Tổng hợp và khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 5-Methylbenzimidazol-2-thion

Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 8 TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 5-METHYLBENZIMIDAZOL-2-THION Trần Quang Phương Nam*, Ngô Duy Túy Hà**, Trương Phương*, Nguyễn Ngọc Đan Thùy* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Nghiên cứu tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học hướng tác động kháng ung thư đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Để tạo cơ sở cho việc phát triển thuốc ung thư mới có hoạt tính cao, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới từ khung 5-methylbenzimidazol-2-thion và thử hoạt tính gây độc tế bào của chúng. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp 5-methylbenzimidazol-2-thion bằng phương pháp Thiocarbanilid từ nguyên liệu chính là 5-methyl orthophenylendiamin và CS2, alkyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion ở vị trí S trong môi trường pyridin; khi sử dụng triethylamin để alkyl hóa, sản phẩm tạo ra có 2 nhóm thế trên 2 N hoặc 1 trên N và 1 nhóm thế trên S. Acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion tại vị trí N. Xác định cấu trúc bằng các phổ UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR và MS. Thử tác dụng độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư HEPG2, RD và MDA và 1 dòng tế bào thường LLCPK1. Kết quả: Tổng hợp được và xác định cấu trúc của mười ba hợp chất mới (1-13) là những dẫn chất của 5-methylbenzimidazol-2-thion. Kết quả nghiên cứu này cho thấy 6 dẫn chất có ảnh hưởng tốt đến HEPG2 (các chất 3,4,5,6,7 và 10); 7 dẫn chất có hoạt tính tốt trên MDA và RD (các chất 3,4,5,6,7,10 và 12). Hơn nữa, tất cả chúng đều có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường được thử nghiệm. Kết luận: Phản ứng alkyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion với các alkyl halid trong dung môi pyridin hay trong triethylamin thu được sản phẩm tinh khiết, chỉ có 1 trường hợp có đồng phân vị trí, hiệu suất tương đối cao, dễ thực hiện. Phản ứng acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion với acyl halid hay anhydrid acetic trong dung môi pyridin thu được sản phẩm dễ dàng. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Các chất thử nghiệm có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường nhưng 6-7/13 chất thử nghiệm có ức chế tốt các dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Từ khóa: 5-methylbenzimidazol-2-thion, dẫn chất acyl, dẫn chất alkyl, độc tính tế bào, tác dụng độc tính tế bào ABSTRACT SYNTHESIS AND EVALUATION THE CYTOTOXIC EFFECTS OF 5-METHYLBENZIMIDAZOLE-2-THIONE’S DERIVATIVES Tran Quang Phuong Nam, Ngo Duy Tuy Ha, Truong Phuong, Nguyen Ngoc Dan Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 8 - 16 Background: Presently, many scientists are interested in synthesis and screening of biological activity towards anti-cancer effects of new compounds. In order to create a basis for the development of new highly active cancer drugs, we selected the synthesis of new derivatives from the 5-methylbenzimidazole-2-thione framework and testing their cytotoxic activity. Materials and methods: The 5-methylbenzimidazole-2-thione was synthesized from main materials of 5-methylorthophenylenediamine and CS2 with thiocarbanilide method. The 5-methylbenzimidazole-2-thione was alkylated at S position in pyridine. When triethylamine was used to alkylize the products, the *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Trường Cao đẳng Y Tế Lâm Đồng Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trương