 9 60 98,86 98,79 10 9 98,88 98,88 11 29 98,85 99,02 Loại giá trị bất thường bằng trắc nghiệm Dixon: Xếp các kết quả trên theo thứ tự tăng dần, xét hai kết quả nhỏ nhất và lớn nhất so với chuỗi dữ liệu: xmin = 98,66%
G = 0,24 < G0,05 = 0,468 xmax = 99,02%
G = 0,24 < G0,05 = 0,468 Vậy, chuỗi dữ liệu trên không có giá trị bất thường. Phân tích phương sai một yếu tố theo ANOVA Bảng 8: Bảng phân tích ANOVA kết quả đánh giá đồng nhất lô diosgenin Biến thiên Tổng độ lệch bình phương Bậc tự do Phương sai F F0,05 Giữa các nhóm 0,1217 10 0,01217 2,729 2,854 Trong cùng nhóm 0,04905 11 0,004459 Tổng cộng 0,17075 21 Nhận xét: F = 2,729 < F0,05 = 2,854, khi đó ta có: = 0,047 < µbb = 0,062 Kết luận: Các lọ diosgenin đồng nhất trong quá trình đóng gói. Xác định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo và giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm Bảng 9: Kết quả định lượng tại ba phòng thí nghiệm độc lập Mẫu PTN1 PTN2 PTN3 1 98,91 98,58 98,86 2 98,85 98,42 100,07 3 98,94 99,52 98,76 4 98,84 98,38 98,62 5 98,87 98,26 98,46 6 98,83 98,68 97,89 Trung bình 98,87 98,64 98,78 PTN 1: Phòng kiểm tra chất lượng, Công ty Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 309 Cổ phần Hóa dược phẩm Mekophar. PTN 2: Khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP. HCM. PTN 3: Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế, Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP. HCM. Bảng 10: Kết quả tính giá trị ấn định hàm lượng (%) diosgenin (n = 18). x*(0) x*(1) x*(2) x*(3) x*(4) x*(5) δ = 1,5 x s* - 0,356 0,403 0,399 0,397 0,396 x* - δ - 98,44 98,334 98,337 98,338 98,339 x* + δ - 99,151 99,139 99,134 99,131 99,13 Trung bình 98,763 98,737 98,735 98,735 98,734 98,734 Độ lệch s 0,473 0,237 0,234 0,233 0,233 0,233 x* mới 98,795 98,737 98,735 98,735 98,734 98,734 s* mới 0,237 0,268 0,266 0,264 0,264 0,264 Nhận xét: Sau 5 lần thay đổi, giá trị s* không thay đổi (0,264), khi đó giá trị x* mới được chọn là 98,734%. Từ kết quả trên, tính z – score. Kết quả có ba giá trị 97,89%, 99,52% và 100,07% có z tương ứng là -3,2; 2,98 và 5,07 với > 2, loại bỏ ba giá trị này. Tính trung bình 15 kết quả còn lại, thu được kết quả như sau: Hàm lượng trung bình: 98,68% (n = 15). Độ lệch s: 0,233. Độ không đảm bảo đo µ: 0,078. Kết luận: Chất chuẩn diosgenin thiết lập lô Dios.Ref.012012 đạt tiêu chuẩn cơ sở của chất chuẩn gốc (P) với hàm lượng được xác định là 98,68% tính theo hiện trạng (n = 15, s = 0,233, µ = 0,078). BÀN LUẬN – KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, đã kiểm tra và đánh giá chất lượng chất chuẩn diosgenin theo đầy đủ các tiêu chí đánh giá chất chuẩn gốc như xác định bộ dữ liệu hóa lý (điểm chảy, phổ UV-Vis, phổ IR, phổ MS và phổ NMR), đánh giá tạp chất liên quan (HPLC và DSC), định tính, định lượng, độ đồng nhất giữa các lọ chuẩn và xác định giá trị ấn định theo ISO. Kết quả cho thấy chất chuẩn diogenin điều chế đạt tất cả các tiêu chí đánh giá. Đã tiến hành thẩm định chất chuẩn diosgenin tại ba phòng thí nghiệm độc lập đạt tiêu chuẩn ISO/GLP. Kết quả thẩm định cho thấy chất chuẩn diosgenin thiết lập có chất lượng cao, đáng tin cậy, đạt yêu cầu TCCS của chất chuẩn gốc (P). Điều quan trọng là qua quá trình thực hiện đề tài chúng tôi đã bước đầu xây dựng được một quy trình chung để thiết lập chất chuẩn có chất lượng cao, đáng tin cậy, tiến tới góp phần xây dựng hệ thống chất chuẩn quốc gia. Chất chuẩn diosgenin đã thiết lập hiện đang được phân phối toàn quốc thông qua Viện Kiểm nghiệm Thuốc TP. Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. ISO 13528:2005 (2005), Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons, ISO. 2. ISO Guide 35 (2006), Reference materials - General and statistical principles for certification, ISO. 3. Trịnh Văn Đua (2009), Chiết xuất, phân lập diosgenin từ mía dò (Costus speciosus Smith., Costaceae) để làm chất đối chiếu, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, tr. 13. 4. Trịnh Văn Đua, Nguyễn Minh Đức (2009), “Chiết xuất, phân lập diosgenin từ mía dò (Costus speciosus Smith., Costaceae) để làm chất đối chiếu”, Y học TP. Hồ Chí Minh, 13(1):92-95. 5. Zheng CJ, Quin LP (2007), “Chemical components of C. asiatica and their bioactivities”, Journal of Chinese Integrative Medicine, 5, (3):348 – 351. Ngày nhận bài báo: 12.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014