Tối ưu hóa quy trình tổng hợp Carboxymethyl Beta-Cyclodextrin

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 216 TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL BETA-CYCLODEXTRIN Nguyễn Thị Minh Phương*, Nguyễn Thị Kiều Hảo*, Nguyễn Đức Tuấn*, Trần Quốc Thanh* TÓM TẮT Mở đầu-Mục tiêu: Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất được sử dụng phổ biến trong c{c phương ph{p sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), điện di mao quản (CE), .l|m t{c nh}n đối quang phân tách c{c dược chất l| đồng phân quang học. So với một số lượng lớn c{c dược chất quang hoạt rất đa dạng về cấu trúc và tính chất đang có mặt trên thị trường hiện nay thì số lượng các tác nhân quang hoạt được thương mại hóa còn ít, giá thành cao. Tiếp nối các công trình trước đ}y đã tổng hợp được các dẫn chất methyl, methoxycarbonyl và các dẫn chất n|y đã đƣợc ứng dụng l|m t{c nh}n đối quang tách thành công một số dƣợc chất quang hoạt bằng CE. Với mong muốn tiếp tục phát triển và góp phần l|m đa dạng hóa tác nh}n đối quang để phân tách c{c đồng phân quang học bằng CE, đề t|i: “TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL BETA CYCLODEXTRIN” đã được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ưu về hiệu suất ở quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với điều kiện trong nước dẫn chất carboxymethyl từ β-cyclodextrin. Đối tượng nghiên cứu: carboxymethyl- β-CD. Phương pháp nghiên cứu: Thực hiện phản ứng của β-CD với tác nhân acid 2-cloroacetic để thu được các dẫn chất carboxymethyl- β-CD. Phân lập và tinh chế sản phẩm bằng phương ph{p thay đổi dung môi v| phương pháp kết tinh lại. Dẫn chất tổng hợp được x{c định độ tinh khiết qua việc x{c định điểm chảy v| góc quay cực riêng. Cấu trúc được x{c định qua dữ liệu thu được từ phổ IR, NMR, MS. C{c điều kiện của phản ứng được khảo s{t để quy hoạch và tối ưu hóa bằng phần mềm Modde 5.0 với mô hình Box-Behnken. Kết quả: Đã tổng hợp được carboxymethyl- β-CD với hiệu suất 78,01%, DS = 8. Kết luận: Thành công của đề tài tạo tiền đề cho hướng tiếp tục nghiên cứu ứng dụng sản phẩm làm tác nhân đối quang, ph}n t{ch đồng phân quang học các nguyên liệu và thành phẩm dược chất quang hoạt bằng phương ph{p điện di mao quản. Từ khóa: carboxymethyl- β-cyclodextrin, tổng hợp, dẫn chất β-cyclodextrin ABSTRACT OPTIMIZATION OF THE SYNTHESIS OF CARBOXYMETHYL-Β-CYCLODEXTRIN Nguyen Thi Minh Phuong, Nguyen Thi Kieu Hao, Nguyen Duc Tuan, Tran Quoc Thanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:216 - 220 Background-Objectives: Beta-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives are commonly used as the chiral selectors for analysis of enantiomer drugs by HPLC and capillary electrophoresis (CE). Recently, the requirement for quality control of chiral drugs is increasingly while the number of commercial chiral selectors is limited and sold with high price. Some beta-cyclodextrin derivatives as methyl--CD and methoxycarbonyl--CD were successfully synthesized by our group. Which were successfully applied for separation of some enantiomer drugs by CE, too. With the desire to develop the selective chiral selectors, this study was carried out to optimize the synthesis of carboxymethy-β-cyclodextrin from β-cyclodextrin. *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thị Minh Phƣơng ĐT: 0909810668 Email: minhphuongvn80@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 217 Subjects and Methods: The subjects of this study was carboxymethyl derivatives of -cyclodextrin, which was synthesized from β-CD with 2-cloroacetic acid agents. Purity of the synthesized product was checked by melting point and specific