Tối ưu hóa qui trình điều chế felodipin từ (e)-Methyl 2-(2,3-dichlorobenzylidene)-3-oxobutanoat và ethyl 3-aminocrotonat

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 381 TỐI ƯU HÓA QUI TRÌNH ĐIỀU CHẾ FELODIPIN TỪ (E)-METHYL 2-(2,3-DICHLOROBENZYLIDENE)-3-OXOBUTANOAT VÀ ETHYL 3-AMINOCROTONAT Nguyễn Thị Thu Hà*, Truong Ngoc Tuyen*, Lê Minh Trí*, Trần Bội Châu**, Trần Thành Đạo* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Felodipin thuộc nhóm chẹn kênh calci chọn lọc, được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh tim mạch. Hiện nay nhu cầu felodipin trong nước khá lớn, vì thế nghiên cứu qui trình tổng hợp nguyên liệu felodipin trong điều kiện ở nước ta hiện nay là cần thiết. Mục tiêu: Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp để có thề áp dụng vào sản xuất Phương pháp: Felodipin được điều chế dựa theo phản ứng tổng hợp dẫn chất dihydropyridin của Hantzsch. Bố trí thí nghiệm theo qui hoach thực nghiệm “thiết kế bề mặt đáp ứng” mô hình Box-Behnken, với sự hỗ trợ của phần mềm thống kê JMP. Kết quả: Chúng tôi đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất tổng hợp felodipin và điều kiện tối ưu và xây dựng qui trình tổng hợp ở qui mô phòng thí nghiệm. Kết luận: qui trình tổng hợp felodipin với các thông số tối ưu thông qua mô hình Box-Behnken có thể ứng dụng sản xuất felodipin trong điều kiện Việt Nam. Từ khóa: felodipin, tối ưu qui trình, mô hình Box-Behnken. ABSTRACT OPTIMIZATION OF PARAMETERS FOR PROCEDURE OF SYNTHESIS OF FELODIPINE Nguyen Thi Thu Ha, Truong Ngoc Tuyen, Le Minh Tri, Tran Boi Chau, Tran Thanh Dao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 381 - 385 Background: Felodipine, a dihydropyridin calcium blocker is commonly used for treatment of cardiovascular diseases such as anti-anginal and anti-hypertensive. Felodipine is imported costly with a large scale for formulation. Therefore, setting up an optimal process for synthesis of felodipine is critical need towards local pharmaceutical factories. Methods: Felodipine was synthesized via the Hantzsch reaction, in which the conditions were established via the Box-Behnken design. Results: The suitable procedure for making felodipine with high yield in laboratory conditions was set up successfully. Conclusion: This optimal and possible procedure of synthesis of felodipine could be developed to apply in bigger scale Keywords: felodipine, Box-Behnken design, optmal procedure ĐẶT VẤN ĐỀ Felodipin là thuốc trị cao huyết áp thuộc nhóm ức chế kênh calcium, được dùng rất rộng rãi với số lượng lớn nhờ vào tính chất dược động học thuận lợi (thời gian bán hủy * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Trường Đại học Tôn Đức Thắng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Nguyễn Thị Thu Hà ĐT: 01654199567 Email: nthithuha2002@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 382 khá dài, ít tác dụng phụ, trong khi tác dụng hạ huyết áp rất ổn định)(9) Hiện nay, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp felodipin được công bố(7,1,2,4,6) các công bố trước đây vẫn chưa thể hiện các điều kiện phản ứng tối ưu do vậy