Phương ĐT: 0938525157 Email: nguyetphuong1234@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 9 derivatives were produced with alkyl group attacted on N1 and N3 positions or one on N and another on S positions. On the other hand, 5-methylbenzimidazole-2-thione was acylated at N position. All of new structures were determined by UV, IR, 1H-NMR, 13C-NMR and MS spectra. The antitumor effects were tested on HEPG2, RD and MDA cancer cell lines and LLCPK1 normal cell line. Results: Thirteen new compounds (1-13) of 5-methylbenzimidazole-2-thione were synthesized and determined their structures. The result showed that 6 derivatives have good influences on HEPG2 (substances 3,4,5,6,7 and 10); 7 derivatives have good activitives on MDA and RD (substances 3,4,5,6,7,10 and 12). Moreover, all of them have weak effects on a normal cell line. Conclusion: New derivatives were produced when 5-methylbenzimidazole-2-thione was alkylated with alkyl halides in pyridine solvent or triethylamine. On the other way, this substance was acylated with acyl halide or anhydride acetic in pyridine solvent. The cytotoxic activity does not appear evenly in the derivatives. The tested substances have weak effects on a normal cell line but from 6 to 7 per 13 of them have good inhibition of tested cancer cell lines. Key words: 5-methylbenzimidazol-2-thione, acyl derivatives, alkyl derivatives, cytotoxicity, cytotoxic effects ĐẶT VẤN ĐỀ Việc nghiên cứu tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học hướng tác động kháng ung thư đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Trong khi cấu trúc benzimidazol-2-thion có mặt trong nhiều hoạt chất có tác dụng dược lý khác nhau được ứng dụng rộng rãi trong ngành Dược như diệt ký sinh trùng(1) chống động kinh(2), kháng nấm, kháng khuẩn(3) và đặc biệt là tác dụng gây độc tế bào ung thư(4,5). Để tạo cơ sở cho việc phát triển thuốc ung thư mới có hoạt tính cao, chúng tôi lựa chọn nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất mới từ khung 5- methylbenzimidazol-2-thion và thử hoạt tính gây độc tế bào của chúng. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu 3,4-diaminotoluen, carbon disulfid, allyl bromid, benzyl clorid, 2-clorobenzyl clorid, 2-methylbenzyl clorid, 2-fluorobenzyl clorid, 4-fluorobenzyl clorid, benzoyl clorid, anhydrid acetic, kali hydroxyd tinh thể, than hoạt tính, dung dịch acid hydrocloric đậm đặc... Bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 của Merck. Các hệ dung môi: Hệ (A): toluen: ethyl acetat (4:1); Hệ (B): hexan: aceton (2:1); Hệ (C): cloroform: ethyl acetat (7:3). Nguyên liệu thử độc tế bào Dòng tế bào HEPG2 (tế bào ung thư gan người), RD (tế bào ung thư cơ vân người), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú người), LLC-PK1 (tế bào thận heo) được hoạt hóa và nuôi cấy tại viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Hóa chất Môi trường EMEM, môi trường DMEM, huyết thanh bào thai bê (FCS), trypsin-EDTA; L-glutamin, penicilin-streptomycin (Gibco, Mỹ); PBS, trypan blue, MTT (Sigma-Aldrich, Mỹ); isopropanol (Merck, Đức). Nuôi cấy tế bào Tế bào HEPG2, LLC-PK1 nuôi trong môi trường EMEM; tế bào RD, MDA-MB-231 nuôi trong môi trường DMEM; bổ sung vào môi trường nuôi cấy 10% FCS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/ml penicilin, 100 µg/ml streptomycin, ủ ở 37 oC, 5% CO2. Khi đạt độ phủ 70 - 80%, thu và đếm tế bào sống với trypan blue, cấy chuyển hoặc chia vào đĩa nuôi cấy. Xử lý tế bào Dung dịch mẹ của các mẫu thử được pha trong DMSO chiếu UV và bảo quản ở -20 oC. Tế bào được