Ứng dụng kỹ thuật multiplex - Pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài. Nếu quá trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra. E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E. coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae sản sinh protein intimin, … Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người. PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh. Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò” 1.2. Mục tiêu - Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò. 1.3. Mục đích - Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E. coli gây ra cho động vật và người. Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Vi khuẩn E. coli 2.1.1. Định nghĩa - Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885. - Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ thống phân loại của Bergey). - E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng 1,5
m x 0,5
m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh Phong, 1996). E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan khác. 2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa - Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2 – 7,4). - E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB). Trên môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thể sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC không lên men đường sorbitol. Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002). - E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn, ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm. - Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt môi trường. - Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - - (biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992). 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K. Theo Jay (2000), E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H. 2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli: - Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC - Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC - Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998). 2.1.5. Phân loại E. coli Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh), E. coli được chia thành 5 nhóm sau: ( STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E. coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) ( EPEC (Enteropathogenic E. coli) ( EAEC (Enteroaggregative E. coli) ( ETEC (Enterotoxigenic E. coli) ( Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy: - EIEC (Enteroinvasive E. coli) - DAEC (Diffusely adherent E. coli) 2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC a. Danh pháp Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này: - Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli (VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu. - Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998). - Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở Mỹ. STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, không phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu tố độc lực khác. Những dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998). b. Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC * Shiga toxin Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt). Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA). Cả hai gen stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST) của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2. Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh ở người. Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994). Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997). Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000). * Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể là heat – stable enterotoxin (EAST1). Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa mà plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải O157. Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994). Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E. coli có Stx âm tính và Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC. EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết, nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998). Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế bào ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Protein intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement, LEE). Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E. Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper, 1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997). Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác. Dấu hiệu sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc không tạo ra
- glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào việc phát hiện E. coli không lên men sorbitol. O157:H7 và các serotype không phải O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:HNM và O113:H21 (WHO, 1994). c. Nguồn lây nhiễm STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu, dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài động vật quan trọng nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996). STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là nguyên nhân chủ yếu (Keskimaki, 2001). 2.1.5.2. Nhóm EPEC Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em. a. Đặc điểm Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố Shiga. b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V. cholerae bám theo kiểu không chặt, không gây bào mòn vi nhung mao). Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông thường. c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm. Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi. Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mất các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao. 2.1.5.3. Nhóm ETEC a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột (enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF) Độc tố ruột enterotoxin Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT). Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT): Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra. LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tế bào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặt miễn dịch. - LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA). Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Điều này dẫn đến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mô. Kết quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl- một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus). Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998). - LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến bệnh trên người và thú. (2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST) Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm thấy trên transposon. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V. cholerae không phải O1. ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC. - STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa. STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân lập trên người. Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người. Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C). STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và / hoặc ngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy. - STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo, vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào. Không gây ra sự tiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992). Yếu tố định vị (colonization factor – CF) Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor antigens). CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc mảnh mềm. Có ít nhất 20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996). Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh. b. Dịch tễ Dòng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt được khi liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ô nhiễm ETEC trong môi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dòng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước. Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những vùng có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển. Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ô nhiễm. c. Khía cạnh lâm sàng Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50 giờ). Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vài bệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae. Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy. d. Phát hiện và chẩn đoán Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR… 2.2. Kỹ thuật PCR 2.2.1. Nguyên tắc PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in vitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào). Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn (trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverse primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu. Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi. Sự tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập. Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online). 2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation) Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở 94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút. Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing) Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600C tuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút. Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension) Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA. * Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo công thức: Tổng DNA khuếch đại = m*2n Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa * Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vì DNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định. Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức: Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x n : Số chu kỳ 2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2 x : Số bản sao của chuỗi mã hóa * Số chu kỳ của phản ứng PCR - Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng PCR diễn ra qua hai giai đoạn: + Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu. + Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do: Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng. Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt cặp với nhau. Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban đầu là 105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40. Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR
 Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR - DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại. - Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung với trình thự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. - Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng 5’(3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C. - Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA. - Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 2.2.4. Phân tích kết quả PCR Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường. Sự di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và điện thế. Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng
=300 nm) thành vạch màu đỏ da cam. Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder). 2.2.5. Những ứng dụng của PCR 2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản ứng khuếch đại. Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này. Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp luật. PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị giết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó không thể sử dụng các phương pháp phân tích thông thường. Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ sinh vật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA hiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch. Phương pháp PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong các xác ướp. 2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận một cách nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR. Khả năng nhận biết đột biến một cách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền. PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh. Ví dụ: Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng. Từ đó ta có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại. 2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờ enzyme reverse transcriptase. Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác nhau. Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt động của gen cha mẹ. Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đổi trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát. 2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là kỹ thuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến hóa và suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác. Hai sinh vật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown, 1994). 2.2.6. Các hạn chế của phương pháp PCR Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ta không thể quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể ba vấn đề lớn khi sử dụng phương pháp PCR: 2.2.6.1. Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. 2.2.6.2. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quả rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống nghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín trong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị dung cụ…rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện pháp sau: - Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau. - Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng cho các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vào đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng. - Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước. - Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán sao cho 1, 2 lần thao tác. 2.2.6.3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,… Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005 3.1.2. Địa điểm - Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫu phân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An – Bình Dương. - Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. - Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. 3.2. Nội dung - Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò. - Nuôi cấy, phân lập E. coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC. - Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli / nhóm E. coli. - Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA - Ly trích DNA của E. coli phân lập được. - Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E. coli. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Lấy mẫu - Mẫu phân tiêu chảy Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyển Carry Blair. Bảo quản ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối đa 24 giờ). - Mẫu bề mặt thịt Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai có sẵn 50 ml nước peptone đệm. Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ. Bảo quản 4 - 80C, chuyển về phòng thí nghiệm. - Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được vi khuẩn E. coli từ các mẫu đã lấy. Bảng 3.1 Số lượng mẫu STT  Đối tượng mẫu  Số lượng   1  Phân tiêu chảy  Phân bò  8   2   Phân bê  10   3   Phân heo  9   4  Thịt  Bò  9   Tổng cộng  36   3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli 3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy - Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), Sorbitol-SMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT- SMAC), hóa chất thử IMViC… 3.3.2.2. Nuôi cấy và phân lập (1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37oC. Mẫu bề mặt thịt được làm đồng đều trong 125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125 mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002). Ủ 24 giờ ở 37oC, cấy sang môi trường CT-SMAC. Vi khuẩn E. coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E. coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường MAC. (2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli - Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, CT-SMAC. - Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E. coli của mẫu khảo sát. Các nhóm khuẩn lạc như sau: 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM). 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS). 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS). 