Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn e. coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi. - TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Doãn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. - Thầy Lê Anh Phụng, cô Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phòng thí nghiệm Vi Sinh và các thầy cô thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. - Toàn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2005 Nguyễn Vân Anh iv TÓM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli” Hội đồng hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Ngọc Hải 2. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005 Địa điểm nghiên cứu:  Viện Pasteur Tp. HCM  Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM  Phòng thí nghiệm Vi Sinh. Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc ở hai qui trình gây đáp ứng miễn dịch ngắn ngày và dài ngày. Đề tài thực hiện trên 2 lô thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) và qui trình dài ngày (154 ngày). Kháng huyết thanh thu đƣợc từ hai qui trình tủa trong amonium sulfate bão hòa và có thể phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của hai qui trình đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngoài ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88+. Kết quả đạt đƣợc: 1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. 2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. 3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn ngày. 5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium sulfate bão hòa. 6. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... ix Danh sách các hình ............................................................................................... x Danh sách các bảng .............................................................................................. xi Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xii Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU ................................................................................. 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ................................................................................. 3 2.1.1. Khái niệm miễn dịch ................................................................................ 3 2.1.2. Kháng nguyên .......................................................................................... 3 2.1.2.1. Định nghĩa ........................................................................................ 3 2.1.2.2. Khái niệm về epitop ........................................................................... 3 2.1.3. Kháng thể dịch thể ................................................................................... 4 2.1.3.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin ....................................... 4 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật .... 5 2.1.4.1. Loài động vật ..................................................................................... 5 2.1.4.2. Yếu tố di truyền .................................................................................. 5 vi 2.1.4.3. Kháng nguyên ..................................................................................... 6 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch ..................................................................... 7 2.1.4.5. Chất bổ trợ ......................................................................................... 8 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể .......................................................... 9 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể............................... 9 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể ............................... 11 2.2. VI KHUẨN E. coli ........................................................................................ 14 2.2.1. Định nghĩa .............................................................................................. 14 2.2.2. Đặc tính sinh hóa .................................................................................... 14 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên ............................................................................. 14 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O ...................................................................... 14 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K .............................. 15 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H ............................................................... 15 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE ............................ 15 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH .............. 16 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ ...................................... 17 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) ........................... 17 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT ........................................... 17 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT .................................................................. 