Ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP xác định các loci HLA-A, -B, -C, - DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 tại bệnh viện truyền máu huyết học thành phố Hồ Chí Minh

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 488 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR-SSP XÁC ĐỊNH CÁC LOCI HLA-A, -B, -C, - DRB1, -DRB3/4/5 VÀ –DQB1 TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Hoàng Thị Tuệ Ngọc*, Phan Nguyễn Thanh Vân*, Huỳnh Thị Thu Hương*, Phạm Thị Kim Ngân*, Lê Thanh Trúc*, Nguyễn Tấn Bỉnh** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định kháng nguyên HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 ở người cho và người nhận tế bào gốc tại Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh. Phương pháp: Định type HLA ở 203 đối tượng nhờ kỹ thuật polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) Kết quả: Tổng cộng có 14 họ allele HLA-A, 25 HLA-B, 12 HLA-C, 13 HLA-DRB1, 3 HLA-DRB3, 1 HLA- DRB1, 2 HLA-DRB5 và 6 HLA-DQB1 được tìm thấy. Các họ alen HLA-A*11, A*02, A*24, B*15, B*46, B*07, Cw*07, Cw*08, Cw*01, DRB1*12, DRB1*09, DRB3*03, DRB3*02, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03 và DQB1*05 chiếm ưu thế trong nghiên cứu. Kết luận: Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để định danh HLA đã đáp ứng được nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu tại BVTMHH. Từ khóa: PCR-SSP, hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (HLA). ABSTRACT APPLICATION OF THE PCR-SSP FOR IDENTIFYING THE HLA-A, -B -C, -DRB1, -DRB3/4/5 AND – DQB1 LOCI AT THE BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL - HO CHI MINH CITY Hoang Thi Tue Ngoc, Phan Nguyen Thanh Van, Huynh Thi Thu Huong, Pham Thi Kim Ngan, Le Thanh Truc, Nguyen Tan Binh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 488 - 492 Objective: To determine the HLA –A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 and –DQB1 in the donors-recipients in the Blood Transfusion Hematology Hospital - Ho Chi Minh City. Methods: The HLA typing in 203 subjects was studied using the polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP). Results: A total of 14 HLA-A, 25 HLA-B, 12 HLA-C, 13 HLA-DRB1, 3 HLA-DRB3, 1 HLA-DRB1, 2 HLA-DRB5 and 6 HLA-DQB1 alleles were found. HLA-A*11, A*02, A*24, B*15, B*46, B*07, Cw*07, Cw*08, Cw*01, DRB1*12, DRB1*09, DRB3*03, DRB3*02, DRB4*01, DRB5*01, DQB1*03 and DQB1*05 were predominant in this study. Conclusion:Our study showed the application of the PCR-SSP for identifying of the HLA alleles was responded to the hematopoietic stem cell transplatation at the Blood Transfusion Hematology Hospital - Ho Chi Minh City. Keywords: polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP), human leukocyte antigen system (HLA). * Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh ** Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tác giả liên lạc: ThS.BS. Phan Nguyễn Thanh Vân ĐT: 091.691.770 Email: vanntp@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 