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT – SMAC (Ký hiệu TC). (3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA). - Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA. Phần khuẩn lạc còn lại của mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml nước cất khử ion vô trùng để ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tổng). (4) Thử sinh hóa - Sau khi nuôi cấy, mỗi khuẩn lạc rời rạc trên được thử phản ứng IMViC để xác định E. coli. 3.2.2.3. Ly trích DNA khuẩn lạc Sau khi đã thu nhóm khuẩn lạc trong ống eppendorf và giữ gốc từng khuẩn lạc riêng lẻ. Mỗi gốc được cấy sang đĩa NA. Sau 24 giờ ở 37oC, thu 6 – 10 khuẩn lạc cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H2O cất khử ion vô trùng. Tiếp theo, chúng tôi tiến hành ly trích DNA đại diện nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ. Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ E. coli của Cerna và ctv (2003) và Botteldoorn và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E. coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau: đun sôi 10 phút rồi chuyển vào tủ -70oC để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm 13000 vòng/phút trong 3 phút. Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu (DNA xét nghiệm). - Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli như sau: Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực 3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E. coli phân lập được bằng multiplex - PCR - Việc phát hiện các gen độc lực của E. coli được thực hiện bằng 2 phản ứng multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler): Multiplex – PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stx1, stx2. Multiplex – PCR2: Phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I. - Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứng dương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát. EDL933 là đối chứng dương với các gen eae, hly, stx1, stx2. H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I. Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú y Toulouse (Pháp). Multiplex – PCR1 * Trình tự các primer sử dụng trong multiplex – PCR1 Gen độc lực  Primer  Trình tự đoạn primer (5’( 3’)  Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp)   stx1  Stx1-F Stx1-R  ATAAATCGCCATTCGTTGACTAC AGAACGCCCACTGAGATCATC  180   stx2  Stx2-F Stx2-R  GGCACTGTCTGAAACTGCTCC TCGCCAGTTATCTGACATTCTG  255   eaeA  Eae-F Eae-R  GACCCGGCACAAGCATAAGC CCACCTGCAGCAACAAGAGG  384   hlyA  HlyA-F HlyA-R  GCATCATCAAGCGTACGTTCC AATGAGCCAAGCTGGTTAAGCT  534   (Dẫn liệu của Paton & Paton, 1998a) * Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR1: PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25oC) 750 mM, (NH4)2SO4 200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200
M; mỗi loại primer 250 mM. Taq – polymerase AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1
l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50
l. * Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR1 (Paton và Paton, 1998a): Bước 1 950C / 1 phút 650C / 2 phút 10 chu kỳ 720C / 1,5 phút Bước 2 950C / 1 phút 640C / 2 phút 1 chu kỳ 720C / 1,5 phút Bước 3 950C / 1 phút 630C / 2 phút 1 chu kỳ 720C / 1,5 phút Bước 4 950C / 1 phút 620C / 2 phút 1 chu kỳ 720C / 1,5 phút Bước 5 950C / 1 phút 610C / 2 phút 1 chu kỳ 720C / 1,5 phút Bước 6 950C / 1 phút 600C / 2 phút 10 chu kỳ 720C / 1,5 phút Bước 7 950C / 1 phút 600C / 2 phút 11 chu kỳ 720C / 2,5 phút Multiplex – PCR2 * Trình tự các đoạn primer được sử dụng trong multiplex – PCR2: Gen độc lực  Primer  Trình tự đoạn primer (5’( 3’)  Kích cỡ đoạn DNA khuếch đại (bp)   lt-I  LT-F LT-R  GGCGACAGATTATACCGTGC CCGAATTCTGTTATATATGTC  696   sta  STa-F STa-R  TTAATAGCACCCGTACAAGCAGG CTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC  147   stb  STb-F STb-R  ATCGCATTTCTTCTTGCATC GGGCGCCAAAGCATGCTCC  172   vt2e  Vt2e-F Vt2e-R  CCTTAACTAAAAGGAATATA CTGGTGGTGTATGATTAATA  230   (Dẫn liệu của Blanco và ctv, 1997) *Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR2: PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25oC) 750 mM, (NH4)2SO4 200 mM, 0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200
M; primer: LTa-F 150 ng, LTa-R 150 ng, STa-F 150 ng, STa-R 150ng, STb-F 45 ng, STb-R 45 ng, Vt2e-F 225 ng, Vt2e-R 225 ng; Taq - polymerase AB gen 0.5UI; DNA khuôn mẫu 3,5
l; nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50
l. * Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai, 2002): 3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di Sau phản ứng multiplex - PCR, 6
l sản phẩm PCR cùng với 1,2
l loading dye được điện di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X. Ladder cũng được điện di đồng thời. Thời gian điện di là 30 – 35 phút ở 100V, 250mA. Sau khi điện di, gel được ngâm trong 30 phút với dung dịch ethidium bromide 1mg/ml TBE. Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UV bằng máy chụp gel với phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad). Các band DNA được xác định bằng cách so với các band của đối chứng dương và ladder. Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR1 EDL933: Đối chứng dương (stx1, stx2, eae, hly). Lad: Thang chuẩn. 1, 2, 3, 4: các mẫu xét nghiệm Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm multiplex - PCR2 H44: Đối chứng dương (lt-I, vt2e, stb). Lad: Thang chuẩn. 