18 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha ............................... 18 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT ................ 19 2.6. PROTEIN A .................................................................................................. 19 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 21 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................ 21 3.1.1. Thời gian thực nghiệm ........................................................................... 21 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 21 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................ 21 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 22 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ ............................................................. 22 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm .......................................................................... 22 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm ....................................................................... 22 vii 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 23 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh .................................................................. 25 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà .............................. 26 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể ......................................................................... 26 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh ......................................................................... 27 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu ................................................. 28 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus ............... 29 3.4.4. Đánh giá ................................................................................................. 30 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) ......... 30 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) .................................................................................................... 31 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI ................................................................................... 32 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ .......................................................................................... 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 33 4.1. KẾT QUẢ ....................................................................................................... 33 4.1.1. Định tính ................................................................................................ 33 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày ........................................................................ 33 4.1.1.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 34 4.1.2. Định lƣợng ............................................................................................. 34 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 35 4.1.2.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 36 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình ................................ 37 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh............................................. 38 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus ........................................................................................................ 38 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 40 4.2. THẢO LUẬN ................................................................................................. 42 4.2.1. Định tính ................................................................................................ 42 4.2.2. Định lƣợng ............................................................................................. 43 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 43 4.2.2.2. Qui trình dài ngày ........................................................................... 43 viii 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh .............................................. 44 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 46 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 49 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E. coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên KT Kháng thể KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể MHC II Major histocompatibility complex class II antigens (các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II) S. aureus Staphylococcus aureus. SIg Surface immunoglobulin (Globulin miễn màng tế bào) TCR T cell receptor (Thụ quan bề mặt tế bào T) TH lympho T helper cell (tế bào lympho T hỗ trợ) x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ...................................................... 4 Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào ......................................................................................... 10 Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên tế bào TH ................................................................................................... 