rotation measurements, and its structures was elucidated by IR, MS, and NMR spectra. Influences of reaction temperature, reaction duration and reactant ratio on the substitution degree and the yield of MC-β-CD were discussed. The synthetic process was optimized by Modde 5.0 software using Box- Behnken model to achieve the highest yield. Results: Carboxymethyl-β-CD was synthesized with the yield of 78.01%, and DS (degree of substitution) values was 8. Conclusion: The successful synthesis of carboxymethyl-β-CD derivative was provides a theoretical and experimental basis for further scale-up research. In the future, we are going to developing the application of this selector for separation of enantiomer drugs by capillary electrophoresis. Keywords: carboxymethyl-β-betacyclodextrin, synthesis, β-betacyclodextrin derivative MỞ ĐẦU Beta-cyclodextrin (-CD) và các dẫn chất của chúng đƣợc sử dụng phổ biến trong c{c phƣơng pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC , điện di mao quản (CE), .làm tác nhân đối qu ng t{ch đồng phân quang học(2,5-8,10), đặc biệt đƣợc ứng dụng trong kiểm nghiệm các thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt. Để ph}n t{ch c{c dƣợc chất quang hoạt cần tác nhân đối quang phù hợp với tính chất củ dƣợc chất, đ i khi để ph}n t{ch đƣợc các dạng đồng phân của một chất còn cần phải phối hợp nhiều tác nhân quang hoạt với nhau. Các thuốc có hoạt chất là dạng đồng phân riêng lẻ xuất hiện ngày càng nhiều trên thị trƣờng dƣợc phẩm trong và ngo|i nƣớc do có hoạt tính mạnh và ít tác dụng phụ hơn dạng racemic củ chúng nhƣ: S- amlodipin, levofloxacin, levocetirizin, S- omeprazol, . So với một số lƣợng lớn c{c dƣợc chất quang hoạt rất đ dạng về cấu trúc và tính chất đ ng có mặt trên thị trƣờng hiện nay thì số lƣợng các tác nhân quang hoạt đƣợc thƣơng mại hóa còn ít, giá thành cao. Chính vì vậy, xu hƣớng của các nhà nghiên cứu ở c{c nƣớc hiện nay là tổng hợp nhiều t{c nh}n t{ch đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao và có giá trị kinh tế(1,4,9). Tiếp nối c{c c ng trình trƣớc đ}y đã tổng hợp đƣợc các dẫn chất methyl, methoxycarbonyl và các dẫn chất n|y đã đƣợc ứng dụng làm tác nhân đối quang tách thành công một số dƣợc chất quang hoạt bằng CE. Với mong muốn tiếp tục phát triển và góp phần l|m đ dạng hóa tác nh}n đối qu ng để ph}n t{ch c{c đồng phân quang học bằng CE, đề t|i: “TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP CARBOXYMETHYL BETA CYCLODEXTRIN” đã đƣợc thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp tối ƣu về hiệu suất ở quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với điều kiện trong nƣớc các dẫn chất carboxymethyl từ β-cyclodextrin. NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Beta cyclodextrin và acid 2-cloroacetic (Himedia). Trang thiết bị M{y đo phổ IR Shimazdu (Nhật , m{y đo phổ NMR ruker 500 MHz Đức), máy LC-MS ruker 500 MHz Đức , m{y đo góc qu y cực HORIBA-SEO+PA 300 (Nhật). Phản ứng tổng hợp carboxymethyl--CD(1,3) O OCH2COO  O OOCH2CO O OCH2COO  7 Carboxymethyl--Cyclodextrin O OH OOH HO O 7 -Cyclodextrin Cl OH O NaOH, to + Sử dụng phƣơng ph{p th y đổi dung môi và phƣơng ph{p kết tinh lại để phân lập và tinh chế sản phẩm thu đƣợc từ phản ứng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 218 Các dẫn chất tổng hợp đƣợc x{c định độ tinh khiết qua việc x{c định điểm chảy, góc quay cực riêng và sắc ký lớp mỏng (TLC). Cấu trúc đƣợc x{c định qua dữ liệu thu đƣợc từ phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR) và khối phổ (MS). Khảo sát sự ảnh hƣởng của các yếu tố đến hiệu suất phản ứng nhƣ: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ mol của MCA và