khi áp dụng vẫn chưa thể thu được felodipin có hiệu suất cao và đạt chất lượng dược dụng. Chương trình phát triển nguồn nguyên liệu dược trong nước do Nhà nước khởi động đã bắt đầu tiến hành nhằm mục tiêu cung cấp nguyên liệu hóa dược cho sản xuất thuốc trong nước, nhưng khó khăn là hóa chất cơ bản và nguyên liệu trung gian phải nhập ngoại. Trong nghiên cứu đã công bố trước đây, chúng tôi đã khảo sát thành công phương pháp điều chế felodipin, tuy nhiên kết quả thu được chỉ dựa trên số liệu thống kê mô tả, chưa thực hiện qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp biến ngẫu nhiên nên kết quả do vậy chưa thể hiện được tính chất tối ưu, đặc biệt giai đoạn 2 hiệu suất vẫn còn rất thấp(6). Nghiên cứu này áp dụng mô hình qui hoạch thực nghiệm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng đóng vòng Hantzsch kiểu đáp ứng bề mặt (mô hình Box-Benhken), có sự hỗ trợ của phần mềm JMP (version 4.0) (5). Đây là điểm mới của đề tài, theo đó kết quả thu được sẽ có độ tin cậy cao hơn các phương pháp thống kê mô tả như nhiều nghiên cứu khác đã thực hiện. Kết quả thu được làm cơ sở cho các bước nghiên cứu chuyển qui mô sản xuất từ phòng thí nghiệm sang qui mô pilot thuận tiện hơn. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu và trang thiết bị Bộ phản ứng 4 chỗ Eyela/Tokyo Ribakikai, model PPV3000; máy khuấy từ gia nhiệt, máy hút chân không, Máy đo điểm chảy Gallenkamp, bản sắc ký lớp mỏng tráng sẵn Kieselgel 60F 254 (Merck); máy đo IR FTIR- 8210 PC (Shimadzu); máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695 với detector PDA; máy đo 1H-NMR Bruker 500 MHz. Hóa chất Acetonitril; (E)-methyl 2-(2,3- dichlorobenzylidene)-3-oxobutanoat (viết tắt là M.B.I = methyl benzyliden itermidiate); ethyl 3- aminocrotonat; dicloromethan; isopropanol Qui trình tổng hợp tổng quát Qui trình tổng hợp felodipin được thực hiện theo Sơ đồ 1. Cho M.B.I và ethyl-3-aminocrotonate vào bình cầu 250 ml, thêm vào 30 ml etanol tuyệt đối và một lượng thích hợp pyridin làm xúc tác, cho cá từ vào bình phản ứng, đặt bình phản ứng lên bếp từ và gắn hệ thống sinh hàn hồi lưu, cài đặt nhiệt độ phản ứng là 40-90 oC, tốc độ khuấy là 185 vòng/phút. Tiến hành phản ứng và theo dõi bằng SKLM cho đến khi phản ứng kết thúc, thời gian phản ứng đối với thí nghiệm này là 7 giờ. Hỗn hợp sau phản ứng được đem đi tinh chế bằng cách kết tinh trong ethanol sấy khô 1 ngày đêm ở nhiệt độ dưới 40 oC. CH3O COOR EtOOC H3C NH2 + N H COOEtMeOOC H3C CH3 Cl Cl Cl Cl M.B.I. ethyl 3-aminocrotonat felodipin Sơ đồ 1. Sơ đồ tổng hợp felodipin theo phản ứng Hanzsch Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 383 Phương pháp xác định thông số tối ưu của phản ứng bằng phần mềm JMP Với mức giới hạn các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng đã được xác định sơ bộ, phần mềm JMP được dùng để bố trí thí nghiệm bằng phương pháp đáp ứng bề mặt theo mô hình Box-Behnken. Ma trận quy hoạch thực nghiệm thu được gồm 15 phản ứng. Thông số đáp ứng của ma trận quy hoạch thực nghiệm là hiệu suất. Kết quả thu được từ 15 thí nghiệm sẽ được xử lý bằng phần mềm thống kê JMP. Từ kết quả thu đươc sẽ xác định mối tương quan giữa các yếu tố nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ mol giữa các chất và hiệu suất phản ứng; xây dựng phương trình bề mặt đáp ứng và dự đoán điều kiện phản ứng cho hiệu suất tối ưu. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tổng hợp felodipin Thực hiện phản ứng tổng hợp theo mô tả trong phương pháp nghiên cứu. Felodipin được tinh chế bằng cách kết tinh lại trong ethanol. Nhiệt độ nóng chảy: 143 oC. Phổ IR: (KBr, cm- 1): có các đỉnh 1698, 1496, 1206, 1097 tương đương với phổ của felodipin đối chiếu. Phổ H1- NMR (CDCl3, δppm): 1,09 - 1,12 (t, 3H, -CH2- CH3); 2,22 (s, 3H, CH3 thế trên nhân pyridinyl); 2,23 (s, 3H, -CH3 thế trên nhân pyridinyl); 3,54 (s, 3H, COOCH3); 3,98 - 4,02 (q, 2H, CH2-CH3); 5,39 (s, 1H, H nhân pyridin); 5,72 (bs, 1H, NH- pyridinyl); 6,98 – 7,01 (t, 1H, H-phenyl); 7,16 – 7,20 (dd, 1H, J-8Hz, J=1,5Hz, H-phenyl); 7,22 – 7,24 (dd, 1H, J = 8Hz, J = 1,5 Hz, H-phenyl). Khảo sát sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp felodipin Dựa theo phản ứng tổng hợp felodipin, nhận thấy có các yếu tố có thể ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng như nhiệt độ, tỷ lệ mol tác chất, thời gian phản ứng Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố trên đến hiệu suất phản ứng, khảo sát khoảng giới hạn ảnh hưởng và chọn ra 3 yếu tố có ảnh hưởng nhất và để tiến hành tối ưu hóa nhờ sự trợ giúp của phần mềm JMP. Nhiệt độ phản ứng được thay đổi trong khoảng từ 40 - 90 oC, kết quả thực nghiệm cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng tới hiệu suất phản ứng. Khoảng nhiệt độ cho hiệu suất cao nhất là 75-85 oC, do vậy giới hạn khoảng khảo sát tối ưu của yếu tố nhiệt độ sẽ là 75 – 85 oC. Tỉ lệ mol giữa M.B.I và ethyl-3- aminocrotonat được khảo sát sơ bộ ở khoảng từ 0,8 đến 1,3. Kết quả cho thấy hiệu suất cao nhất khi tỉ lệ mol trong khoảng 0,9-1,1, do vậy giới hạn khoảng khảo sát tối ưu của yếu tố tỉ lệ mol được chọn là 0,9 – 1,1. Trong khoảng thời gian từ 2-12 giờ, khi tăng thời gian thì hiệu suất của phản ứng tăng. Từ 8-10 giờ, hiệu suất phản ứng có thay đổi nhưng không đáng kể. Sau đó, từ 10-12 giờ, thời gian tăng không làm hiệu suất tăng nữa mà hiệu suất phản ứng giảm đi. Kết quả cho thấy hiệu suất cao nhất khi thời gian khảo sát trong khoảng 4-8 giờ. Tối ưu hóa hiệu suất phản ứng tổng hợp felodipin Từ các kết quả sơ bộ nêu trên, ma trận các phản ứng tối ưu được thiết lập với 3 yếu tố biến thiên: nhiệt độ, tỉ lệ mol chất phản ứng và thời gian phản ứng. Mỗi yếu tố biến thiên được chia thành 3 mức. Yếu tố nhiệt độ có 3 mức là 75 - 80 - 85; yếu tố tỉ lệ mol M.B.I và ethyl 3- aminocrotonat có 3 mức là 0,9 – 1,0 – 1,1; yếu tố thời gian có 3 mức là 4 – 6 – 8. Ma trận thực nghiệm gồm có 15 thí nghiệm (Bảng 2.), các thí nghiệm sẽ được lặp lại 3 lần. Bảng 2. Mã hóa ma trận quy hoạch thực nghiệm và hiệu suất thu được STT Mã thí nghiệm Nhiệt độ Tỉ lệ mol Thời gian Hiệu suất 1 --0 75 0,9 6 0,604 2 -0- 75 1,0 4 0,448 3 -0+ 75 1,0 8 0,469 4 -+0 75 1,1 6 0,850 5 0-- 80 0,9 4 0,351 6 0-+ 80 0,9 8 0,780 7 000 80 1,0 6 0,828 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 