10 Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng ...................................................... 11 Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh .................................. 12 Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B .................................................. 13 Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG ........................................ 13 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại .................................................................................. 17 H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên ............................................. 19 Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus .................................... 20 Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh ........................................................................... 26 Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích ........................................................................................................ 27 Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ...................................................... 30 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................ 32 Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm ............................................................................... 50 Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai ........................................................................... 50 Hình 7.3 Tiêm dƣới da .......................................................................................... 50 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày ........................ 23 Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM) ................................................................................. 24 Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................ 33 Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ............................................................. 34 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................................ 35 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 ...................................................................................................... 36 Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày ............................................................ 37 Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau ....................................................... 38 Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 ............................................................................................................ 39 Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ...................................................................................................... 39 Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) ........................................ 40 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) ........................................... 41 xii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu ............................................. 35 Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 2 ........................................................................... 36 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau ...................................................... 36 Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 4 ........................................................................... 37 Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 ở qui trình ngắn ngày .................. 41 Biểu đồ 4.6 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không đƣợc hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 ở qui trình dài ngày ..................... 42 xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................ 22 Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh ......................................... 25 Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu ................................. 28 Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus .... 29 Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................................................ 31 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chăn nuôi việc chẩn đoán, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà có các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh khác nhau. Thông thƣờng để chẩn đoán bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đó giúp chẩn đoán nhanh và chính xác hơn. Nhƣng kĩ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ thuật thực hiện còn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải có trình độ kĩ thuật nhất định. Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh không thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Dựa vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vật gây bệnh để ngƣời chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnh hay không nhƣ bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm... Hiện nay ở Việt Nam việc sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho việc chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuôi còn ít, chỉ mới áp dụng cho một số bệnh. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho việc chẩn đoán nhanh và điều trị bệnh kịp thời. Ngoài ra có thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác. 2 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho công tác chẩn đoán bệnh. 1.2.2. Yêu cầu  Xây dựng quy trình tiêm thỏ thí nghiệm.  Thu nhận kháng huyết thanh từ thỏ thí nghiệm.  Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2.1.1. Khái niệm miễn dịch Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các chất mang trên bản thân chúng với những dấu hiệu thông tin di truyền ngoại lai. Khả năng miễn dịch của một cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố di truyền của loài, sức đề kháng của mỗi cá thể, điều kiện ngoại cảnh (dinh dƣỡng, vệ sinh, môi trƣờng…). 2.1.2. Kháng nguyên [2] 2.1.2.1. Định nghĩa Kháng nguyên (KN) là tất cả các chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp một phân tử đặc biệt gọi là kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào và chúng có đặc tính liên kết đặc hiệu với KN đó. 2.1.2.2. Khái niệm về epitop (biểu vị) Epitop là những cấu trúc trên bề mặt của phân tử KN, có khả năng tạo kháng thể riêng biệt hoặc những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của một số tế bào lympho. Epitop có 2 đặc tính: Tính KN: là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể (KT). Phần cấu trúc này của phân tử KT hoặc của thụ thể đƣợc gọi là paratop. Tính miễn dịch: của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một cơ thể. Nếu KN là protein thì kích thƣớc của một epitop KN vào khoảng 5-10 gốc acid amin. Một phân tử KN có thể có một hoặc nhiều epitop. Số lƣợng epitop phụ thuộc vào kích thƣớc của phân tử KN và thƣờng có khoảng 1 epitop cho mỗi 5 kDa. 4 2.1.3. Kháng thể dịch thể [2] 2.1.3.1. Định nghĩa Kháng thể dịch thể hay immunoglobulin (Ig) là protein “dạng cầu” đƣợc tổng hợp bởi tế bào tƣơng (plasma cell) khi bị kích thích bởi KN. Nó đƣợc tạo ra để giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố KN có hại xâm nhập vào cơ thể. 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin Phân tử Ig gồm một hay nhiều đơn vị với cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4 chuỗi polypeptid giống nhau từng đôi một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng, chúng đƣợc nối với nhau bằng những cầu nối disulfua (-S-S-) (hình 2.1). Chuỗi nhẹ L (light chain) Chuỗi nhẹ có trọng lƣợng phân tử khoảng 23.000 Da. Có hai loại chuỗi nhẹ chung cho tất cả các lớp Ig: Chuỗi nhẹ Kappa (kí hiệu K hay κ) Chuỗi nhẹ Lambda (kí hiệu λ) Tỉ lệ mang chuỗi nhẹ κ và λ của các Ig khác nhau giữa các loài. Chuỗi nhẹ đƣợc chia thành hai phần dài bằng nhau:  Phần hằng định: kí hiệu CL (constant) có tận cùng –COOH với trình tự acid amin tƣơng đối không đổi.  Phần thay đổi: kí hiệu VL (variable) có tận cùng là –NH2. Trật tự acid amin trong vùng này thay đổi từng nhóm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu Vκ (cho type kappa) và Vλ (cho type lambda). Chuỗi nặng H (heavy chain) Chuỗi nặng có trọng lƣợng phân tử từ 50.000 Da đến 70.000 Da tùy theo lớp Ig (IgM, IgG, IgA, IgE…). Chuỗi nặng cũng chia thành 2 vùng: vùng hằng định (CH) và vùng thay đổi (VH). Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ( RC/VL/GG/antiBD_mol.html) 5 Ngƣời ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch polypepptid trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi: Gamma (γ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgG Muy (μ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgM Alpha (α) thì Ig đó đƣợc gọi là IgA Delta (δ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgD Epsilon (ε) thì Ig đó đƣợc gọi là IgE Ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn một nhóm glucid đƣợc gọi là oligosaccharide có nhiệm vụ cố định bổ thể giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt của tế bào thực bào và quyết định tính KN của phân tử KT. Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham gia vào sự hình thành cấu trúc bổ sung đặc hiệu trong sự kết hợp với KN (paratop). Paratop không phải là một đoạn peptid liên tục, dài mà chỉ là một (hoặc một số) acid amin nằm cách quãng. Đó là những “điểm” mà paratop tiếp xúc với epitop, thông thƣờng mỗi paratop có từ 3-6 “điểm” nhƣ vậy. 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú [2] [13] 2.1.4.1. Loài thú Đáp ứng miễn dịch càng tăng khi có sự khác biệt di truyền giữa thú gây miễn dịch (túc chủ) với loài đƣợc sử dụng làm kháng nguyên càng lớn vì kháng nguyên sẽ có nhiều epitop lạ đối với túc chủ. Đối với hầu hết các kháng nguyên protein, thỏ là thú thuận tiện để gây miễn dịch thực nghiệm. 2.1.4.2. Yếu tố di truyền Khả năng đáp ứng miễn dịch của thú còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền vì với cùng một loại kháng nguyên nếu đƣa vào các cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau. Thông thƣờng các thú lai khác dòng có khả năng kích thích miễn dịch cao hơn các thú lai cùng dòng. 6 2.1.4.3. Kháng nguyên a. Tính lạ của kháng nguyên Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự khác biệt chủng loài giữa túc chủ và kháng nguyên. Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với túc chủ bao nhiêu, khả năng sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Còn trong miễn dịch qua trung gian tế bào, chỉ cần sự khác nhau giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao. b. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên  Protein và polysaccharide Là 2 nhóm kháng nguyên thông thƣờng nhất vì các vỏ vi khuẩn hoặc các độc tố là các protein hoặc glycoprotein. Chúng đều cho tính miễn dịch cao khi ở dạng hòa tan hay liên kết trong các cấu trúc phức tạp. Đặc tính kháng nguyên của nhiều loại glycoprotein trƣớc hết đƣợc biểu hiện bởi các phần gốc đƣờng của chúng. Protein ở dạng kết tụ (aggregation) gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn protein ở dạng hòa tan.  Lipid và acid nucleic Là 2 nhóm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch kém. Thông thƣờng, lipid chỉ biểu hiện tính kháng nguyên khi ở dạng kết hợp với polysaccharide hoặc protein… c. Kích thước của phân tử kháng nguyên Kháng nguyên có kích thƣớc lớn và cấu trúc càng phức tạp thì chúng càng dễ bị đại thực bào phát hiện và xử lí nên có tính sinh miễn dịch cao, những kháng nguyên có cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên có tính sinh miễn dịch thấp. Ngoài ra, các KN có kích thƣớc nhỏ có thể gắn với các protein mang để tạo đáp ứng miễn dịch. d. Khả năng bị chuyển hóa của phân tử kháng nguyên Sự chuyển hóa kháng nguyên trong cơ thể vật chủ là yếu tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi đƣợc chuyển hóa các kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định KN ra ngoài. Các phân tử không bị phân hủy bởi tế bào (không đƣợc tế bào nhận biết và cải biến) thì không gây ra đáp ứng miễn dịch. 7 Ví dụ: D-amino acid là một kháng nguyên yếu vì enzyme của động vật hữu nhũ không phân hủy amino acid dạng này. e. Liều lượng kháng nguyên Nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch. Ở các mũi nhắc nên giảm lƣợng kháng nguyên 2 – 3 lần so với gây mẫn cảm để tăng ái lực của kháng thể cần tạo nên. f. Đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể Kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi chúng đƣợc tiêm trực tiếp vào hạch bạch huyết vùng kheo của thú. Tuy nhiên cách này đòi hỏi trình độ tay nghề cao. Tiêm kháng nguyên nhiều mũi dƣới da, trong da hoặc tiêm một mũi trong bắp thịt đƣợc áp dụng rộng rãi hơn vì đơn giản dễ thực hiện và cho kết quả mong muốn. Ngoài ra với các kháng nguyên mạnh (vi khuẩn, virus, tế bào…) khi đƣa vào đƣờng mạch máu có thể dễ dàng gây ra đáp ứng miễn dịch. Nhƣng với kháng nguyên hòa tan thì phải có qui trình gây đáp ứng miễn dịch thích hợp, tốt nhất là tiêm trong da, dƣới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần. g. Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng thể đặc hiệu đƣợc sinh ra tƣơng ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện tƣợng này gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên. Tuy nhiên cũng có trƣờng hợp cùng một lúc gây mẫn cảm cho thú với hai loại kháng nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì con thú có thể chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tƣợng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên, chỉ xảy ra ở hai kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau. 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch Qui trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch đối với phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên hai lô thí nghiệm qua hai qui trình chủng ngừa khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại qui trình gây miễn dịch riêng. Với những kháng nguyên yếu thƣờng phải chủng ngừa bằng qui trình hết sức nghiêm ngặt và chủng 8 nhiều lần mới có đáp ứng miễn dịch mạnh. Trong khi đó, những kháng nguyên mạnh có khi chỉ cần chủng ngừa một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch. Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã đƣợc mẫn cảm với kháng nguyên đó một lần, thì hàm lƣợng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu (có những trƣờng hợp gấp hàng trăm lần). Ngoài ra khi tiêm nhắc lại nhiều lần thì sẽ có sự chọn lọc các dòng tế bào lympho B sản xuất kháng thể và chỉ tăng sinh những dòng sản xuất kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên nếu giới hạn tối đa kháng nguyên đƣa vào. Thƣờng tiêm mũi nhắc lại lần một sau khi đáp ứng miễn dịch ở mũi gây mẫn cảm giảm xuống (đối với thỏ khoảng 4-6 tuần). Các mũi tiêm nhắc lại tiếp theo nên cách nhau một khoảng thời gian nhất định để thú có khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất với kháng nguyên. Khoảng 10-15 ngày sau mỗi lần tiêm nhắc lại ta có thể lấy máu (20-40 ml), kháng huyết thanh nên đƣợc kiểm tra sự hiện diện của kháng thể. Nếu thú đáp ứng miễn dịch yếu sau mũi nhắc lại lần hai thì nên loại bỏ. 2.1.4.5. Chất bổ trợ Các tá chất đƣợc sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccine, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài ra, tá chất còn gây một phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch. Các nghiên cứu gần đây đã kết luận tá chất có tác dụng làm tăng lympho hỗ trợ (lympho T helper - TH). Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên đƣợc giải phóng dần dần có tác dụng giống nhƣ kích thích miễn dịch nhiều lần. Một số loại tá chất: Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA), Aluminum hydroxide (ALUM), Rabi Adjuvant System (RAS), Syntex Adjuvant Formulation (SAF)… 9 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể [3] [6] [8] [13] 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể a. Tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen-presenting cell) Tế bào trình diện kháng nguyên có 2 đặc tính: có các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II antigens) trên bề mặt tế bào và tiết interleukine 1 (IL-1) (ngoài ra nó còn tiết nhiều cytokine khác. Có 2 nhóm tế bào trình diện kháng nguyên:  Tế bào trình diện kháng nguyên “chuyên nghiệp” (“professional” APC): chủ động bắt và trình diện KN. Bao gồm các tế bào: đại thực bào, tế bào tua (dendritic cell), tế bào B.  Các tế bào khác, chỉ trình diện kháng nguyên khi tế bào bị nhiễm. Khi xâm nhập vào cơ thể các KN đƣợc các APC “chuyên nghiệp” tóm bắt bằng cách thực bào (đại thực bào) hay gắn với các thụ quan đặc hiệu (specific receptor) Ig trên bề mặt tế bào (tế bào B). Đối với KN protein ngoại bào Sau khi các APC bắt giữ KN, KN sẽ đƣợc đƣa vào các nang endosome bên trong tế bào. Các APC cũng có thể ẩm bào để hút các protein hòa tan (kích thƣớc ≤ 1 µm) vào các endosome này. Ở đây, các KN sẽ đƣợc xử lí trong khu vực acid nội bào nhờ các protease phân cắt protein thành các peptid ngắn. Các peptid thẳng này gắn với phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – MHC (KN – MHC) và đƣợc biểu lộ trên bề mặt tế bào (hình 2.2). Đối với KN có bản chất là lipid hoặc polysaccharide (KN không phụ thuộc tuyến ức) Các KN này chỉ trình diện đƣợc với tế bào B và không thể xử lí đến dạng kết hợp đƣợc với các phân tử MHC nên không đƣợc các tế bào T nhận biết, không gây đƣợc các đáp ứng miễn dịch tế bào. Ngoài ra khi KN bị bắt giữ vào trong tế bào APC nó sẽ kích thích tế bào tiết ra interleukin 1 hay còn gọi là yếu tố hoạt hóa tế bào lympho LAF (lymphocyte activating factor) là một trong hai yếu tố cần thiết để hoạt hóa tế bào lympho TH (yếu tố kia là sự nhận biết phức hợp KN-MHC của thụ thể tế bào T). 10 b. Tế bào lympho TH Quần thể tế bào lympho T đƣợc kháng nguyên trình diện gọi là tế bào lympho T hỗ trợ (helper T cell – TH) Tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa khi có khoảng 200 – 300 phức hợp KN – MHC gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên bề mặt tế bào lympho T (T cell receptor – TCR) và sự hiện diện của yếu tố đồng kích thích interleukin 1 (tùy loại tế bào lympho TH). Khi đƣợc kích thích, tế bào TH tiết ra hỗn hợp các cytokine cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma sản xuất kháng thể. c. Tế bào lympho B Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể, quá trình biệt hóa tế bào B thành tế bào tƣơng (plasma cell) sản xuất kháng thể có thể chia thành 2 giai đoạn:  Giai đoạn 1: các tế bào nguồn trong tủy xƣơng đƣợc biệt hóa thành tiền lympho B, sau đó thành các lympho B chƣa chín và cuối cùng phát triển thành lympho B chín với các immunoglobulin bề mặt SIg (Surface immunoglobulin). Giai đoạn này không cần sự kích thích của kháng nguyên và sự có mặt của tế bào lympho TH. Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên tế bào TH. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, 11  Giai đoạn 2: các tế bào lympho B chín biệt hóa thành tế bào tƣơng sản xuất kháng thể. Quá trình này cần sự kích thích của kháng nguyên, một số interleukin và sự kết hợp của tế bào TH với lympho B. Tế bào plasma là những tế bào hình trứng, đƣờng kính 8-9 µm, có nhân tròn lập dị với các chromatin không đồng dạng. Chúng có tế bào chất lớn với mạng lƣới nội chất hạt dày đặc (hình 2.4). Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào plasma (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể a. Đối với kháng nguyên phụ thuộc vào tuyến ức (KN có bản chất protein) Khi KN xâm nhập vào cơ thể, chúng bị các tế bào trình diện KN bắt giữ, phân cắt chúng thành những đoạn nhỏ và gắn vào các phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – phân tử MHC (KN-MHC) biểu lộ trên bề mặt tế bào APC. Đồng thời KN cũng kích thích APC tiết IL-1. Phức hợp KN-MHC và IL-1 đƣợc nhận biết bởi phức hợp thụ thể TCR/CD4+ và thụ thể IL-1 trên bề mặt tế bào TH. Khi đó tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa sẽ tăng sinh và tiết IL-2, IL-4, IL-5 để kích thích sự phát triển của tế bào B thành tế bào plasma sản xuất immunoglobulin. Khi kháng nguyên gắn với SIg thích hợp trên tế bào B chín với sự hiện diện của tế bào TH, IL-2, IL-4 thì tín hiệu đƣợc truyền vào trong tế bào. Lúc này tế bào B sẽ trải qua quá trình tăng sinh và biệt hóa thành dòng tế bào plasma tổng hợp kháng thể dịch thể hay immunoglobulin, chúng có cấu trúc giống nhƣ SIg mà KN đã chọn lọc để gắn 12 nhƣng với ái tính cao hơn khi kết hợp với KN đặc hiệu. Tế bào plasma có khả năng tổng hợp 300 phân tử Ig mỗi giây. IgM là loại KT xuất hiện đầu tiên khi cơ thể bị kích thích bởi KN, sau đó một vài ngày thì IgG, IgA và IgE xuất hiện (trong đó IgG là chủ yếu) và dần thay thế IgM. Thông thƣờng khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhƣng cũng có trƣờng hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ KT IgM chống lại KN O của vi khuẩn Samonella). Trong khi một số biệt hóa thành tế bào plasma thì một số tế bào B khác chuyển thành tế bào nhớ giúp cho đáp ứng lần sau với chính KN đó nhanh hơn và mạnh hơn. Đáp ứng thứ phát: khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên lần đầu và nếu cho tiếp xúc lần sau với chính kháng nguyên đó thì KN gắn với các thụ thể tƣơng ứng là các phân tử KT trên bề mặt của tế bào B nhớ làm tế bào nhớ tăng sinh và biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất KT do đó chúng ta sẽ thấy rõ hàm lƣợng kháng thể tăng nhanh và cao hơn nhiều lần so với lần đầu. Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh. ( 20Course.jpg) 13 b. Đối với kháng nguyên không phụ thuộc vào tuyến ức KN không phụ thuộc vào tuyến ức thƣờng là các trình tự polimer lặp lại nhƣ lipopolysaccharide của Escherichia coli, flagellin của Salmonella, vỏ polysaccharide của vi khuẩn Pneumococcus, dextrans, levans và polyglutamic acid. Bởi vì chúng là những trình tự polimer lặp lại nên một phân tử có thể gắn với nhiều thụ thể immunoglobulin trên bề mặt tế bào B do đó không cần tế bào T helper cung cấp thêm tín hiệu để gây ra đáp ứng tạo kháng thể của tế bào B nhƣ KN phụ thuộc vào tuyến ức (hình 2.6). KN không phụ thuộc tuyến ức gắn trực tiếp vào các SIg trên bề mặt tế B và kích thích tế bào B tiết ra kháng thể. Kháng nguyên không phụ thuộc vào tuyến ức chỉ gây ra đáp ứng tạo IgM ở tế bào B và không biệt hóa thành tế bào nhớ vì chúng không kích hoạt tế bào T helper tiết interleukine nên không chuyển từ sản xuất IgM sang IgG. Nhƣ vậy, đối với KN không phụ thuộc tuyến ức, đáp ứng thứ phát không tạo ra lƣợng KT nhiều hơn đáp ứng nguyên phát (hình 2.7). Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 14 2.2. VI KHUẨN E. coli [1] [9] 2.2.1. Định nghĩa Escherichia coli còn đƣợc gọi là faecal coli, thuộc nhóm coliform phân, có hình que, gram âm, có kích thƣớc khoảng 2-3 x 1,5 ; có khả năng di động nhờ các tiên mao, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Chúng có mặt thƣờng xuyên trong ruột của động vật và ngƣời, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già. 2.2.2. Đặc tính sinh hóa Có khả năng phát triển ở 44oC. Lên men đƣờng glucose, lactose, manitol, sorbitol, phản ứng -galactosidase dƣơng tính. Indol dƣơng tính, methyl red dƣơng tính, Voges-Proskauer âm tính, citrate âm tính. Không sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, KCN (potasium cyanic), malonate, adonitol, inositol, không sinh H2S. Do đó, E. coli đƣợc phát hiện do khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 44oC, có kết quả nghiệm pháp IMViC phù hợp. 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O có bản chất lipopolysacharide (LPS). Những kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn. Theo Leminor, kháng nguyên O thƣờng đặc trƣng cho từng loài (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). Các kháng nguyên O có thể đƣợc phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Để thực hiện phản ứng này, huyễn dịch vi khuẩn phải đƣợc đun nóng ở nhiệt độ 100oC trong vòng 1 giờ, sau đó cho thử với phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu. Chúng giữ vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 160 loại kháng nguyên O (R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [9]. 15 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K Kháng nguyên K nằm ở bề mặt tế bào nên là nguyên nhân không tạo ra phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 100 loại kháng nguyên K (Øiskov et al, 1971) [9]. Kauffmann chia kháng nguyên K thành 3 nhóm dựa vào ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng ngƣng kết, tính kháng nguyên và khả năng vi khuẩn gắn kết với kháng thể. a. Kháng nguyên K type L Là kháng nguyên vỏ có bản chất protein, giúp vi khuẩn có khả năng bám dính và cho phản ứng ngƣng kết với hồng cầu. Là kháng nguyên không chịu nhiệt, bị phá hủy sau khi đun nóng 100oC trong 1h. Do đó, sau khi đun nóng huyễn dịch vi khuẩn có thể gây ngƣng kết với kháng huyết thanh O mà không gây ngƣng kết với kháng huyết thanh K. b. Kháng nguyên K type A Là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccharide, vi khuẩn có kháng nguyên này khi mọc trên môi trƣờng sẽ cho khuẩn lạc dạng nhầy và chỉ cho kết quả ngƣng kết của kháng nguyên O sau khi huyễn dịch vi khuẩn đã đƣợc đun nóng 121oC trong 2h. c. Ngoài ra còn một nhóm kháng nguyên K type B, nhƣng sự tồn tại của nhóm KN này chƣa đƣợc xác định chính xác. 2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H Là kháng nguyên có bản chất protein, không bền với nhiệt độ, bị hủy bởi cồn nhƣng đề kháng với formone. Kháng nguyên này có ở những dòng E. coli di động. Theo Morris J.A. (1985) và Sussman M. (1985), hiện nay ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE [10] [11] Kháng huyết thanh thu đƣợc không những chứa kháng thể mà còn có một số chất khác. Để tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh ta có thể dùng phƣơng pháp sắc kí, kết tinh hay tủa trong muối… Phƣơng pháp tủa kháng thể trong amonium sulfate