489 ĐẶT VẤN ĐỀ Hệ thống kháng nguyên bạch cầu (HLA - human leukocyte antigen system) là tên gọi của phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (major histocompatibility complex - MHC) ở người. Hệ miễn dịch dùng các kháng nguyên HLA là yếu tố chính để xác định kháng nguyên phù hợp với cơ thể. Vì vậy hệ thống HLA là hàng rào chính của sự thải ghép, chỉ sau hệ kháng nguyên ABO(1,2). Các kháng nguyên HLA có vai trò quan trọng trong ghép cơ quan và được nhiều nghiên cứu quan tâm là các kháng nguyên HLA-A, HLA-B, HLA-C (HLA lớp I) và các kháng nguyên HLA-DR, HLA-DQ (HLA lớp II). HLA là một trong những hệ thống có kiểu gen phức tạp và đa dạng nhất. Kết quả của sự đa hình này là hai cá thể không có quan hệ huyết thống với nhau có tỷ lệ tương đồng trên tất cả các locus quy định HLA là rất thấp(1). Như vậy, việc xác định kiểu gen HLA là rất có ý nghĩa nhằm tìm ra người hiến tạng có tương đồng về HLA với người nhận, góp phần quan trọng vào sự thành công của các trường hợp ghép tạng. Do kháng nguyên HLA là những kháng nguyên đồng trội nên ở mỗi cá thể có sự biểu lộ cả 2 kháng nguyên tại mỗi locus (A, B, DR, ). Các kháng nguyên này có thể được định danh bằng các phương pháp định type và sự hiện diện của kháng nguyên này không ảnh hưởng gì đến việc định danh các kháng nguyên khác(2,6). Có rất nhiều phương pháp định danh HLA. Trước đây các tính đặc thù của HLA được xác định bằng huyết thanh học nhưng từ khi phương pháp PCR ra đời, các kỹ thuật định danh HLA đã có những tiến bộ đáng kể. Ngày nay, có rất nhiều kỹ thuật dựa trên PCR được phát triển cho mục đích định danh HLA, ví dụ như: PCR-SSO (polymerase chain reaction - sequence specific oligonucleotides), PCR-SBT (polymerase chain reaction - sequence-based typing), PCR-SSP (polymerase chain reaction- sequence specific primers) Các phương pháp này có độ chính xác cao cũng như có tính khả thi và dễ dàng chuẩn hóa quy trình hơn là phương pháp định type cổ điển bằng huyết thanh học nên ngày càng được ưu tiên lựa chọn(7). Để phục vụ cho công tác ghép tế bào gốc tạo máu tại Thành Phố Hồ Chí Minh, Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học (BVTMHH) đã triển khai kỹ thuật PCR-SSP trong việc định danh HLA-A, -B, - DR từ năm 2004 và sau đó mở rộng thêm với việc định danh HLA-C, -DQB1 kể từ giữa năm 2010. Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày kết quả của việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định các loci HLA-A, -B, -C, - DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 tại BVTMHH trong khoảng thời gian từ tháng 06/2010 đến tháng 07/2011. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu mô tả tiến cứu được thực hiện từ tháng 06/2010 đến tháng 07/2011 tại BVTMHH trên mẫu máu ngoại vi của 203 người, bao gồm các bệnh nhân có chỉ định ghép tế bào gốc tạo máu và thân nhân là người cho tế bào gốc dự kiến. Mẫu máu ngoại vi của các đối tượng nghiên cứu được thu thập trong ống chống đông bằng EDTA, sau đó được chuyển ngay đến bộ phận HLA, Khoa Miễn Dịch, BVTMHH để ly trích DNA trong ngày. DNA toàn phần được ly trích từ 200 L máu bằng QIAamp Blood Mini Kit của công ty Qiagen theo quy trình do công ty cung cấp. DNA sau khi ly trích có độ tinh sạch từ 1,6 - 1,9 OD, có thể được dùng để thực hiện PCR ngay hoặc được trữ ở -20oC cho đến khi sử dụng. Xác định HLA được thực hiện bằng kỹ thuật PCR-SSP với bộ xét nghiệm Micro SSPTM của công ty One Lamda. Tất cả các trường hợp đều bắt đầu bằng 3 xét nghiệm loại tổng quát (Generic) là (1) Micro SSP TM HLA Class I and II ABDR DNA Typing Tray; (2) Micro SSP TM HLA Class I C Locus Specific và (3) Micro SSP TM HLA Class II Typing Tray DQB1 only. Dựa vào kết quả phân tích các loci HLA-A, -B, -C, -DRB1, - DRB3/4/5, -DQB1 từ các 3 xét nghiệm loại tổng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 490 quát (Generic) trên, tùy từng trường hợp mà sử dụng thêm các xét nghiệm loại đặc hiệu cho từng gen (Allele Specific) phù hợp để xác định chính xác họ allele của đối tượng. Các bộ xét nghiệm gồm hai thành phần chính là các khay có sẵn primer đặc hiệu và D-mix với các thành phần có sẵn cho phản ứng PCR (Ngoại trừ Taq polymerase). Taq polymerase sử dụng trong phản ứng PCR là iTaq DNA polymerase của công ty BioRad. Dựa theo quy trình của nhà sản xuất, tất cả các phản ứng được thực hiện với thể tích tổng cộng 10 L. Phản ứng được cài đặt theo chu trình luân nhiệt như sau: 96oC trong 130 giây, tiếp theo là 63oC trong 60 giây, tiếp đó là 9 chu kỳ với bước 1 ở 96oC trong 10 giây và bước 2 là 63oC trong 60 giây, sau đó là 20 chu kỳ với bước 1 ở 96oC trong 10 giây, bước 2 là 59oC trong 50 giây và bước 3 là 72oC trong 30 giây. Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 2% trong dung dịch đệm 0,5xTBE rồi được chụp hình. Kết quả được phân tích nhờ phần mềm HLA Fusion 2.0. Tần xuất các allele HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 được ước tính bằng tính toán trực tiếp. KẾT QUẢ Do kháng nguyên HLA là những kháng nguyên đồng trội nên ở mỗi cá thể có sự biểu lộ cả 2 kháng nguyên tại mỗi locus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định kiểu gen HLA của 203 người, nghĩa là tại mỗi locus có tổng cộng 406 trường hợp phân tích. Phân bố các allele của HLA lớp I Sự phân bố các họ allele của HLA lớp I (HLA-A, -B và -C) trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 1. Nghiên cứu đã tìm thấy 14 họ allele tại locus HLA-A. Trong dân số nghiên cứu, HLA-A*11 là họ allele HLA-A phổ biến nhất (chiếm 23,4%), theo sau là A*02 (chiếm 22,6%) và A*24 (chiếm 19,7%). Ngoài ra, có 19 trường hợp không phân định được giữa A*02 với A*24, có 3 trường hợp không phân định được giữa A*02 với A*92. Các trường hợp này được xếp riêng vào nhóm HLA-A*02/24 và HLA-A*02/92, có tỉ lệ lần lượt là 4,7% và 0,7%. Như vậy trên thực tế, tỉ lệ A*02 và A*24 có thể còn cao hơn con số 22,6% và 19,7%. Tại locus HLA-B, nghiên cứu đã tìm thấy 25 họ allele, trong đó phổ biến nhất là HLA-B*15 (chiếm 19,2%), theo sau là B*46 (chiếm 12,8%) và B*07 (chiếm 12,5%). Có 31 trường hợp (trong tổng số 406) không phân định được chính xác họ allele, các trường hợp này chiếm 7,3% trong số HLA-B của nghiên cứu. Có 12 họ allele HLA-C được xác định qua nghiên cứu. Cw*07 là họ allele thường gặp nhất trong dân số nghiên cứu này, chiếm tỉ lệ 21,6%. Tiếp đó, các họ allele chiếm tỉ lệ cao là Cw*08 (chiếm 17,5%) và Cw*01 (chiếm 16,7%). Ngoài ra, có 8 trường hợp không phân biệt được giữa Cw*08 với Cw*05 và 5 trường hợp không phân định được giữa Cw*01 với HLA-C khác. Như vậy, tỉ lệ Cw*08 và Cw*01 trên thực tế có thể còn cao hơn. Bảng 1: Phân bố tần xuất các allele HLA lớp I của 203 người HLA-A HLA-B HLA-C Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% A*01 3,2 B*07 12,5 Cw*01 16,7 A*02 22,6 B*08 1,2 Cw*02 0,2 A*03 1,9 B*13 6,6 Cw*03 13,3 A*11 23,4 B*15 19,2 Cw*04 8,6 A*24 19,7 B*18 3,2 Cw*05 3.4 A*26 2,9 B*27 2,2 Cw*06 3,9 A*29 5,9 B*35 3,9 Cw*07 21,6 A*30 2,9 B*38 3,7 Cw*08 17,5 A*31 0,2 B*39 1,5 Cw*12 2,5 A*33 8,6 B*40 4,4 Cw*14 0,7 A*34 0,2 B*44 1,5 Cw*15 7,4 A*68 2,9 B*45 0,2 Cw*16 0,2 A*74 0,2 B*46 12,8 Cw*01/12 0,2 A*02/24 4,7 B*48 1,2 Cw*01/14 0,7 A*02/92 0,7 B*51 3,9 Cw*01/03/04 0,2 B*52 1,2 Cw*03/05 0,7 B*53 0,2 Cw*06/12 0,5 B*54 3,7 Cw*08/05 1,5 B*55 1,2 Cw*12/14 0,2 B*56 0,5 B*57 2,5 B*58 4,9 B*95 0,5 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 491 HLA-A HLA-B HLA-C Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% B*13/44 0,2 B*15/45 4,7 B*15/46 0,2 B*27/47 0,2 B*38/39 0,5 B*38/44 0,2 B*39/67 0,2 B*40/45 0,2 B*44/51 0,2 B*46/95 0,5 B*54/55 0,2 Phân bố các allele của HLA lớp II Sự phân bố các allele HLA lớp II (HLA- DRB1, -DRB3/4/5 và -DQB1) được trình bày trong Bảng 2. Trong số 13 họ allele HLA-DRB1 được xác định, allele DRB1*12 chiếm tỉ lệ vượt trội trong nghiên cứu, với 29,8% các trường hợp. Họ allele có tần xuất cao tiếp theo là DRB1*09 (chiếm 19,4%). Tiếp theo là hai họ allele DRB1*15 và DRB1*10, với tỉ lệ lần lượt là 9,8% và 9,3%. Tất cả các trường hợp xác định HLA- DRB1 trong nghiên cứu đều được định rõ họ allele. Bảng 2: Phân bố tần xuất các allele HLA lớp II của 203 người HLA-DRB1 HLA-DRB3/4/5 HLA-DQB1 Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% Họ allele Tỉ lệ% DRB1*01 0,7 DRB3*01 4,2 DQB1*01 0,2 DRB1*03 3,2 DRB3*02 19,5 DQB1*02 4,9 DRB1*04 5,4 DRB3*03 26,4 DQB1*03 40,3 DRB1*07 5,9 DRB3*02/03 0,5 DQB1*04 3,7 DRB1*08 3,6 DRB3*01/02 0,2 DQB1*05 28,3 DRB1*09 19,4 DRB3*01/02/03 1,9 DQB1*06 11,8 DRB1*10 9,3 DRB4*01 32,3 DQB1*01/06 0,2 DRB1*11 2,9 DRB5*01 14,5 DQB1*03/04 10,1 DRB1*12 29,8 DRB5*01/02 0,5 DQB1*03/06 0,5 DRB1*13 4,2 DRB1*14 4,6 DRB1*15 9,8 DRB1*16 1,2 Trong dân số nghiên cứu, có 52,7% các trường hợp biểu hiện DRB3; 32,3% các trường hợp biểu hiện DRB4 và 15% các trường hợp biểu hiện DRB5. Trong các trường hợp biểu hiện DRB3, có 3 họ allele được tìm thấy trong nghiên cứu là HLA-DRB3*01, DRB3*02 và DRB3*03, trong đó họ allele DRB3*03 thường gặp nhất (chiếm 26,4% trong tổng số 406 trường hợp). Tất cả các trường hợp biểu hiện DRB4 đều là DRB4*01 (chiếm 32,3%). Trong số 6 họ allele HLA-DQB1 tìm thấy trong nghiên cứu, các