Tổng hợp và thiết lập chất đối chiếu tạp D (Ramipril Diketopiperazin) của Ramipril

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 107 TỔNG HỢP VÀ THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU TẠP D (RAMIPRIL DIKETOPIPERAZIN) CỦA RAMIPRIL Nguyễn Trần Thiên Thanh*, Ngô Thị Thanh Diệp* TÓM TẮT Mở đầu: Ramipril là thuốc ức chế men chuyển angiotensin (ACE) được sử dụng để điều trị bệnh tăng huyết áp, ngăn ngừa đột quỵ, suy tim và các bệnh về thận. Ramipril diketopiperazin (tạp D trong USP 41 và BP 2018) là tạp phải kiểm tra trong cả nguyên liệu lẫn thành phẩm của ramipril. Tuy nhiên, chuẩn tạp này đang được bán với giá rất đắt và chưa có trong ngân hàng chất đối chiếu Việt nam, điều này gây khó khăn, bị động thiết cho công tác kiểm nghiệm nguyên liệu và thành phẩm của ramipril. Tại Việt Nam hiện vẫn chưa có công trình công bố về nghiên cứu tổng hợp tạp D. Do đó, việc tổng hợp tạp D có độ tinh khiết cao làm cơ sở cho việc thiết lập chất đối chiếu là cần thiết. Đối tượng nghiên cứu: Ramipril diketopiperazin (tạp D của ramipril). Phương pháp nghiên cứu: Ramipril diketopiperazin được tổng hợp từ nguyên liệu ramipril bằng phản ứng đóng vòng trong môi trường toluen. Sản phẩm sau khi tổng hợp và tinh chế được xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ nghiệm như IR, MS, NMR, được xác định độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC qui về 100% diện tích pic và được thiết lập chất đối chiếu. Kết quả: Tạp D đã được tổng hợp thành công với hiệu suất toàn qui trình 57,5%. Sản phẩm thu được đạt độ tinh khiết sắc ký trên 99%, đủ điều kiện thiết lập chất đối chiếu. Tạp D có giá trị ấn định là 99,27% tính theo nguyên trạng. Kết luận: Đã tổng hợp và tinh chế thành công tạp D. Tạp D được đánh giá và thiết lập làm chất đối chiếu. Từ khóa: ramipril diketopiperazin, ramipril, tạp D ABSTRACT SYNTHESIS AND ESTABLISHMENT OF RAMIPRIL DIKETOPIPERAZINE (IMPURITY D) REFERENCE STANDARD OF RAMIPRIL Nguyen Tran Thien Thanh, Ngo Thi Thanh Diep * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 107 - 113 Background - Objectives: Ramipril is an angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor, used to treat high blood pressure, heart failure, and diabetic kidney diseases. The BP 2018 and USP 41 require conducting ramipril diketopiperazine (as related compound D) impurity test in ramipril pharmaceutical substances and corresponding finished products. However, this related compound is costly with limited accessibility that affects implementation of this impurity test. There have been no published local studies on chemical synthesis of ramipril diketopiperazine so far. Therefore, this study was conducted with aim of synthesis of ramipril diketopiperazine with high purity that conforms to establish reference standard. Method: Impurity D was synthesized from ramipril by cyclization reaction in toluene media. The obtained product was determined chemical structure from its IR, MS, NMR spectroscopic data, purified by HPLC and established as reference standard. Results: Ramipril diketopiperazine was successfully synthesized with 57.7% yield. By using HPLC-PDA, its chromatographic purity was determined over 99% on the basic of peak area normalization method and *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 0776671588 Email: ngothithanhdiep@ump.edu.vn Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 108 