β-CD, khảo sát khoảng giới hạn ảnh hƣởng và tiến hành tối ƣu hó bằng của phần mềm Modde 5.0 với mô hình Box-Behnken. KẾT QUẢ Tổng hợp carboxymethyl--CD Cho vào bình cầu 1 g β-CD (0,88 mmol), thêm 3 g n tri hydroxyd đã đƣợc hòa tan trong 7 ml nƣớc, đun hồi lƣu ở 80 oC trong 1 giờ 30 phút. Thêm 3 g acid monocloroacetic (MCA) (31,75 mmol) (đã hò t n trong 3 ml nƣớc vào hỗn hợp phản ứng, tiếp tục đun ở 120 oC, tiến h|nh chấm sắc ký lớp mỏng theo dõi sự tạo th|nh củ sản phẩm theo thời gian. Điều chỉnh pH hỗn hợp sau phản ứng đến pH = 6. Thêm 150 ml methanol vào dung dịch sau phản ứng, lọc thu lấy tủa. Tủ đƣợc hòa lại trong 4 ml nƣớc cất, tủa lại trong 80 ml methanol. Rửa sản phẩm bằng methanol 3 lần, mỗi lần 5 ml. Sản phẩm đƣợc sấy chân không ở 60 oC. Từ lƣợng sản phẩm thu đƣợc tính hiệu suất là 46,2%. Tính chất sản phẩm Chất bột trắng, rất dễ hút ẩm, tan trong nƣớc, không tan trong methanol, ethanol, aceton, ether. Thực hiện sắc ký lớp mỏng của vết nguyên liệu và sản phẩm với hệ dung môi làm ph động là IPA-EtOAc-nƣớc (5 : 4 : 1) và butanol- ethanol - nƣớc (3 : 2 : 3,5), kết quả cho thấy sản phẩm sau tinh chế chỉ cho một vết trên bản sắc ký, không có vết nào trùng với vết nguyên liệu, chứng tỏ phản ứng đã tạo thành chất mới, tuy nhiên vết sản phẩm kéo vệt dài nên có thể cho rằng sản phẩm tạo thành gồm các dẫn chất có độ thế khác nhau. Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm đo đƣợc là 256-266 oC, năng suất quay cực: 110][ 20 D Sản phẩm thu đƣợc qua phản ứng đem đo IR, NMR v| MS để xác định cấu trúc Dữ liệu phổ IR của sản phẩm Số sóng (cm -1 ) Cường độ, hình dạng Nhóm chức 3317 Mạnh, tù O-H (alcol) 2925 Trung bình, nhọn C-H (alkan) 1593 Mạnh, nhọn C=O (acid) 1014 Mạnh, nhọn C-O-C (ether) Dữ liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500MHz) của sản phẩm Độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) Số proton Số đỉnh Vị trí proton 5,15-5,39 7H m H1 3,53-4,39 58H m H2-H6, Hb Dữ liệu phổ MS của sản phẩm ST T m/z z Mảnh Khối lượng phân tử Công thức phân tử tương ứng 1 764,1940 2 [MNa2] + 1482.388 (C6H10O5)7(CH2COOH)6 2 735,1880 2 [MNa2] + 1424.376 (C6H10O5)7(CH2COOH)5 3 706,1862 2 [MNa2] + 1366.372 (C6H10O5)7(CH2COOH)4 4 677,1830 2 [MNa2] + 1308.366 (C6H10O5)7(CH2COOH)3 Tối ƣu hóa quy trình tổng hợp để đạt hiệu suất cao nhất Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến hiệu suất phản ứng Hiệu suất phản ứng tăng dần từ 3 giờ đến 6 giờ, dich phản ứng lúc này chuyển từ màu nâu sang vàng. Khi tiếp tục phản ứng từ 6 giờ đến 8 giờ thì hiệu suất phản ứng hầu nhƣ kh ng th y đổi. Hình 1: Ảnh hưởng của thời gian lên hiệu suất phản ứng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 219 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng Tiến hành khảo sát ở nhiệt độ 50 - 90 C, khi tăng nhiệt độ từ 50 C đến 60 C, hiệu suất tăng, khi nhiệt độ tăng từ 60 C đến 90 C, hiệu suất phản ứng giảm mạnh. Hình 2: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu suất phản ứng Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa MCA và β-CD đến hiệu suất phản ứng Khi tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và β-CD tăng từ 15 đến 25, hiệu suất tăng, khi tỷ lệ này tăng từ 25 đến 35, hiệu suất phản ứng giảm. Hình 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và β-CD lên hiệu suất phản ứng Tối ưu hóa điều kiện phản ứng Dùng phần mềm Modde 5.0 với mô hình Box-Behnken bố trí thí nghiệm với 3 thông số: thời gian phản ứng (4-8 giờ), nhiệt độ phản ứng (50-70 C) và tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và β-CD (20-30), ma trận quy hoạch thực nghiệm gồm 15 thí nghiệm. Tiến hành các thí nghiệm và xử lý kết quả bằng phần mềm