chia vào các đĩa nuôi cấy 96 giếng ở mật độ thích hợp. Sau khi ủ tế bào 24 giờ ở 37 oC, 5% CO2, xử lý tế bào với các mẫu thử ở nồng độ Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 10 khác nhau (12,5 – 100 µM), nồng độ cuối cùng của DMSO trong môi trường nuôi cấy là 1% (tt/tt). Paclitaxel được dùng làm chất đối chứng dương. Đánh giá tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp MTT Tỷ lệ tế bào sống xác định nhờ hoạt tính của enzym succinat dehydrogenase (SDH) có trong ty thể tế bào sống. SDH chuyển MTT [3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromid)] thành formazan tan trong isopropanol acid hóa tạo dung dịch tím, đo OD ở 570 nm; giá trị OD phản ánh số lượng tế bào sống trong mẫu thử. Dụng cụ và trang thiết bị Tổng hợp và tinh chế sản phẩm: Máy khuấy từ gia nhiệt Stuart SB162, cá từ, bếp nung Alma, máy hút chân không, phễu Buchner, máy cô quay Stuart, cột sắc ký. Kiểm nghiệm sản phẩm: Sắc ký bản mỏng GF254, bình triển khai sắc ký, buồng soi UV VilberLourmat, ống mao quản, máy đo điểm chảy Stuart SMP10; máy đo phổ hồng ngoại IR: FTIR 8201 PC (SHIMADZU); máy đo khối phổ MSQ Plus – Thermo; máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân AV500 Bruker (500 MHz). Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp các chất theo Hình 1 như sau: Hình 1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất alkyl hóa và acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 11 KẾT QUẢ Tổng hợp 5-methylbenzimidazol-2-thion (1) Cho 10 g 3,4-diaminotoluen (0,082 mol) và 1,68 g KOH tinh thể (0,03 mol) vào 50 ml ethanol trong bình cầu đáy tròn dung tích 250 ml. Khuấy trong 15 phút. Thêm 10ml CS2 ( 0,17 mol) vào bình cầu, đun hồi lưu ở 70 – 80 oC trong 8 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc sẽ thấy hỗn hợp rắn lại, để nguội bình phản ứng, thêm 100 ml nước cất, khuấy và lọc lấy tủa. Hòa tủa trong 100 ml cồn nước 1:1, đun nóng rồi lọc nhanh để lấy dịch lọc. Để nguội sẽ thu được tinh thể, lọc lấy tinh thể, sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Thu được 10,34 g sản phẩm. Hiệu suất 76,88%. Chất (1): 5- methylbenzimidazol-2-thion C8H8N2S. P.t.l: 164,23. Tinh thể hình kim màu trắng, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 76,88%. Nhiệt độ nóng chảy: 292 – 293 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,36), B (0,51), C (0,68). UV (λmax) (nm): 316. IR (cm-1): 3105 (ν – NH); 3040 (ν – C–H thơm); 2968 (ν – CH3); 1327 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δ ppm): 12,368 (s, 2H, H1&3), 7,011 (d, J= 8 Hz, 1H, H7), 6.941 (s, 1H, H4), 6,923 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 2,327 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm): 167,77 (C2), 132,43 (C9), 131,58 (C8), 130,16 (C5), 123,12 (C6), 109,54 (C4), 109,04 (C7), 20,88 (C10, CH3). MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C8H9N2S)+ = 165,0486; giá trị đo được là 165,0464. Tổng hợp các dẫn chất alkyl 5- methylbenzimidazol-2-thion (2,3,5,7,9,11) trong pyridin Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g (1) (6,1 mmol), sau đó cho thêm 10ml pyridin vào. Thêm 0,01 mol allyl bromid. Khuấy liên tục trong 24 giờ. Theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng. Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào bình phản ứng 50 ml nước cất, khuấy mạnh và lọc lấy tủa. Tủa thu được sẽ tinh chế lại bằng hỗn hợp cồn nước 1:1. Thu được 0,719g sản phẩm. Hiệu suất 57,86%. Các phản ứng với những dẫn chất benzyl clorid tiến hành tương tự như phản ứng với allyl bromid. Hiệu suất phản ứng dao động từ 30 – 50% Chất (2): 2-(allylthio)-5-methylbenzimidazol C11H12N2S. P.t.l: 204,29. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 57,86%. Nhiệt độ nóng chảy: 127 – 128 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,59), B (0,63), C (0,87). UV (λmax) (nm): 300, 291. IR (cm-1): 3063 (ν – C–H thơm); 2986(ν – CH3); 1624 (ν – C=C thơm); 1271 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,357 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 7,272(s, 1H, H4), 7,035 (dd, J1= 8 Hz, J2= 1 Hz, 1H, H7), 5,980 (m, J1= 7 Hz, J2= 10 Hz, J3= 17 Hz, 1H, H12), 5,242 (dd, J1= 1 Hz, J2= 17 Hz, 1H, H13a), 5,082 (d, J= 10 Hz, 1H, H13b), 3,864 (d, J= 7 Hz, 2H, H11), 2,438 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 150,22 (C2), 141,18 (C9), 134,50 (C8 & C12), 133,42 (C5), 124,83 (C6), 118,64 (C13), 114,53 (C4&C7), 36,52 (C11), 21,61 (C10). MS: m/z 205 (MH)+. Chất (3): 2-(benzylthio)-5-methylbenzimidazol C15H14N2S. P.t.l: 254,35. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 62,39%. Nhiệt độ nóng chảy: 143 – 145 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,74), B (0,52), C (0,88). UV (λmax) (nm): 299. IR (cm-1): 3036 (ν – C–H thơm); 1626 (ν – C=C thơm); 1275 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,356 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 7,332 (m, 2H, H2'&H6'), 7,265 (m, 2H, H3’&H5'), 7,224 (m, 2H, H4 &H4'), 7,032 (dd, J1= 1 Hz, J2= 8 Hz, 1H, H7), 4,449 (s, 2H, H11), 2,432 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 150,40 (C2), 138,35 (C8&C9), 133,45 (C1’), 129,86 (C3'&C5'), 129,60 (C2'&C6'), 128,58 (C5 & C4’), 124,88 (C6), 114,50 (C4&C7), 38,21 (C11), 21,62 (C10). MS: m/z 253 (MH)-. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 12 Chất (5): 2-((2’-clorobenzyl) thio)-5- methylbenzimidazol C15H13ClN2S. P.t.l: 288,79. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 65,77%. Nhiệt độ nóng chảy: 131 – 133 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,75), B (0,63), C (0,91). UV (λmax) (nm): 297, 292. IR (cm-1): 3057 (ν – C– Hthơm); 2984 (ν – CH3); 1628 (ν – C=C thơm); 1277 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,368 (m, J1= 2 Hz, J2= 9 Hz, 2H, H6&H3'), 7,327 (dd, J1= 2 Hz, J2= 8 Hz, 1H, H6'), 7,268 (s, 1H, H4), 7,212 (td, J1= 2 Hz, J2= 8 Hz, 1H, H4'), 7,133 (td, J1= 2 Hz, J2= 8 Hz, 1H, H5'), 7,033 (ddd, J1= 1 Hz, J2= 2 Hz, J3= 9 Hz, 1H, H4), 4,551 (s, 2H, H11), 2,427 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 149,82 (C2), 136,16 (C9), 135,13 (C8), 133,53 (C5), 131,95 (C1' & C2’), 130,74 (C3' & C5’), 130,34 (C4' & C6’), 128,17 (C4), 124,97 (C6), 114,73 (C7), 36,20 (C11), 21,63 (C10). MS: m/z 287 (MH)-. Chất (7): 2-(2’-methylbenzyl) thio)-5- methylbenzimidazol C16H16N2S. P.t.l: 268,38. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 55,43%. Nhiệt độ nóng chảy: 123 - 125 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,70), B (0,62), C (0,77). UV (λmax) (nm): 298, 293. IR (cm-1): 2981 (ν – CH3); 1626 (ν – C=C thơm); 1277 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,366 (br, 1H, H6), 7,273 (br, 1H, H4), 7,205 (d, J= 8 Hz, 1H, H3'), 7,151 (m, 2H, H5'&H6'), 7,045 (m, 2H, H7&H4'), 4,476 (s, 2H, H11), 2,435 (s, 3H, H10), 2,414 (s, 3H, H12). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 138,06 (C2), 135,64 (C1’&C9), 131,56 (C2’&C5), 130,80 (C3’&C6’), 129, 04 (C4’&C5’), 127,19 (C4 & C6), 124,89 (C7 & C8), 36,59 (C11), 21,63 (C10), 19,17 (C12). MS: m/z 267 (MH)-. Chất (9): 2-(2’-fluorobenzyl) thio-5- methylbenzimidazol 2-(2’-fluorobenzyl)thio-5-methyl benzimidazol: C15H13N2SF. P.t.l: 272,34. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 53,69%. Nhiệt độ nóng chảy: 114 – 115 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,74), B (0,60), C (0,92). UV (λmax) (nm): 298. IR (cm-1): 2984 (ν – CH3); 2646 (ν – S– H); 1614 (ν – C=C thơm); 1279 (ν – C–N thơm). 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,366 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 7,316 (m, 1H, H3'), 7,264 (m, 2H, H7 & H4'), 7,074 (m, 1H, H5'), 7,039 (m, 2H, H4& H6'), 4,484 (s, 2H, H11), 2,441 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 163,20 (C2’), 161, 24 (C2), 149,77 (C9), 132,04 (C8), 130,81 (C5), 130,75 (C7), 125,67 (C1'), 125, 56 (C6), 125,39 (C6'), 125,36 (C5'), 124,98 (C3'), 116,48 (C4’), 116,31 (C4), 31,64 (C11), 21,62 (C10). MS: m/z 273 (MH)+. Chất (11): 2-((4-fluorobenzyl) thio)-5- methylbenzimidazol C15H13N2SF. P.t.l: 272,34. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol, DMSO. Hiệu suất: 67,73%. Nhiệt độ nóng chảy: 114 – 115 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,61), B (0,59), C (0,83). UV (λmax) (nm): 298, 244. IR (cm-1): 2924 (ν – CH3); 1598 (ν – C=C thơm); 1277 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,353 (m, 3H, H6&H2'&H6'), 7,272 (s, 1H, H4), 7,045 (dd, J1= 1 Hz, J2= 9 Hz, 1H, H7), 6,988 (m, 2H, H3'&H5'), 4,442 (s, 2H, H11), 2,441 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 164,60 (C4’), 162,65 (C2), 150,07 (C9), 134,61 (C8), 134,59 (C6), 131,78 (C5), 131,72 (C2'&C6'), 124,95 (C5), 116,36 (C3'&C5'), 116,18 (C4&C7), 37,40 (C11), 21,62 (C10). MS: m/z 271 (MH)-. Kết quả trên cho thấy các sản phẩm (2,3,5,7,9,11) có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến. Tổng hợp các dẫn chất dialkyl 5- methylbenzimidazol-2-thion (4,8,10 và 6A, 6B) trong triethylamin Tiến hành Trong một bình cầu đáy tròn, cho vào 1 g (1) (6,1 mmol), thêm vào 20 ml triethylamin, thêm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 13 0,02 mol các dẫn chất benzyl chlorid tương ứng. Đun hồi lưu liên tục 6 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, thu tủa. Hòa tủa trong 50 ml cồn tuyệt đối. Đun sôi cồn để kết tủa tan hoàn toàn. Để nguội và làm lạnh sẽ thu được kết tủa. Lọc lấy tủa, sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ 60 oC. Hiệu suất của phản ứng dao động từ 30-40%. Tính chất vật lý Các sản phẩm (4,8,10 và 6A, 6B) đều là bột màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt, tan tốt trong cloroform, aceton, ít tan trong ethanol, không tan trong nước. Chất (4): 1,3-dibenzyl-5-methylbenzimidazol- 2-thion C22H20N2S. P.t.l: 344,48. Dạng bột màu vàng nhạt, không tan trong nước, tan trong cloroform, DMSO. Hiệu suất: 31,19%. Nhiệt độ nóng chảy: 136 – 137 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,89), B (0,74), C (0,94). UV (λmax) (nm): 298, 266. IR (cm-1): 3032 (ν – C–H thơm); 2922 (ν – CH3); 1605 (ν – C=C thơm); 1222 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,350 (m, 4H, H2’&H6’&H2’’&H6’’), 7,309 (m, 4H, H3’&H5’&H3’’&H5’’), 7,255 (m, 2H, H4’&H4’’), 6,929 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 6,898 (d, J= 8 Hz, 1H, H7), 6,861 (s, 1H, H4), 5,605 (s, 4H, H11&H12), 2,315 (s, 3H, H10). Phổ 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 171,20 (C2), 135,78 (C9), 135,26 (C5), 132,29 (C6), 130,09 (C3’ &C3’’), 128,80 (C5’), 128,78 (C5’’), 127,78 (C2’ & C2’’), 127,77 (C6’ & C6’’), 127,50 (C1’ & C1’’), 127,43 (C4’ & C4’’), 124,09 (C8), 109,97 (C4), 109,39 (C7), 48,64 (C11, (CH2)), 48,50 (C12 – (CH2)), 21,46 (C10 (CH3)). MS: m/z 345 (MH)+. Chất (8): 1,3-bis(2’-methylbenzyl)-5- methylbenzimidazol-2-thion C24H24N2S. P.t.l: 372,53. Dạng bột màu nâu nhạt, không tan trong nước, tan trong cloroform, DMSO. Hiệu suất: 37,96%. Nhiệt độ nóng chảy: 180 – 181 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,93), B (0,80), C (0,92). UV (λmax) (nm): 317, 263. IR (cm-1): 3061 (ν – C–H thơm); 2920 (ν – CH3); 1603 (ν – C=C thơm); 1285 (ν – C–N thơm). 