là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất để tách protein ra khỏi dung dịch. Trong dung dịch, protein liên kết với nƣớc bằng các liên kết hydrogen thông qua các nhóm ion tích điện của chúng. Khi ta thêm vào một lƣợng lớn các ion nhỏ, tích điện lớn nhƣ amonium hay sulfate thì 16 những nhóm này cạnh tranh với protein để gắn vào các phân tử nƣớc, do đó làm giảm khả năng hòa tan của protein và chúng kết tủa lại. Protein kết tủa có thể hòa tan lại trong môi trƣờng có nồng độ amonium sulfate thấp hơn. Khả năng kết tủa của các protein khác nhau thì khác nhau tùy thuộc vào số lƣợng và vị trí các nhóm cực tích điện, trọng lƣợng phân tử của protein, pH của dung dịch, nhiệt độ xảy ra sự kết tủa. Để tủa kháng thể ngƣời ta thƣờng sử dụng amonium sulfate (đôi khi dùng sodium sulfate). Nồng độ muối để kháng thể kết tủa ở các loài khác nhau thì khác nhau. Hầu hết các kháng thể của thỏ có thể kết tủa ở dung dịch muối bão hòa 40%, còn ở chuột phải từ 45-50%. Bởi vì hầu hết các thành phần khác của huyết thanh không kết tủa ở khoảng nồng độ muối này và không có sự khác biệt lớn giữa hai nồng độ trên nên nồng độ muối bão hòa 50% là mức thích hợp nhất cho hầu hết các ứng dụng khác nhau. Một điểm bất lợi của kháng thể tủa trong amonium sulfate bão hòa là kháng thể không đƣợc tinh sạch vì khi kết tủa ngoài kháng thể còn có các phân tử protein có trọng lƣợng phân tử lớn khác. Do đó, ngoài việc tủa trong muối amonium sulfate cần phải kết hợp với một số phƣơng pháp khác nếu yêu cầu kháng thể cuối cùng phải đƣợc tinh sạch hoàn toàn. 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH [7] Một trong các phƣơng pháp cổ điển để loại muối ra khỏi protein kháng thể là thẩm tích. Dung dịch protein đƣợc chứa trong bao thẩm tích làm bằng cellulose có thắt nút ở hai đầu. Bao này đƣợc đặt trong cốc lớn chứa dung dịch đệm có ái lực thấp và để ở nhiệt độ lạnh có khuấy trộn vừa phải. Trên bao thẩm tích có những lỗ nhỏ cho phép những phân tử muối có kích thƣớc nhỏ đi ra ngoài còn các phân tử protein kháng thể có kích thƣớc lớn đƣợc giữ lại trong bao thẩm tích. Sự khuếch tán các phân tử muối vào trong dung dịch đệm thẩm tích vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngoài bao thẩm tích đạt trạng thái cân bằng (thƣờng khoảng 5-6 giờ). Nếu sau khi đạt trạng thái cân bằng mà dung dịch protein chƣa loại hết muối thì ta đặt bao thẩm tích trên vào một dung dịch đệm mới và cứ tiếp tục nhƣ thế cho đến khi loại hết muối ra khỏi dung dịch protein. Trong quá trình thẩm tích, ngoài muối còn có các chất chuyển hóa có kích thƣớc nhỏ nhƣ ATP, coenzyme… cũng bị loại ra khỏi bao thẩm tích. 17 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài còn KT bị giữ lại. ( 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ [2] [5] 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) Sự liên kết một paratop của KT với một epitop của KN tƣơng ứng đƣợc thiết lập và duy trì nhờ các lực hấp dẫn có năng lƣợng nhỏ (<10 Kcal/mol) nhƣng không phải là liên kết cộng hóa trị. Các lực liên kết KN-KT:  Lực tĩnh điện giữa các nhóm COO- và NH3 + đối diện nhau của acid amin trong các chuỗi polypeptid.  Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H+ và N- hoặc O-  Các liên kết kị nƣớc giữa các acid amin kị nƣớc.  Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử . 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT Sự liên kết KN-KT có 3 đặc điểm là: phản ứng phát nhiệt, có tính đặc hiệu và thuận nghịch  Phản ứng phát nhiệt Sự liên kết giữa các KN-KT là một phản ứng phát nhiệt, giải phóng ra năng lƣợng từ khoảng 2 đến 40 Kcal/mol. 18  Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của phản ứng KN-KT thể hiện ở chỗ một vị trí paratop của KT chỉ kết hợp với một epitop của KN do đó nếu ta biết một trong hai yếu tố của phản ứng KN-KT thì có thể nhận biết đƣợc yếu tố còn lại. Tuy nhiên tính đặc hiệu của phản ứng chỉ là tƣơng đối.  Tính chất thuận nghịch Phức hệ KN-KT có thể bị phân li do nhiệt, môi trƣờng acid (pH<3), hoặc do môi trƣờng có lực ion cao. Do đó có thể rửa chiết để tách riêng KT in vitro ngay cả khi phức hệ KN-KT đƣợc hình thành in vivo. 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT Vì KT hòa tan trong dung dịch nên đặc tính của phản ứng KN-KT phụ thuộc rất lớn vào hình dạng KN. Nếu KN ở dạng hạt (vi khuẩn hoặc hồng cầu) kết hợp với KT tƣơng ứng sẽ tạo thành các hạt ngƣng kết thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha Pha thứ nhất: đặc trƣng bởi sự gắn phần Fab của KT với các quyết định KN trên bề mặt KN dạng hạt nên không nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra nhanh đƣợc gọi là pha đặc hiệu hay pha không nhìn thấy. Pha thứ hai: đặc trƣng bởi sự liên kết chéo của các kháng thể đa hóa trị, các KN dạng hạt đa hóa trị để tạo thành dạng khối đủ lớn có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra chậm hơn và theo nguyên lí lí hóa đơn thuần, nên còn gọi là pha không đặc hiệu hay pha nhìn thấy đƣợc. Mạng lƣới ngƣng kết chỉ có thể hình thành đối với các KT có ít nhất hai hóa trị. KT IgG khó xảy ra phản ứng ngƣng kết hơn so với KT IgM, vì IgG chỉ có hai vị trí gắn kết với KN trong khi đó IgM có tới năm vị trí liên kết với KN. Khả năng ngƣng kết của IgM cao h