384 STT Mã thí nghiệm Nhiệt độ Tỉ lệ mol Thời gian Hiệu suất 8 000 80 1,0 6 0,843 9 000 80 1,0 6 0,823 10 0+- 80 1,1 4 0,519 11 0++ 80 1,1 8 0,600 12 +-0 85 0,9 6 0,747 13 +0- 85 1,0 4 0,552 14 +0+ 85 1,0 8 0,776 15 ++0 85 1,1 6 0,897 Từ các giá trị trong Bảng 2, sử dụng phần mềm JMP để phân tích sự ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, tỉ lệ mol chất phản ứng, thời gian phản ứng lên hiệu suất tổng hợp felodipin, phương trình bề mặt đáp ứng được xác định như sau: Y = 0,8276667 + 0,96875X1 + 0,04325X2 + 0,113625X3 + 0,0495X1X3 –0.07325X2X3 – 0,24108X32 (1) Trong đó: Y: hiệu suất; X1: nhiệt độ; X2: tỉ lệ mol giữa các chất; X3: thời gian phản ứng. Kết quả phân tích trên phần mềm JMP cũng thể hiện sự tương quan giữa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu xuất phản ứng (Hình 1). Theo đó, sự tương quan tuyến tính giữa các yếu tố đối với hiệu suất là có ý nghĩa với giá trị R2 = 0,91, ở độ tin cậy 95% (Hình 1A). Hình 1: Biểu đồ và kết quả phân tích thể hiện tương quan tuyến tính của các yếu tố với hiệu suất tổng hợp felodipin Hình 2: Dự đoán các thông số tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng lên hiệu suất phản ứng tổng hợp với sự hỗ trọ của công cụ Prediction Profiler trong phần mềm JMP. Những số liệu phân tích trong Hình 1B, cho thấy rõ hơn về mức độ ảnh hưởng của từng yếu tố lên hiệu suất phản ứng. Trong đó, ảnh hưởng của các yếu tố được coi là có ý nghĩa khi p<0,05 (xem cột Prob., trong Hình 1B). Kết quả thu được cho thấy cả 3 yếu tố khảo sát đều ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng, trong đó nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng mạnh nhất(p < 0,05). Giải phương trình (1) với 3 tham số như trên sẽ thu được các giá trị cần khảo sát. Để đơn giản hơn cho việc giải phương trình trên, công cụ dự đoán (prediction profier) trong phần mêm JMP Y 1.124 0.285 0.921579 Nhietdo(75,85) 7 5 8 5 84.9 Tile mol(0.9,1.1) 0 .9 1 .1 1 Thoi gian(4,8) 4 8 6.5 Prediction Profiler 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Y A c tu a l .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0 Y Predicted P=0.0385 RSq=0.91 RMSE=0.0949 Actual by Predicted Plot Intercept Nhietdo(75,85)&RS Tile mol(0.9,1.1)&RS Thoi gian(4,8)&RS Nhietdo(75,85)*Tile mol(0.9,1.1) Nhietdo(75,85)*Thoi gian(4,8) Tile mol(0.9,1.1)*Thoi gian(4,8) Nhietdo(75,85)*Nhietdo(75,85) Tile mol(0.9,1.1)*Tile mol(0.9,1.1) Thoi gian(4,8)*Thoi gian(4,8) Term 0.8276667 0.096875 0.04325 0.113625 -0.01675 0.0495 -0.07325 -0.027583 -0.017833 -0.241083 Scaled Estimate 0.054811 0.033564 0.033564 0.033564 0.047467 0.047467 0.047467 0.049406 0.049406 0.049406 Std Error 15.10 2.89 1.29 3.39 -0.35 1.04 -1.54 -0.56 -0.36 -4.88 t Ratio <.0001 0.0343 0.2539 0.0196 0.7386 0.3448 0.1834 0.6007 0.7329 0.0046 Prob>|t| Scaled Estimates A B Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 385 được sử dụng để xác định nhanh giá trị của các tham số thuộc phương trình trên. Theo đó, hiệu suất tối đa của phản ứng có thể đạt đến 92,15% khi thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 85oC, tỉ lệ mol giữa M.B.I và