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,192 (m, 4H, Har), 7,087 (t, 2H, Har), 6,885 (d, 1H, Har), 6,849 (d, 1H, Har), 6,795 (t, 2H, Har), 6,734 (s, 1H, Har), 5,612 (d, 4H, H11&H12), 2,463 (s, 3H, H13), 2,434 (s, 3H, H14), 2,297 (s, 3H, H10). 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 170,87 (C=S), 135,58 (Car), 135,44 (Car), 133,30 (Car), 133,27 (Car), 133,24 (Car), 132,46 (Car), 130,61 (Car), 130,58 (Car), 130,26 (Car), 127,55 (Car), 127,47 (Car), 126,37 (Car), 126,32 (Car), 126,30 (Car), 125,99 (Car), 124,10 (Car), 110,04 (Car), 109,50 (Car), 47,00 (CH2), 46,73 (CH2), 21,43 (CH3), 19,42 (CH3), 19,40 (CH3). MS: Giá trị tính toán cho [M+H]+ (C24H25N2S) + = 373,1738; giá trị đo được là 373,2174. Chất (10): 1,3-bis(2’-fluorobenzyl) -5- methylbenzimidazol-2-thion C22H18F2N2S. P.t.l: 380,46. Dạng bột màu vàng nhạt, không tan trong nước, tan trong cloroform, DMSO. Hiệu suất: 30,82%. Nhiệt độ nóng chảy: 128 – 129 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,95), B (0,77), C (0,96). UV (λmax) (nm): 317, 266. IR (cm-1): 3032 (ν – C–H thơm); 2922 (ν – CH3); 1616 (ν – C=C thơm); 1281 (ν – C–N thơm). Phổ 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,339 (m, 2H, Har), 7,247 (m, 2H, Har), 7,101 (m, 2H, Har), 7,036 (m, 3H, Har), 6,951 (d, 2H, Har), 5,672 (d, 4H, H11&H12), 2,348 (s, 3H, H10). 13C- NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 171,00 (C=S), 161,37 (C2’), 159,41 (C2’’), 133,58 (Car), 132,00 (Car), 129,82 (Car), 129,78 (Car), 129,75 (Car), 129,64 (Car), 129,57 (Car), 129,51 (Car), 124,59 (Car), 124,35 (Car), 122,84 (Car), 115,50 (Car), 115,33 (Car), 109,75 (Car), 109,15 (Car), 109,13 (Car), 41,63 (CH2), 41,53 (CH2), 21,47 (CH3). MS: m/z 381 (MH)+. Chất (6A, 6B): Hỗn hợp giữa 1-(2’- clorobenzyl)-2((2’’-clorobenzyl)thio)-5- methylbenzimidazol (6A) và 2((2’- clorobenzyl)thio)-3-(2’’-clorobenzyl)- 5- methylbenzimidazol (6B) C22H18Cl2N2S. P.t.l: 413,36. Dạng bột màu vàng nâu, không tan trong nước, tan trong Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 14 cloroform, DMSO. Hiệu suất: 33,56%. Nhiệt độ nóng chảy: 137 – 138 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,88), B (0,74), C (0,92). UV (λmax) (nm): 318. IR (cm-1): 3057 (ν – C–H thơm); 2945 (ν – CH3); 1615 (ν – C=C thơm); 1279 (ν – C–N thơm). 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,648 (d, J= 8 Hz, 1H, Har), 7,567 (s, 1H, Har), 7,464 (m, 2H, Har), 7,369 (m, 2H, Har), 7,331 (d, J= 8 Hz, 2H, Har), 7,167 (m, 4H, Har), 7,133 (m, 2H, Har), 7,076 (m, 1H, Har), 6,973 (m, 4H, Har), 6,863 (s, 1H, Har), 6,425 (m, 2H, Har), 5,265 (s, 4H, CH2), 4,706 (d, 4H, CH2), 2,456 (s, 3H, CH3), 2,384 (s, 3H, CH3). 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 151,21 (C2), 150,71 (C2), 143,81 (Car), 141,68 (Car), 136,35 (Car), 134,91 (Car), 134,86 (Car), 134,36 (Car), 134,20 (Car), 133,17 (Car), 133,14 (Car), 132,61 (Car), 132,33 (Car), 132,27 (Car), 132,09 (Car), 131,26 (Car), 129,70 (Car), 129,57 (Car), 129,15 (Car), 128,90 (Car), 128.87 (Car), 127,26 (Car), 127,23 (Car), 127,09 (Car), 126,95 (Car), 123,90 (Car), 118,61 (Car), 118,21 (Car), 109,25 (Car), 108,84 (Car), 45,06 (CH2), 44,92 (CH2), 35,39 (CH2), 35,36 (CH2), 21,74 (CH3), 21,56 (CH3). MS: m/z 413 (MH)+. Kết