conformed to establish reference standard. The assigned value of impurity D is 99.27%. Conclusion: Ramipril diketopiperazine (impurity D) was successfully synthesized and standardized as reference standard. Key words: ramipril diketopiperazine, ramipril, impurity D ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng huyết áp là tình trạng bệnh lý mãn tính có thể gây ra biến chứng tim mạch như: tai biến mạch máu não, suy tim, bệnh tim mạch vành, nhồi máu cơ tim... Nhóm thuốc đối kháng thụ thể angiotensin, trong đó có ramipril được sử dụng phổ biến để điều trị tăng huyết áp. Theo USP 41(1) và BP 2018(2), ramipril có 4 tạp chất liên quan cần phải được kiểm soát, trong đó, ramipril diketopiperazin (tạp D theo BP 2018 và USP 41) là tạp bắt buộc phải kiểm tra trong nguyên liệu và thành phẩm của ramipril. Hiện nay trong hệ thống ngân hàng chất đối chiếu của Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh và Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương vẫn chưa có chất đối chiếu tạp D. Điều này gây khó khăn trong việc thực hiện công tác kiểm nghiệm tạp chất liên quan của nguyên liệu và chế phẩm chứa ramipril vì phải mua với giá cao từ nước ngoài. Do đó, việc tổng hợp, thiết lập chất đối chiếu tạp D là cần thiết. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Ramipril diketopiperazin (tạp D của ramipril): ethyl(2S)-2-[(3S,5aS,8aS,9aS)-3-methyl-l,4- dioxodecahydro-2H-cyclopenta[4,5]pyrrolo[1,2-a] pyrazin-2-yl]-4-phenyIbutanoat. Nguyên liệu, dung môi, hóa chất, trang thiết bị Nguyên liệu Ramipril đạt tiêu chuẩn Dược điển Mỹ (USP 41). Nhà sản xuất: Trung Quốc. Số lô: 5654 – 19 -122M. Hạn dùng: 4 – 2022. Dung môi, hóa chất: Nước cất, acetonitril (ACN) đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng. Toluen, cloroform (CF), dicloromethan (DCM), ethyl acetat (EA), methanol (MeOH) đạt tiêu chuẩn phân tích. Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Alliance e2695 kết nối với đầu dò Waters PDA 2998, buồng soi UV Vilber Loumart CN-15LC, máy khuấy từ gia nhiệt IKA C-Mag HS 10, máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart SMP-10, tủ sấy Memmert WM500CO, bản mỏng silica gel F254 Merck, máy quang phổ hồng ngoại Shimadzu 00556, máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Advance II. Phương pháp nghiên cứu Tạp D được tổng hợp từ ramipril bằng phản ứng đóng vòng trong môi trường toluen theo Hình 1. Hình 1. Quy trình tổng hợp tạp D của ramipril Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 109 Ramipril nguyên liệu (1g; 2,40 mmol) được cho vào bình cầu dung tích 100 ml, thêm vào bình cầu 50 ml toluen, khuấy từ trong 8 - 12 giờ ở nhiệt độ 120 - 130 oC, sau đó cô quay chân không hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 45 - 50 oC để loại hết dung môi, thu được cắn khô. Sản phẩm được bảo quản lạnh trong chai thủy tinh màu, tránh ánh sáng. Tinh chế Sản phẩm tổng hợp được tinh chế bằng kỹ thuật kết tinh lại trong MeOH ở nhiệt độ thấp, 2 - 8 oC. Thử sơ bộ tinh khiết sản phẩm tinh chế Sản phẩm sau khi tinh chế được sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Sắc ký lớp mỏng: bản mỏng silica gel F254 (Merck). Ba hệ dung môi được sử dụng lần lượt là CF – EA (4:6); DCM – EA (4:6); ACN – H2O (1 : 1). Mẫu thử được pha trong CF với nồng độ 1mg/ml. Xác định cấu trúc Sản phẩm sau khi tinh chế và thử sơ bộ tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ nghiệm