1, 2, 3, 4 là các mẫu xét nghiệm PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc phân lập được Sau khi nuôi cấy trên môi trường chọn lọc, phân lập và phân nhóm khuẩn lạc dựa vào kiểu hình trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC và thử phản ứng sinh hóa (IMViC) cho các khuẩn lạc thu được từ 8 mẫu phân bò tiêu chảy, 10 mẫu phân bê tiêu chảy, 9 mẫu phân heo cai sữa tiêu chảy và 9 mẫu bề mặt thịt bò, kết quả lần lượt được trình bày như sau: 4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC Mẫu phân tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên bề mặt thạch MAC. Ủ 37oC trong 24 giờ, quan sát và ghi nhận được chỉ một loại khuẩn lạc màu hồng điển hình của E. coli, được kí hiệu HM. MAC là môi trường chọn lọc cho vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là E. coli. Muối mật có trong môi trường ức chế vi khuẩn Gram dương. Khi vi khuẩn Gram âm lên men lactose thì tạo ra acid làm cho pH của môi trường giảm, môi trường đỏ hơn và khuẩn lạc có màu đỏ (Koneman, 1983). Mẫu phân tiêu chảy nuôi cấy trên thạch SMAC, ta quan sát 2 loại khuẩn lạc: khuẩn lạc hồng (HS) và khuẩn lạc trắng (TS). Vi khuẩn không sử dụng sorbitol sẽ cho khuẩn lạc màu trắng. Đặc biệt các mẫu bề mặt thịt bò được tăng sinh trong môi trường peptone đệm bổ sung vancomycin và cefixime, đó là hai loại kháng sinh có tác dụng ức chế các vi khuẩn gram dương và một phần vi khuẩn gram âm trong đường ruột. Sau đó, cấy chuyển vi khuẩn lên môi trường thạch CT-SMAC với mục tiêu tăng sinh nhóm STEC, vì cefixime và tellurite có tác dụng ức chế vi khuẩn gram âm và các vi khuẩn E. coli sống hoại sinh trong ống tiêu hóa (FDA, 2002). Trên môi trường thạch CT-SMAC, chỉ quan sát được 1 loại khuẩn lạc màu trắng (TC). 4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn Sau khi giữ gốc vi khuẩn theo từng khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA, thử phản ứng IMViC và khẳng định các gốc phân lập được là E. coli. 4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy Mẫu phân bò tiêu chảy được cấy ria trực tiếp trên môi trường MAC và SMAC. Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, chọn khuẩn lạc điển hình, dùng que cấy chạm nhẹ lên từng khuẩn lạc đã chọn rồi cấy chuyển vào từng ống NA riêng biệt. Những khuẩn lạc sau khi đã cấy chuyển thì phần còn lại được thu chung thành nhóm khuẩn lạc: HM (khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC), TS (khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC), HS (khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC). Như đã đề cập ở mục 4.1.2, sau khi phân lập và xác định E. coli trong mỗi mẫu phân thì giữ gốc vi khuẩn theo nhóm khuẩn lạc (dựa vào kiểu hình) trên thạch MAC (1 nhóm) và SMAC (2 nhóm) và theo từng khuẩn lạc riêng lẻ (mỗi nhóm giữ được 6 – 10 gốc khuẩn lạc riêng lẻ). Trên cơ sở đó, chúng tôi ly trích DNA của vi khuẩn theo nhóm khuẩn lạc hoặc từng khuẩn lạc riêng lẻ. Kết quả trình bày ở mục 4.1.1 cho thấy: Trên thạch MAC chỉ có một loại khuẩn lạc hồng (HM). Như vậy nhóm khuẩn lạc này đại diện cho E. coli có trong mẫu phân khảo sát. Trên thạch SMAC có hai loại khuẩn lạc: HS và TS. Cả hai nhóm khuẩn lạc này được xác định là E. coli. Như vậy nhóm nào cũng đại diện được cho E. coli có trong mẫu phân khảo sát. Tuy nhiên, theo đặc điểm của những serotype E. coli không sử dụng sorbitol sẽ cho khuẩn lạc màu trắng, thuộc nhóm STEC. Do đó, nhóm khuẩn lạc trắng trên thạch SMAC (TS) là nhóm E. coli có thể sản sinh độc tố Shiga (Stx). Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ phân bò tiêu chảy được trình bày ở bảng 4.1. Từ bảng 4.1 ta thấy có 2/8 (25%) mẫu phân chứa E. coli mang gen độc lực. Trong đó, 2/8 (25,5%) mẫu phát hiện được E. coli mang gen stx2, 1/8 (12,5%) mẫu phát hiện được E. coli mang gen hly. Nếu phân lập vi khuẩn này trên môi trường MAC thì có 1/8 mẫu phân (12,5%) chứa E. coli mang gen stx2. Nếu phân lập trên thạch SMAC và chỉ căn cứ theo nhóm khuẩn lạc đỏ hồng (HS), có 1/8 (12,5%) mẫu chứa E. coli mang gen stx2. Nếu căn cứ theo nhóm khuẩn lạc trắng (TS) thì có 2/8 (25%) mẫu chứa E. coli mang gen stx2, 1/8 (12,5%) mẫu chứa E. coli mang gen hly lẫn stx2. Bảng 4.1 Kết quả phát hiện các gen độc lực của từng nhóm khuẩn lạc đại diện cho E. coli trong phân bò tiêu chảy Mẫu  Gen độc lực   Thứ tự  Loại khuẩn lạc  stx1  stx2  eae  hly  lt  sta  stb  vt2e    HM  TS  HS           1  x    -  +  -  -  -  -  -  -     x   -  +  -  -  -  -  -  -      x  -  +  -  -  -  -  -  -   2  x    -  -  -  -  -  -  -  -     x   -  +  -  +  -  -  -  -      x  -  -  -  -  -  -  -  -   3  x    -  -  -  -  -  -  -  -     x   -  -  -  -  -  -  -  -      x  -  -  -  -  -  -  -  -   4  x    -  -  -  -  -  -  -  -     x   -  -  -  -  -  -  -  -   5  x    -  -  -  -  -  -  -  -     x   -  -  -  -  -  -  -  -      x  -  -  -  -  -  -  -  -   6  x    -  -  -  -  -  -  -  -      x  -  -  -  -  -  -  -  -   7  x    -  -  -  -  -  -  -  -      x  -  -  -  -  -  -  -  -   8  x    -  -  -  -  -  -  -  -      x  -  -  -  -  -  -  -  -   Tổng  8  5  7  0  2  0  1  0  0  0  0   Tỉ lệ (%)  100  62,5  87,5  0  25%  0  12,5  0  0  0  0   Tóm lại, trên cùng môi trường phân lập E. coli, những mẫu phân có cùng khuẩn lạc giống nhau vẫn không chắc được rằng chúng mang các gen độc lực như nhau. Tuy nhiên, nhóm khuẩn lạc nào mà multiplex – PCR không phát hiện được gen độc lực thì nhóm đó không mang E. coli gây bệnh. Vì tiêu chảy là triệu chứng rối loạn hấp thu tại đường ruột. Nguyên nhân của triệu chứng này có nhiều nguồn gốc khác nhau. Hậu quả của biểu hiện này đều làm thay đổi hệ vi khuẩn đường ruột. Nếu xét theo nguồn gốc do E. coli thì tiêu chảy có thể do nhóm STEC, ETEC hoặc EPEC. Vì thế, từ 4 nhóm khuẩn lạc mang gen độc lực đã được xác định là 1HM, 1TS, 1HS và 2TS, chúng tôi tiến hành ly trích DNA từ các gốc khuẩn lạc riêng lẻ để xác định các gen độc lực, kết quả được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả phát hiện gen stx1, stx2, eae, hly của một số khuẩn lạc E. coli riêng lẻ phân lập được từ phân bò tiêu chảy Mẫu  Gen độc lực   Loại khuẩn lạc  Thứ tự khuẩn lạc  stx1  stx2  eae