Tổng hợp 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2hindol-2-on (tạp chất a) của diclofenac natri để làm chất đối chiếu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 521 TỔNG HỢP 1-(2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H- INDOL-2-ON (TẠP CHẤT A) CỦA DICLOFENAC NATRI ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU Nguyễn Thị Thanh Trà*, Hà Di u Ly**, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Trần Thành Đạo* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Sự có mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất nhỏ trong nguyên liệu hay các chế phẩm thuốc đều ảnh hưởng đến hiệu quả và mức độ an toàn của dược phẩm. Do vậy, x{c định giới hạn tạp chất liên quan là một yêu cầu không thể thiếu trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm của các thuốc. Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (Tạp chất A) của Diclofenac dùng trong kiểm nghiệm. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tạp A của diclofenac được tổng hợp từ natri diclofenac bằng phản ứng oxi hóa đóng vòng trong môi trường acid, xúc tác ánh sáng và sự hỗ trợ vi sóng. Sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột (Si-60) v| x{c định cấu trúc sản phẩm bằng phương ph{p phổ nghiệm UV, IR, MS và 1H-NMR và 13C-NMR. Kết quả: Tổng hợp được tạp A diclofenac độ tinh khiết cao h|m lượng 98,21% so với tạp chuẩn A (USP). Kết luận: Quy trình điều chế tạp A diclorofenac đơn giản có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm với hiệu suất khoảng 53%. Sản phẩm có độ tinh khiết cao đạt yêu cầu chất lượng đối với nguyên liệu đối chiếu. Từ khóa: Tạp A diclofenac, tổng hợp, tạp đối chiếu ABSTRACT SYNTHESIS OF 1- (2,6-DICHLOROPHENYL)-1,3-DIHYDRO-2H-INDOL-2-ONE (IMPURITY A) OF DICLOFENAC SODIUM AS REFERENCE MATERIAL Nguyen Thi Thanh Tra, Ha Dieu Ly, Nguyen Huu Lac Thuy, Tran Thanh Dao * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 521 - 527 Background: The presence of very small amounts of impurities in the active ingredients or in the dosage forms may affect the effectiveness and safety to the patients. Therefore, determining the level of related impurities is an indispensable requirement in the specifications of substances and products. Objectives: Setting up a prosedure for synthesis of 1-(2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-one used as reference impurity for testing quality of diclofenac medicines. Methods: A impurity of diclofenac was synthesized from sodium diclofenac by oxidation in acide medium under accelerated by microwave and sunlight. The product was purified by column chromatography (Si-60) and the structure of final product was determined by UV, IR, MS and 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy. Results:A impurity of diclofenac was obtained with a high purity of 98.21% compared to standard A impurity (USP). Conclusions: A simple procedure for synthesis of diclofenac A impurity was developted successfully in laboratory conditions with an overall yield of 53%. The product has a high purity of 98.21% which satisfies requirements for establishment of reference materials. * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh ** Viện Kiểm nghiệmThuốc, Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Th|nh Đạo ĐT: 0903716482 Email: daott@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 522 Keywords: Diclofenac A impurity, synthesis, reference impurity ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, c{c nh| m{y dược phẩm trong nước đều sản xuất thuốc với nguồn nguyên liệu chủ yếu là nhập khẩu. Do đó, kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu l| điều hết sức cấp thiết, đặc biệt là tạp chất liên quan. Yêu cầu nghiêm ngặt về tạp chất đã được các tổ chức quốc tế đưa ra v| là một trong những chủ đề chính trong các hội nghị quốc tế để thống nhất các nguyên tắt như Q3A (R), Q3B (R) và Q3C của ICH. Sựcó mặt