quả trên cho thấy các sản phẩm (4), (8), (10) có cấu trúc phù hợp với cấu trúc dự kiến (6A, 6B) là một hỗn hợp đồng phân có Rf trùng nhau, khảo sát trên nhiều hệ dung môi, tạm thời chưa tách được. Tổng hợp các dẫn chất acyl 5- methylbenzimidazol-2-thion (12A, 12B và 13) trong pyridin Cho 1 g 5-methylbenzimidazol-2-thion (6,1 mmol) cùng với 10ml pyridin (đã được làm khan) vào một bình cầu đáy tròn 100ml. Thêm vào bình cầu 2 ml anhydrid acetic (0,021 mol). Đun hồi lưu ở 110-115 oC trong 4 giờ. Sau khi phản ứng kết thúc, để nguội bình phản ứng rồi thêm 100 ml nước cất, khuấy và lọc lấy tủa. Hòa tủa trong 30 ml cồn nước 1:1, đun nóng rồi lọc nhanh để lấy dịch. Để nguội sẽ thu được tinh thể sản phẩm, lọc lấy tinh thể, sấy khô sản phẩm ở 60 oC. Thu được 0,27 g sản phẩm. Hiệu suất 21,29%. Hình 2. (12A): 1-acetyl-5-methylbenzimidazol-2-thion và (12B): 3-acetyl-5-methylbenzimidazol-2-thion Chất (12A): 1-acetyl-5-methylbenzimidazol- 2-thion và (12B): 3-acetyl-5- methylbenzimidazol-2-thion C10H10N2OS. P.t.l: 206,26. Dạng bột màu nâu, không tan trong nước, tan tốt trong ethanol, methanol, cloroform, aceton, DMSO. Hiệu suất: 21,29%. Nhiệt độ nóng chảy: 186 – 188 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,73), B (0,60), C (0,92). UV (λmax) (nm): 315. IR (cm-1): 3186 (ν – NH); 3039,81; 2974 (ν – CH3); 1686 (ν – C=O); 1380 (ν – C–N thơm). 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): (Chất 12A): 10,673 (br, 1H, N- H), 8,042 (d, J= 8 Hz, 1H, H7), 7,049 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 6,973 (s, 1H, H4), 3,110 (s, 3H, H12), 2,409 (s, 3H, H10) và (Chất 12B): 10,673 (br, 1H, N-H), 8,042 (d, 1H, H7), 7,098 (d, J= 8 Hz, 1H, H4), 7,049 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 3,119 (s, 3H, H12), 2,424 (s, 3H, H10) . 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): (Chất 12A): 172,14 (C11), 170,32 (C2), 135,98 (C8), 131,60 (C9), 129,40 (C5), 126,47 (C6), 116,74 (C4), 109,38 (C7), 28,43 (C12), 21,67 (C10) và (Chất 12B): 171,92 (C11), 170,32 (C2), 134,45 (C9), 130,51 (C8), 128,27 (C6), 125,22 (C5), 116,15 (C7), 108,71 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 15 (C4), 28,36 (C12), 21,35 (C10). MS: m/z 229 (MNa)+. Việc lấy tích phân từng peak cho thấy tỷ lệ giữa 2 đồng phân 12A/12B là 60% : 40%. Tiến hành tương tự, thay anhydric acetic bằng benzoyl clorid, được sản phẩm (13). (13): 1,3-dibenzoyl-5-methylbenzimidazol -2-thion C22H16N2O2S. P.t.l: 372,44. Dạng bột màu vàng, không tan trong nước, tan tốt trong ethanol, methanol, cloroform, aceton, DMSO. Hiệu suất: 21,60%. Nhiệt độ nóng chảy: 194 – 195 oC. Sắc ký lớp mỏng: Rf (hệ dung môi): A (0,93), B (0,71), C (0,94). UV (λmax) (nm): 303, 263. IR (cm-1): 3061 (ν – C–H thơm); 2916 (ν – CH3); 1705 (ν – C=O); 1304 (ν – C–N thơm). 1H-NMR (500 MHz, MeOD, δ ppm): 7,907 (m, 4H, H2’&H6’&H2’’&H6’’), 7,636 (m, 2H, H4’&H4’’), 7,490 (m, 4H, H3’&H5’&H3’’&H5’’), 7,244 (d, J= 8 Hz, 1H, H7), 7,174 (s, 1H, H4), 7,090 (d, J= 8 Hz, 1H, H6), 2,404 (s, 3H, H10). 13C-NMR (125 MHz, MeOD, δ ppm): 170,08 (C2), 168,97 (C11), 168,88 (C12), 135,43 (C5), 134,56 (C1’), 134,43 (C1’’), 132,45 (C4’), 132,37 (C4’’), 131,62 (C9), 130,75 (C3’&C5;), 130,68 (C3’’&C5’’), 129,52 (C8), 128,90 (C2’&C6’), 128,85 (C2’’&C6’’), 125,86 (C6), 112,05 (C7), 111,69 (C4), 21,48 (C10). MS: m/z 373 (MH)+. Hình 3. 