IR, MS và NMR, đồng thời so sánh kết quả phổ nghiệm với tài liệu tham khảo. Xác định độ tinh khiết bằng HPLC-PDA Độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế được xác định bằng phương pháp HPLC qui về 100% diện tích pic. Quy trình xác định độ tinh khiết tạp D bằng kỹ thuật HPLC-PDA được thẩm định theo hướng dẫn của ICH(3). Điều kiện sắc kí Cột sắc ký Eurospher II 100- 5 C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm). -Nhiệt độ cột: 40 oC, bước sóng phát hiện 210 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Thời gian sắc ký: 20 phút. Mẫu thử được pha trong ACN – H2O (50:50) với nồng độ 300 ppm. Bảng 1. Chương trình gradient xác định độ tinh khiết của tạp D Thời gian Acetonitril Nước 0 – 5 45 55 5 – 9 90 10 9 – 17 90 10 17 – 19 45 55 19 – 20 45 55 Quy trình chạy sắc kí lỏng với điều kiện trên cũng được sử dụng để xác định giá trị ấn định về độ tinh khiết sắc ký khi thiết lập chất đối chiếu tạp D tại 3 phòng thí nghiệm thuộc Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh. Đánh giá tạp D Tạp D được đánh giá theo các chỉ tiêu cảm quan, độ tan, điểm chảy, định tính bằng các phương pháp phổ nghiệm và độ tinh khiết. Thiết lập chất đối chiếu tạp D Đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ Các mẫu được lấy ngẫu nhiên theo công thức trong đó N là tổng số lọ. Việc xác định độ tinh khiết của tạp D trong từng lọ được tiến hành theo phương pháp HPLC đã xây dựng và thẩm định, mỗi lọ được xác định 2 lần. Việc đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ được dựa trên hướng dẫn của ISO 34:2009(4). Đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm Tạp D sau khi được đóng gói và đánh giá đồng nhất lọ đạt yêu cầu sẽ được lấy mẫu ngẫu nhiên và tiến hành xác định độ tinh khiết tại ba phòng thí nghiệm độc lập. Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu phải đạt GLP hoặc ISO/IEC 17025. Mỗi phòng thí nghiệm sẽ nhận được sáu lọ mẫu ngẫu nhiên kèm theo qui trình phân tích và các tài liệu liên quan. Trước khi phân tích, mỗi phòng thí nghiệm sẽ kiểm tra tính phù hợp của hệ thống với yêu cầu hệ số bất đối của pic tạp D nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và RSD giữa 6 lần đo lặp lại không được quá 2%. Nếu đạt yêu cầu, sẽ tiến hành xác định độ tinh khiết tạp D trên 6 mẫu đã nhận, mỗi mẫu được Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 110 xác định 2 lần. Các phòng thí nghiệm được lựa chọn để gửi mẫu là Khoa Thiết lập chất chuẩn & chất đối chiếu (PTN1), Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm (PTN2), Khoa Nghiên cứu và Phát triển (PTN3) thuộc Viện Kiểm nghiệm thuốc TP. Hồ Chí Minh. Việc đánh giá độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm sẽ được thực hiện bằng phép phân tích phương sai một yếu tố ANOVA. Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo Việc xác định giá trị ấn định trên phiếu kiểm nghiệm tạp D và độ không đảm bảo đo được thực hiện theo hướng dẫn của ISO 13528:2005(5), dựa theo 18 kết quả xác định độ tinh khiết của tạp D tại 3 phòng thí nghiệm. KẾT QUẢ Tổng hợp Sản phẩm sau khi tổng hợp thu được 0,84 g (2,11 mmol) bột có màu trắng ngà, có mùi nhẹ. Hiệu suất tổng hợp là 87,9%. Tinh chế Sản phẩm tổng hợp được đem tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong MeOH. Hiệu suất quá trình tinh chế là 65,4%. Kết quả từ 1,0 g (2,40 mmol) nguyên liệu ramipril tiến hành tổng hợp theo sơ đồ 1 và tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong MeOH thu được khoảng 0,55 g (1,38 mmol) sản phẩm là tinh thể màu trắng. Hiệu suất toàn quá trình tổng hợp và tinh chế là 57,5%. Thử sơ bộ tinh khiết sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế được đo nhiệt độ nóng chảy 3 lần. Khoảng nhiệt độ nóng chảy đo được là 121 – 122 oC, phù hợp với nhiệt độ nóng chảy của tạp D trong tài liệu tham khảo(6). Kết quả khai triển SKLM trên ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau cho thấy sản phẩm chỉ cho một vết duy nhất. Sơ bộ kết luận sản phẩm tinh chế đạt tinh khiết trên SKLM. Xác định cấu trúc sản phẩm tinh chế Phổ MS m/z: [M+H]+ tìm thấy: 399,2132 ([M+H]+ dự kiến: 399,2284). Phổ FT-IR cho các đỉnh hấp thụ phù hợp với công thức cấu tạo của ramipril diketopiperazin: νmax (cm-1) (so sánh LGC Standard(6)): 2944 (2945, C-H sp3), 1735 (1736, -O-C=O), 1659 (1660, -N- C=O), 1415 (1415, C-O-), 1314 (1314, N-C-H), 1250 (1251, C-N amin bậc 3), 750 và 700 (751 và 701, nhân thơm thế mono). Phổ 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 7,29 – 7,83 (m, 2H, H3, H5); 7,16 – 7,27 (m, 3H, H1, H2, H6); 4,25 (m, 1H, H28); 4,21 (m, 1H, H25); 4,04 – 4,18 (m, 3H, H24, H33); 3,99 (m, 1H, H30); 2,59 – 2,65 (m, 2H, H7); 2,17 – 2,32 (m, 4H, H8, H18); 1,47 – 1,71 (m, 7H, H19, H20, H21, H29); 1,29 (d, J = 7, 3H, H27); 1,03 (t, J =7 , 3H, H34); phù hợp dữ liệu phổ 1H NMR trong LGC Standard(6). Phổ 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δ ppm: 169,99 (C26); 168,21 (C12); 166,27 (C15); 141,31 (C4); 128,30 (C2, C6); 128,1 (C3, C5); 125,83 (C1); 62,25 (C16); 60,23 (C9); 59,20 (C14); 56,34 (C33); 55,71 (C11); 39,00 (C17); 33,11 (C7); 31,45 (C21); 31,67 (C18); 30,87 (C19); 29,7 (C8); 23,13 (C20); 15,19 (C27); 13,83 (C34). Từ các kết quả trên có thể kết luận sản phẩm tinh chế chính là tạp D (ramipril diketopiperazin), công thức phân tử: C23H30N2O4. Hình 2. Ramipril diketopiperazin (tạp D của ramipril) Xác định độ tinh khi0ết tạp D bằng HPLC-PDA Quy trình xác định độ tinh khiết tạp D được thẩm định các chỉ tiêu: Tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ chính xác trung gian. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 111 Tính phù hợp hệ thống Tính phù hợp hệ thống được xác định bằng cách tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch tạp D 300 ppm. Kết quả được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống (n = 6) Giá trị thống kê tR (phút) S (µV x giây) T N Trung bình 9,005 4138178 1,3 23398 RSD 0,244 0,764 0 1,551 RSD của các thông số thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) và số đĩa lý thuyết (N) đều nhỏ hơn 2%, hệ số kéo đuôi (T) trong khoảng 0,8 – 1,5, như vậy quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Kết quả khảo sát tính đặc hiệu (Hình 3) cho thấy: sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic có thời gian lưu tương đương với thời gian lưu của pic tạp D trong sắc ký đồ mẫu thử. Sắc ký đồ các mẫu phân hủy bởi HCl 0,1N; NaOH 0,1N; H2O2 3%, sấy 80 oC trong 24h, UV 254 nm và ánh sáng mặt trời có xuất hiện các pic phân hủy, các pic này đều tách hoàn toàn với pic tạp D. Pic tạp D trong sắc ký đồ của các mẫu trước và sau khi phân hủy đều tinh khiết. Như vậy quy trình xác định độ tinh khiết tạp D có tính đặc hiệu cao. Khoảng tuyến tính Phương trình biểu diễn tương quan diện tích pic theo nồng độ phân tích tạp D ở bước sóng 210 nm là ŷ = 19426x, hệ số tương quan R = 0,9999; khoảng tuyến tính 50 – 500 ppm. Hình 3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 B - Khoa học Dược 112 Độ chính xác Độ lặp lại: Tiến hành với 6 mẫu thử tạp D. Kết quả cho thấy quy trình phân tích có độ lặp lại tốt với giá trị độ tinh khiết sắc ký của tạp D trung bình là 99,76%, RSD là 0,59%. Độ chính xác trung gian: Giá trị trung bình độ tinh khiết của tạp D ngày 1 là 99,76%, RSD 0,59%. Giá trị trung bình độ tinh khiết của tạp D ngày 2 là 99,93%, RSD 0,18%. Kết quả giá trị trung bình độ tinh khiết của cả hai ngày (n=12) là 99,81%, RSD 0,16%. Độ sai khác kết quả độ tinh khiết của tạp D giữa hai ngày là 0,17% <2%. Như vậy, quy trình xác định độ tinh khiết tạp D đạt độ chính xác trung gian. Đánh giá tạp D Bảng 3 trình bày kết quả đánh giá tạp D. Với độ tinh khiết trên 99% nên tạp D đủ điều kiện để thiết lập chất đối chiếu. Bảng 3. Kết quả đánh giá tạp D Chỉ tiêu Phương pháp Yêu cầu Tính chất Cảm quan Tinh thể màu trắng, không mùi Độ tan Tan nhiều trong CF, EA, tan ít trong MeOH Điểm chảy Máy đo điểm chảy Stuart SMP – 10 121 – 122 oC Định tính Phổ hồng ngoại FT – IR: νmax cm-1: -O-C=O (1735), –N-C=O (1659), C-N (1250) Phổ khối m/z = 399,2132 [M+H]+ Phổ NMR Dữ liệu phổ 1H-NMRvà 13C- NMR phù hợp cấu trúc tạp D (dữ liệu phổ) Độ tinh khiết sắc ký HPLC ≥ 99,0% tính trên chế phẩm nguyên trạng Thiết lập chất đối chiếu tạp D 500 mg tạp D được đóng thành 50 lọ, mỗi lọ 10 mg và 6 lọ ngẫu nhiên được lấy theo phần mềm Excel. Kết quả xác định tính phù hợp hệ thống tại ba phòng thí nghiệm đều đạt yêu cầu về hệ số bất đối của pic tạp D và RSD của diện tích pic tạp D nên có thể tiếp tục tiến hành xác định độ tinh khiết tạp D. Dựa vào kết quả phân tích ANOVA cho thấy các lọ đóng gói có hàm lượng đồng nhất, điều kiện đóng gói ổn định và phù hợp, kết quả định lượng giữa 3 phòng thí nghiệm khác biệt không có ý nghĩa thống kê, quy trình phân tích có độ lặp lại cao, độ tinh khiết chất phân tích không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đánh giá. Bảng 4 và Bảng 5 minh họa kết quả đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ và độ đồng nhất lọ liên phòng thí nghiệm. Bảng 6 trình bày kết quả xác định giá trị ấn định tạp D. Bảng 4. Kết quả đánh giá độ đồng nhất của quá trình đóng lọ (n=2) Số thứ tự lọ Độ tinh khiết tạp D (%) 29 99,25 27 99,35 8 99,31 16 99,31 18 99,30 14 99,32 Bảng 5. Kết quả đánh giá độ đồng nhất liên phòng thí nghiệm Mẫu Độ tinh khiết tạp D (%) PTN 1 PTN 2 PTN 3 1 99,25 99,21 99,24 2 99,35 99,20 99,26 3 99,31 99,23 99,27 4 99,31 99,20 99,25 5 99,30 99,17 99,30 6 99,32 99,22 99,29 Bảng 6. Kết quả xác định giá trị ấn định tạp D (n=18) Số lần thay đổi Tạp D x* 0 x* 1 x* 2 x* 3 δ = 1,5s* - 0,1 0,084 0,077 x* - δ - 99,15 99,18 99,19 x* + δ - 99,36 99,34 99,35 Trung bình 99,26 99,26 99,27 99,27 Độ lệch s 0,05 0,05 0,05 0,05 x* mới 99,26 99,26 99,27 99,27 s* mới 0,067 0,056 0,052 0,052 Nhận xét: Với tạp D, sau ba lần thay đổi, s* = 0,052 không thay đổi, khi đó x* được chọn là 99,27%. Vậy giá trị ấn định của tạp D là 99,27% và độ không đảm bảo đo: μ = 1,25s*/√p = 0,037. Như vậy tạp D đủ điều kiện để đăng ký chuẩn quốc gia với hàm lượng được xác định là 99,27% tính trên nguyên trạng. Tiến hành lập hồ sơ chất chuẩn, dán nhãn lọ chuẩn và kèm theo phiếu kiểm nghiệm. Bảo quản các lọ chuẩn ở nhiệt độ 2 – 8 oC, tránh ánh sáng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020 Nghiên