của tạp chất liên quan ở lượng rất nhỏ cũng có thể ảnh hưởng đến hiệu lực và mức độan toàn của dược phẩm. Các tạp chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu hiện vẫn chưa được tổng hợp và sản xuất nhiều tại Việt Nam, nếu phải mua thì rất đắt và phụ thuộc nhiều từ bên ngoài và mất thời gian đặt mua, do đó, đ}y l| vấn đề được nhiều xí nghiệp dược Việt Nam quan tâm. Diclofenac, thuộc nhóm kháng viêm, giảm đau không steroid l| một trong những nhóm thuốc được sử dụng nhiều nhất. Theo BP 2014, diclofenac có 5 tạp chất li n quan, trong đó tạp A là vừa là sản phẩm trung gian vừa là sản phẩm phân hủy trong quá trình sản xuất(2). Vì vậy, trong dược điển USP, BP và EP hiện hành, qui định phảikiểm soát tạp Atrong nguyên liệu và thành phẩm. Với mong muốn tạo ra chất chuẩn tạp phục vụ cho công tác kiểm nghiệm để giảm chi phí sản xuất cũng như gi{ th|nh sản phẩm, trong bài báo này chúng tôi trình bày kết quả tổng hợp 1- (2,6-dichlorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on (Tạp chất A của diclofenac natri) hướng đến thiết lập chất tạp đối chiếu. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dẫn chất 1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro- 2H-indol-2-on còn gọi là tạp A của diclofenac. Hóa chất Nguyên liệu diclofenac natri, Số lô: DA006; hạn dùng: 2/2017; nơi sản xuất: Ấn Độ. Tạp A diclofenac natri chuẩn USP, Số lô: USP/LOM 175, h|m lượng 99%, nguyên trạng. Methanol (HPLC), ethyl acetat (PA)của JT Baker, acid phosphoric 85%, acid hydrocloric 37%, acid sulfuric 98%, natri dihydro phosphat PA, bản mỏng silica gel F254 (Merck), silica gel cỡ hạt 60- 200mm dùng cho sắc ký cột. Thiết bị Lò vi sóng Hitoshi G-475AW, máy hồng ngoại Thermo-Science, máy sắc ký lỏng Shimadzu LC-20A với detector PDA, máy DSC- Q20, m{y đo khối phổ tứ cực LC-MS/MS Agilent 1200 nguồn ESI, cột Inersil C18 (250 mm x 4,6 mm, 5 m), m{y đo cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam). Phƣơng pháp nghiên cứu Tạp diclofenac được tổng hợp theo sơ đồ 1. Sơ đồ 1: Phản ứng tổng hợp tạp A của diclofenac Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 523 Giai đoạn 1 Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành diclofenac để hạn chế tối đa tạp hình thành trong phẩn ứng tổng hợp tiếp theo(2,3). Cân khoảng 12 g diclofenac natri, thêm khoảng 500 ml dung dịch HCl 10% vào bình Bucher 1L, khuấy mạnh liên tục. Kết tủa dạng acid của diclofenac xuất hiện. Lọc lấy tủa. Kết tinh diclofenac trong 300 ml methanol, sấy sản phẩm ở 60oC trong 12 giờ. Sản phẩm thu được đem đo phổ IR v| DSC để định tính v| x{c định độ tinh khiết (điểm chảy diclofenac là 178,8oC)(5). Giai đoạn 2: Tổng hợp tạp A từ diclofenac Dựa theo các tài liệu đã nghi n cứu, diclofenac trong môi trường acid, dưới t{c động của vi sóng sẽ xảy ra phản ứng đóng vòng hình thành tạp A(2,3,4). Cố định tỷ lệ (g/ml) chất nền diclofenac và thể tích acid sulfuric là 1: 10. Tiến hành khảo sát các công suất lò từ 50W, 150W, 250W, với nồng độ acid sulfuric lần lượt là 20%, 30%, 40% và 50% và thời gian phản ứng ở các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút để chọn ra điều kiện tổng hợp thích hợp nhất. Tinh chế: Sản phẩm tổng hợp được tinh chế qua sắc kí cột tr n pha tĩnh hấp phụ (silica gel Si- 60), dung môi rửa giải ethyl acetat 100%. X{c định cấu trúc: X{c định bằng c{c phương pháp phổ nghiệm 1H-NMR, 13C-NMR, IR cũng như so s{nh c{c số liệu phổ có được với tài liệu tham khảo(3). Xác định độ tinh khiết: Độ tinh khiết của sản phẩm tổng hợp được x{c định bằng HPLCvới điều kiện sắc ký tu}n theo điều kiện kiểm nghiệm tạp A trong nguyên liệu diclofenac natri của USP 35(6). Dung dịch đệm phosphat pH 2.5: Trộn đều 2 thể tích tương đương acid phosphoric 0.01 M v| natri hydrophosphat 0.01 M. Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm phosphat pH 2.5 (700:300). Dung môi: Methanol:Nước (70:30) Cột: d|i 0.25 m, đường kính 4.6 mm Pha tĩnh: octylsilyl silica gel (5 µm). Pha động: Hỗn hợp methanol v| đệm phosphat pH 2.5 (700:300). Tốc độ dòng:1 ml/phút. ước sóng phát hiện: 254 nm. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Sử dụng chế độ Max plot giúp phát hiện các pic tạp chất trên toàn thang sóng 190 – 800 nm. Sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết pic để x{c định độ tinh khiết pic. KẾT QUẢ Gi i đoạn 1: Chuyển hoàn toàn diclofenac natri thành diclofenac dạng acid Thu được 9,8 g kết tinh trắng, bông xốp. Phổ IR cho c{c dao động đặc trưng tương ứng với diclofenac, điểm chảy 178,8oC phù hợp với điểm chảy diclofenac. Tiến hành đo DSC để x{c định độ tinh khiết của sản phẩm là 99,5 %. Gi i đoạn 2: Tổng hợp tạp A của diclofenac Khảo sát yếu tố công suất lò vi sóng Cân khoảng 1,0 g diclofenac thu được vào 3 bình nón 100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4 20%, tiến hành phản ứng lần lượt với 3 công suất 50W, 150W, 250W trong 2 phút. Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC, sử dụng tạp chuẩn A của diclofenac làm chất đối chiếu. x{c định hiệu suất phản ứng dựa vào % diện tích pic của tạp A trên sắc ký đồ. Lấy khoảng 1 ml dung dịch phản ứng chiết bằng 5 ml x 2 lần cloroform, l|m bay hơi dịch cloroform cắn hòa tan trong pha động theo điều kiện HPLC (Hình 1). Tạp được hình thành nhiều nhất ở công suất 150W, trong khi ở công suất 250W sau 10 giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn toàn. Chọn công suất 150W là công suất để thực hiện phản ứng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 524 Hình 1: Kết quả khảo sát công suất phản ứng Khảo sát yếu tố nồng độ dung dịch H2SO4 Cân khoảng 1,0 g diclofenac vào 4 bình nón 100 ml, thêm vào mỗi bình lần lượt 10 ml dung dịch H2SO4 ở các nồng độ khác nhau (20%, 30%, 40% và 50%). Tiến hành phản ứng ở công suất 150W trong 2 phút. Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu phản ứng để tiến hành HPLC để x{c định hiệu suất phản ứng. Tạp được hình thành nhiều nhất với dung dịch H2SO4 40%, trong khi dung dịch H2SO4 50%, sau 20 giây nguyên liệu đã bị carbon hóa hoàn toàn. Chọn dung dịch H2SO4 40% để thực hiện phản ứng tổng hợp. Hình 2: Kết quả khảo sát nồng độ acid sulfuric phản ứng 50W 150W Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 525 Khảo sát yếu tố thời gian phản ứng Hình 3: Kết quả khảo sát thời gian phản ứng Cân khoảng 1 g diclofenac vào 5 bình nón 100 ml, thêm vào mỗi bình 10 ml H2SO4 40% tiến hành phản ứng ở công suất 150W lần lượt trong các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 10 phút. Mỗi phản ứng thực hiện 3 lần, trích lấy mẫu phản ứng tiến h|nh HPLC để x{c định hiệu suất phản ứng. Tạp diclofenac được tạo thành nhiều nhất với thời gian 8 phút. Ở thời gian sau 10 phút các tạp khác bắt đầu xuất hiện nhiều. Qui trình tổng hợp tạp A diclofenac Cân khoảng 6g diclofenac vào bình nón 200ml, thêm vào 60 ml dung dịch H2SO4 40%, đặt vào lò vi sóng ở công suất 150W trong 8 phút, hỗn hợp phản ứng tạo th|nh thu được khối dẻo màu vàng (5,4 g). Hiệu suất khoảng 90%. Tinh chế Sắc ký cột (50 x 10 cm), silica gel (60-200 µm), dung môi rửa giải ethyl acetat, kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi ethyl acetat - methanol (8:2), phát hiện vết bằng đèn UV 254 nm, đối chiếu với vết của chuẩn tạp A diclofenac của USP, thu được ph}n đoạn có chứa tạp A (3,2 g) ký hiệu DFA. Hiệu suất của toàn bộ quá trình tổng hợp và tinh chế là 53,3%. Xác định cấu trúc Tính chất Tinh thể màu trắng, điểm chảy: 251 oC(6). . Phổ IR cho c{c dao động ở 1731cm-1 (nhóm C= O của vòng lactam), 1612 cm-1 (C-N), và 782, 749 cm-1 (C-Cl), ứng với phổ IR của tạp A của diclofenac USP. Phổ ESI-MS của sản phẩm tổng hợp có m/z = 299,9958 [M+Na]+; M phù hợp với công thức phân tử của tạp A: C14H9Cl2NO (M = 278,1338). Phổ 1H-NMR của DFA cho các tín hiệu cộng hưởng của vòng 2,6 diclorophenyl: [H = 7,51ppm (d; 2H; J = 8,0 Hz), H-3’; H-5’+, *H = 7,34 ppm (t; 1H; J = 6,5 Hz và J = 7,0 Hz), H-4’+; Vòng 1,3 dihydro - 2H -indol - 2 on: [H = 7,38 ppm (d; 1H; J = 8,0 Hz), H-9], [H = 7,20 ppm (t; 1H; J = 7,5 Hz và J = 7,5 Hz), H-8], [H = 7,09 ppm (t; 1H; J = Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 526 7,5 Hz và J = 7,5 Hz), H-7], [H = 6,40 ppm (d; 1H; J = 7,5 Hz), H-6] và 2 proton methylen -CH2 ở C-3 có H = 3,78. Phổ 13C-NMR của DFA cho các tín hiệu cộng hưởng:173,6 (C-2); 35,73 (C-3); 124,3 (C-4); 143,3 (C-5); 109,2 (C-6); 129,03 (C-7); 123,05 (C-8); 124,8 (C-9); 135,5 (C-1’); 130,5 (C-2’, C-6’); 130,8 (C-3’, C-5’); 127,9 (C-4’).Từ các kết quả phổ MS, IR, và NMR, khẳng định DF điều chế được là tạp A (1-(2,6-diclorophenyl)-1,3-dihydro-2H-indol-2- on) của diclofenac natri. Xác định độ tinh khiết của tạp A Tính phù hợp của h thống Pha dung dịch tạp A có nồng độ 500 µg/ml. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần. kết quả RSD của các thông số sắc ký đều nhỏ hơn 2%, As trong khoảng 0,8 – 1,5; Rs ≥ 1,5. Như vậy qui trình x{c định độ tinh khiết tạp đạt tính phù hợp hệ thống. Hàm lượng của tạp A Theo điều kiện triển khai HPLC, h|m lượng của tạp A tổng hợp được l| 98,21% được nối từ chuẩn USP số lô LOM 175, hàm lượng 99%, nguyên trạng. Hình 4: Sắc ký đồ của DFA BÀN LUẬN Tạp A của diclofenac natri là sản phẩm đóng vòng của diclofenac dưới tác dụng của nhiệt độ trong môi trường acid, dưới tác dụng của siêu âm hoặc vi sóng tạp A sẽ xuât hiện nhiều hơn. Qui trình tổng hợp đã được tìm điều kiện tối ưu để có hiệu suất tối đa, đồng thời phương pháp tách và tinh chế chất tổng hợp khác với tài liệu, nhanh gọn hơn. Các tác nhân cho phản ứng đóng vòng là các chất dễ tìm, rẻ tiền, máy móc đơn giản. Tạp A là chất kém tan trong nước và tan tốt trong các dung môi hữu cơ như cloroform, ethyl acetat, methanol. Vì vậy thử kết tinh tạp A trong methanol và trong môi trường nước. Nhưng kết tinh thu được vẫn không sạch nên phải tinh chế bằng săc ký cột cổ điển. Pha động để rửa giải tạp A trong sắc lý cột cổ điển sau khi lựa chọn các dung môi khác nhau là ethyl acetat 100%, đây là 1 dung môi khá an toàn. Đối với tạp E, thử nghiệm 2 phản ứng tổng hợp dựa theo nguồn gốc phát sinh và tài liệu về tổng hợp, cả 2 phản ứng hiệu suất đều rất thấp. Hơn nữa, tạp E trên thị trường khá rẻ nên lựa chọn cách mua tạp E về để tinh chế. Tạp E tan trong cloroform, methanol, ethyl acetat, tan chậm trong nước thử tinh chế tạp E bằng các phương pháp kết tinh nhưng không thành công Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 527 nên đã lựa chọn phương pháp tinh chế bằng sắc ký cột cổ điển. Pha động để rửa giải tạp A trong sắc lý cột cổ điển sau khi lựa chọn các dung môi khác nhau là cloroform: methanol (99:1). KẾT LUẬN Từ nguyên liệu đầu natri diclofenac, qua 2 bước đã tổng hợp được 1-(2,6-diclorophenyl)- 1,3-dihydro-2H-indol-2-on còn gọi là tạp A diclofenac. Sản phẩm cuối được chứng minh cấu trúc bằng phương ph{p phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR. H|m lượng của tạp đạt 98,21% khi so sánh với chất chuẩn tạp A USP của diclofenac bằng HPLC. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. British Pharmacopoeia 2014, Diclofenac sodium. Electronic Edition 2. Görög S, (2000), “Identification and Determination of Impurities in Drugs”. Elsevier Science, e ook IS N: 9780080534404. Pages 772. 3. Palomo ME, allesteros MP, Frutos P (1999), “ nalysis of diclofenac sodium and derivatives”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 21, 83 – 94 4. Somashekar PL, Sanjay Pai PN, Rao G (2013), “Synthesis and Characterization of Specified Impurities of ceclofenac”, Chem Sci Trans, 2(3),813-820 5. Tudja P, Khan MI, Mestrovic E, Horvat M, Golja P (2001), “Thermal ehaviour of Diclofenac Sodium: Decomposition and Melting Characteristics”, Chem. Pharm. Bull, 49(10) 1245— 1250 6. United States Pharmacopoeia 37 (2014) Electronic Edition, Diclorofenac sodium. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018