ethyl-3-aminocrotonat là 1,0 và thời gian phản ứng là 6,5 giờ (Hình 2). Để kiểm tra tính tương thích của phương trình bề mặt đáp ứng đối với thực nghiệm, tiến hành phản ứng 3 lần ở điều kiện dự đoán, lượng M.B.I sử dụng là 0,05 mol. Bảng 2. Kết quả hiệu suất phản ứng ở những điều kiện dự đoán. Từ bảng số liệu 2 tính được hiệu suất trung bình cho 3 lần phản ứng là 89,40 % gần sát với kết quả tối ưu đã xác định từ chương trình JMP là 92,15%. Hiệu suất tinh chế Để thu sản phẩm tinh khiết, quá trình tinh chế được thực hiện theo các tài liệu đã công bố trước, trong đó dung môi dùng kết tinh là isopropanol, nhiệt độ hòa tan để kết tinh 45oC. Khi đó hiệu suất trung bình đạt 70,26%. Điều này có thể giải thích là do một phần felodipin đã bị mất trong quá trình chiết và lọc, rửa. Kiểm nghiệm Sản phẩm felodipin được kiểm tra chất lượng theo BP 2009(8) (tại Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh) cho kết quả đạt tiêu chuẩn chất lượng của Dược điển Anh về định tính (phổ IR ở Hình 6), phổ UV có hấp thu cựa đại tại 361 nm và 238 nm là 0,35. Mất khối lượng do làm khô: 0,06%. Định lượng: chế phẩm chứa 99.47% felodipine tính theo chế phẩm khô. Ngoài ra phổ NMR proton cũng được phân tích bổ sung xác nhận cấu trúc của felodipin tổng hợp. KẾT LUẬN Nhờ vào sự trợ giúp của phần mềm JMP, quá trình xác định các thông số tối ưu của một phản ứng được tiến hành nhanh hơn, ma trận quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box- Behnken giúp thực hiện thí nghiệm ít hơn, tiết kiệm được tiền của và giảm thiểu được sự độc hại cho người làm thí nghiệm cũng như môi trường xung quanh. Quá trình tổng hợp felodipine từ M.B.I và ethyl-3-aminocrotonate đạt hiệu suất tổng hợp 89,40 % và hiệu suất tinh chế ở quy mô phòng thí nghiệm là 72,75% với những điều kiện như sau: - Nhiệt độ phản ứng: 85 oC. - Tỉ lệ mol tác chất M.B.I - ethyl-3- aminocrotonate (1 : 1). - Thời gian phản ứng: 6,5 giờ. Các kết quả kiểm nghiệm cho thấy felodipine tổng hợp đạt tiêu chuẩn BP 2009. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Auerbach J (1994), “Process for the prepararion of 4-substituted- 1,4-dihydropydrines”, patent No. US 4769374. 2. Auerbach J, Brooklyn (1994), “Process for the preparation of 4- substituted-1,4-dihydropyrines”, patent No. US 5,310,917. 3. BP 2009, p2443-2447. 4. Cascio G, Castelli E, Manghisi E (1998), “Process for the preparation of dihydropyridines”, International publication number: WO98/07698. 5. CD JMP version 4.0. 6. Che D, Murthy K (2005), “Process to prepare 1,4-dihydropyridine intermediates and derivatives thereof ”, patent No. US 6,858,747 B2. 7. Gustavsson A, Sweden S (1999), “Manufacturing process for felodipine”, patent No. US 5,942,624. 8. Phạm Hoài Thanh Vân, Trần Thành Đạo, Võ Quang Hùng, Lê Minh Trí (2010). Tổng hợp felodipin. Y học TP. Hồ Chí Minh, 14(1):105-109. 9. Trương Phương, Trần Thành Đạo. Hóa Dược 2. Nhà xuất bản Giáo dục, 2009: 7-10. Ngày nhận bài: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo24.12.2012 Ngày đăng bài: STN Nhiệt độ (oC) Tỉ lệ mol Thời gian (h) Hiệu suất (%) 1 85 1,0 6,5 88,68 2 85 1,0 6,5 89,47 3 85 1,0 6,5 90,12