cứu B - Khoa học Dược 113 BÀN LUẬN Theo tài liệu tham khảo, phản ứng đóng vòng loại nước điều chế tạp D từ nguyên liệu xảy ra trong điều kiện nhiệt độ cao khoảng 120 oC. Do đó, toluen được lựa chọn làm môi trường phản ứng. Trong quá trình tổng hợp tạp D, khi nhiệt độ thấp hơn 100 oC, phản ứng diễn ra kéo dài, tốn thời gian, nguyên liệu không phản ứng hết dẫn đến hiệu suất giảm đi. Vì vậy, để đạt được hiệu suất phản ứng cao nhất, nhiệt độ của phản ứng phải được kiểm soát ở 125 – 130 oC. Toluen là dung môi hữu cơ tương đối dễ bay hơi, tan ít trong nước, không tan trong methanol, cồn, aceton. Sau phản ứng tổng hợp, dễ dàng loại toluen bằng máy cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 oC. Sau khi tinh chế, thu được sản phẩm là tạp D có hiệu suất toàn quá trình tổng hợp và tinh chế là 57,5%. Sản phẩm sau tinh chế có độ tinh khiết cao trên 99% (xác định theo phương pháp HPLC quy về phần trăm diện tích pic). Thực nghiệm cho thấy tạp D có sự nhạy cảm với H2O2, HCl và NaOH, do đó quy trình tổng hợp và tinh chế nên được tiến hành tránh các tác nhân acid, kiềm và oxy hóa để thu được sản phẩm có độ tinh khiết cao. Sau khi tinh chế, sản phẩm nên được bảo quản trong lọ kín, bảo quản lạnh (2 - 8 oC). KẾT LUẬN Từ nguyên liệu là ramipril và các hóa chất sử dụng thông dụng, dễ tìm, nghiên cứu đã tổng hợp được tạp D (ramipril diketopiperazin) bằng quy trình tương đối đơn giản chỉ qua một giai đoạn. Tạp D đã được tổng hợp và tinh chế thành công ở quy mô phòng thí nghiệm, đạt hiệu suất toàn quy trình 57,5%. Sản phẩm thu được có độ tinh khiết trên 99% được thiết lập làm chất đối chiếu với giá trị ấn định 99,27% có thể được sử dụng trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của rampril. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. United States Pharmacopeial Convention (2018). The United States pharmacopeia 2018: USP 41; The national formulary: NF 36, pp.3572-3577. Rockville, United States MD. 2. The British Pharmacopoeia Commission Secretariat of the Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency (MHRA) (2018). British pharmacopoeia, pp.738-739. The Stationery Office, United Kingdom, UK. 3. International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005). ICH Harmonized tripartite guideline, Validation of analytical procedures: test and methodology, pp.1-13. URL: https://pacificbiolabs.com/wp-content/uploads/2017/12/ Q2_R1__Guideline-4.pdf (access on 10/5/2020). 4. ISO Standards (2009) ISO guide 34:2009: General requirements for the competence of reference material producers. URL: https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:guide:34:ed-3:v1:en (access on 10/5/2020). 5. ISO Standards (2005). ISO 13528:2005: Statistical methods for use in proficiency testing by inter-laboratory comparisons, URL: https://www.iso.org/obp/ui/#iso:std:iso:13528:ed-1:v1:en (access on 10/5/2020). 6. LGC Standards (2019). Certificate of analysis: ethyl(2S)-2- [(3S,5aS,8aS,9aS)-3-methyl-l,4-dioxodecahydro-2H- cyclopenta[4,5]pyrrolo[1,2-a]pyrazin-2-yl]-4-phenylbutanoat. URL: https://www.lgcstandards.com/PL/en/Ethyl-2S-2-3S-8aS- 3-Methyl-1-4-dioxooctahydropyrrolo-1-2-a-pyrazin-2-yl-4- phenylbutanoate-Enalapril-Diketopiperazine-/p/MM0010.06 (access on 10/5/2020). Ngày nhận bài báo: 15/05/2020 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/06/2020 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2020