1,3-dibenzoyl-5-methylbenzimidazol-2-thion (13) Bảng 1. Kết quả thử tính gây độc tế bào TB UNG THƯ TB THƯỜNG HEPG2 RD MDA LLCPK1 Mẫu IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD IC50 (µM) SD (1) > 100 > 100 > 100 > 100 (2) > 100 > 100 > 100 > 100 (3) 82.05 2.76 37,89 1,35 89,19 0,58 > 100 (4) 43.14 1.86 30,96 1,50 75,29 0,99 > 100 (5) 35.04 0.79 20,67 1,57 58,50 2,90 > 100 (6) 84.64 2.15 56,16 1,66 > 100 > 100 (7) 47.90 0.25 22,20 1,56 90,67 1,18 > 100 (8) > 100 > 100 > 100 > 100 (9) > 100 > 100 > 100 > 100 (10) 31.05 0.44 36,31 1.41 40,10 0.91 > 100 (11) > 100 > 100 > 100 > 100 (12) > 100 27,42 1.83 > 100 > 100 (13) > 100 > 100 > 100 > 100 BÀN LUẬN Phản ứng tạo 5-methylbenzimidazol-2-thion theo phương pháp thiocarbanilid dễ thực hiện, cho sản phẩm tinh khiết, hiệu suất cao. Đây là một trong những phương pháp tối ưu để có thể những hợp chất chứa dị vòng benzimidazol-2- thion. Tuy nhiên việc thực hiện phản ứng với CS2 phải cẩn thận do CS2 rất dễ cháy nổ. Phản ứng alkyl hóa 5-methylbenzimidazol- 2-thion với các alkyl halid trong dung môi pyridin hay trong triethylamin thu được sản phẩm tinh khiết, chỉ có 1 trường hợp có đồng Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 16 phân vị trí, hiệu suất tương đối cao, dễ thực hiện. Điều này giúp việc nghiên cứu tổng hợp thêm nhiều hoạt chất mới với những alkyl halid khác sẽ trở nên dễ dàng hơn. Phản ứng acyl hóa 5-methylbenzimidazol-2-thion với acyl halid hay anhydrid trong dung môi pyridin thu được sản phẩm dễ dàng. Tuy nhiên hiệu suất của phản ứng còn thấp, nên nghiên cứu thêm những dung môi phản ứng khác để giúp phản ứng đạt hiệu suất cao. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Hoạt tính gây độc tế bào không đều trong các dẫn chất. Đối với dòng tế bào ung thư HEPG2 có 6 chất có tác dụng khá tốt là (3), (4), (5), (6), (7), (10). Dòng tế bào RD và MDA ngoài bị ức chế bởi 6 chất trên, còn bị chất (12) ức chế. Các chất thử nghiệm có tác dụng yếu trên dòng tế bào thường. KẾT LUẬN Trong lúc phản ứng alkyl hóa 5- methylbenzimidazol-2-thion với các alkyl halid xảy ra trong dung môi pyridin hay triethylamin cho hiệu xuất thấp thì phản ứng acyl hóa 5- methylbenzimidazol-2-thion thu được sản phẩm dễ dàng. Tất cả các sản phẩm thế alkyl 1:1 đều được thế trên S, điều này cho thấy vị trí S sẽ ưu tiên gắn nhóm thế alkyl hơn vị trí N. Trong lúc các dòng tế bào ung thư bị ức chế bởi từ 6 đến 7 dẫn chất tổng hợp thì tất cả các chất này chỉ thể hiện tác dụng yếu lên dòng tế bào thường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kelley JM, Elliott TP, Beddoe T, Anderson G, Skuce P, Spithill TW (2016). Current threat of triclabendazole resistance in Fasciola hepatica. Trends in Parasitology, 32(6):458-469. 2. Shingalapur RV, Hosamani KM, Keri RS, Hugar MH (2010). Derivatives of benzimidazole pharmacophore: Synthesis, anticonvulsant, antidiabetic and DNA cleavage studies. European Journal of Medicinal Chemistry, 45(5):1753-1759. 3. Gurrala S, Babu YR, Rao GV, Latha BM (2011). Symmetrical coupling of 2-mercapto benzimidazole derivatives and their antimicrobial activity. Int J Pharma Pharma Sci, 3(2):217-220. 4. Pérez-Villanueva J, Hernández-Campos, Yépez-Mulia, Méndez-Cuesta C, Méndez-Lucio O, Hernández-Luis F, Castillo R (2013). Synthesis and antiprotozoal activity of novel 2-{[2-(1H-imidazol-1-yl) ethyl] sulfanyl}-1Hbenzimidazole derivatives. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 23(14):4221-4224. 5. Xiang P, Zhou T, Wang L, Sun CY, Hu J, Zhao YL, Yang L (2012). Novel benzothiazole, benzimidazole and benzoxazole derivatives as potential antitumor agents: synthesis and preliminary in vitro biological evaluation. Molecules, 17(1):873-883. Ngày nhận bài báo: 14/01/2020 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 04/04/2020 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2020