Modde 5.0 tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho phản ứng tổng hợp là thời gian 7 giờ, nhiệt độ 59 C và tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và β-CD là 26,7 với hiệu suất dự đo{n l| 79,50 % Tiến hành thực nghiệm phản ứng tổng hợp carboxymethyl-β- CD ở điều kiện trên ba lần thu đƣợc sản phẩm với hiệu suất trung bình là 78,01 %. BÀN LUẬN β-CD là một dạng polymer có nhiều trung tâm bất đối trong phân tử, nên rất khó khống chế điều kiện phản ứng để tạo thành một sản phẩm thế duy nhất sau phản ứng. Sản phẩm thu đƣợc thƣờng là liên hợp các dẫn chất có độ thế khác nhau. Thực tế, phần lớn các sản phẩm dẫn chất β-CD thƣơng mại không công bố độ tinh khiết mà chỉ công bố độ thế trung bình, phân tử lƣợng trung bình. Theo dữ liệu phổ 1H-NMR của sản phẩm thu đƣợc, proton trong nhóm thế c rboxymethyl đƣợc ký hiệu là Hb. Proton trong nhóm R-O-CH3 có độ dịch chuyển 3.2– 3.8 ppm, nên Hb trong nhóm carboxymethyl khi gắn với oxy RO−CH2−COOH sẽ có độ dịch chuyển về phí trƣờng thấp khoảng 4 ppm, nên sẽ chồng lên các tín hiệu H2-H6 trong phổ. Tính DS của sản phẩm theo dữ liệu Phổ 1H-NMR: số proton Hb của phân tử carboxymethyl-β-CD là 58 – 42 = 16. Vì mỗi nhóm thế −CH2COOH có 2 proton, nên số nhóm thế −CH2COOH có trong phân tử carboxymethyl-β-CD (hay DS) là 16/2 = 8. Theo dữ liệu phổ MS của sản phẩm thu đƣợc, công thức của carboxymethyl-β-CD có thể viết thành: (C6H10O5)7(CH2COOH)n . Trong đó, n l| số nhóm carboxymethyl trên phân tử carboxymethyl-β-CD. Dễ dàng suy ra khối lƣợng của phân tử carboxymethyl-β-CD với nhóm thế khác nhau: Mn = Mβ-CD + n*MCH2COOH = 1134 + n*58 (Mn là phân tử lƣợng của sản phẩm có n nhóm thế). Nhƣ vậy từ các dữ liệu thu đƣợc từ IR, MNR v| MS có đủ cơ sở để kết luận sản phẩm thu đƣợc là dẫn chất carboxymethyl-β-CD. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 220 KẾT LUẬN Đề t|i đã x}y dựng đƣợc quy trình tối ƣu để tổng hợp carboxymethyl-β-CD với điều kiện phản ứng: thời gian 7 giờ, nhiệt độ 59 C và tỷ lệ (mol/mol) giữa MCA và β-CD l| 26,7; thu đƣợc sản phẩm có DS = 8 và hiệu suất 78,01%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brandt L (1987). Ethers of beta-cyclodextrin and a process for their preparation. US Patent, US 463805. 2. Gyula O, Tibor C, Mária S (2014). Cyclodetrins in chromatography. Eur. Chem. Bull., 3 (1): 2-12. 3. Jacques R, Trinadha R, Joseph P (1994). Distribution of substituents in carboxymethyl ethers of cyclomaltoheptanose. Carbohydrat Research, 258: 281-285. 4. Jindrich JP, Bengt L, Pia S, Kazuaki H (1995). Regioselectivity of alkylation of cyclomaltoheptaose (β-cyclodextrin) and synthesis of its mono-2-O- methyl,-ethyl,-allyl, and-propyl derivatives. Carbohydrate Research, 266: 75-80. 5. József S (2004). Past, present, and future of cyclodextrin research. Pure and Applied Chemistry, 76: 1829-1830. 6. Julianna S, Katalin G (1994). Use of cyclodextrins and cyclodextrin derivatives in high- performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 668: 509-517. 7. Manoj MN, Dinesh MS, Parag VJ (2012). The Cyclodextrins: A Review. Journal of Current Pharmaceutical Research: 1-6. 8. Salvatore F. (1996). Identification of chiral drug isomers by capillary Electrophoresis. Journal of chromatography A., 735: 77- 121 9. Takeo K (1976). Synthesis of Heptakis (2-O-methyl-β- cyclodextrin. Die Starke, 28 (7): 226-227. 10. Verleysen K, Sabah S, Scriba G, Sandra P (1999). Enantioseparation of Aspartyl Dipeptides by CE: Comparison between 18-Crown-6-Tetracarboxylic Acid and Carboxymethyl- 13-Cyclodextrin as Chiral Selector. Chromatographia, 49: 215-218. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018