họ allele HLA-DQB1*03 và DQB1*05 là phổ biến nhất (chiếm tỉ lệ lần lượt là 40,3% và 28,3%). BÀN LUẬN Nghiên cứu này dựa trên phân tích các kháng nguyên HLA của bệnh nhân có chỉ định ghép tế bào gốc tạo máu tại BVTMHH và người cho tế bào gốc dự kiến là anh chị em ruột, bà con có liên hệ huyết thống của bệnh nhân nên tần suất các allele không thể đại diện cho dân số chung. Tuy nhiên, kết quả của nghiên cứu cũng có thể đưa ra một số ước tính về các allele thường gặp ở người Việt Nam. Trong nghiên cứu này, phân tích sự phân bố các allele tại locus HLA-A cho thấy có sự tương đồng với các nghiên cứu ở các nước châu Á, trong đó các họ allele chiếm ưu thế là A*11, A*02 và A*24(3,5,7). Ở hầu hết các nghiên cứu trong dân số châu Á đều ghi nhận nhóm allele A*02 chiếm tỉ lệ cao nhất, trong khi nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ A*11 cao hơn A*02 (23,4% so với 22,6%). Tuy nhiên, có 21 trường hợp (5,4%) trong nghiên cứu không phân định được A*02 với A*24 và A*92 nên có thể thực tế tỉ lệ A*02 sẽ cao hơn A*11. Khi so sánh sự phân bố của các kháng nguyên HLA-B trong nghiên cứu này với nghiên cứu của Hoa B.K. và cộng sự trên 170 người Việt Nam dân tộc Kinh, chúng tôi nhận thấy có điểm chung là các allele HLA-B*15, B*46 và B*07 chiếm ưu thế(3). Tuy nhiên, kết quả này có khác biệt so với các nghiên cứu khác trong quần thể dân châu Á như nghiên cứu của Chunmei Shen và cộng sự trên 516 người Trung Quốc khỏe mạnh tìm thấy các allele hay gặp nhất là HLA-B*13, B*15 và B*51 với tỉ lệ lần lượt là 11%; 9,3% và 8,5%(5). Họ allele B*40 không chiếm ưu thế trong nghiên cứu này (4,4%) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 492 nhưng theo một số nghiên cứu khác thì rất thường gặp ở châu Á(4). Khi so sánh sự phân bố các allele HLA-C, - DRB1, -DQB1 của nghiên cứu này với nghiên cứu của Hoa B.K. trên 170 người Việt Nam dân tộc Kinh, chúng tôi nhận thấy có một số tính chất chung là các allele Cw*01, Cw*07, Cw*08, DRB1*12, DQB1*03, và DQB1*05 thường gặp nhất(3). Như vậy, cho dù dân số của nghiên cứu này là những người cho và người nhận có quan hệ huyết thống nhưng kết quả vẫn thể hiện hình ảnh đặc trưng cho dân số chung là người Việt Nam. Về mặt kỹ thuật định danh HLA dùng trong nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy có một số trường hợp không phân định được rõ họ allele (5,4% các trường hợp HLA-A; 7.3% HLA-B; 3,6% HLA-C; 3,1% HLA-DRB3/4/5 và 10,8% HLA- DQB1). Vấn đề này là do trong giai đoạn đầu của nghiên cứu không có nhiều thông tin về các allele thường gặp, các mẫu được thực hiện với các xét nghiệm loại tổng quát (Generic) nên có nhiều trường hợp không phân định được. Dần dần, trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi triển khai thêm các xét nghiệm loại đặc hiệu cho từng gen (Allele Specific) nên các trường hợp về sau đều phân định được rõ họ allele. Về mặt dịch tễ, đây là một điểm hạn chế của nghiên cứu nhưng xét về mặt thực tế lâm sàng thì vẫn chấp nhận được vì các trường hợp ghép ở BVTMHH là giữa các anh chị em ruột nên có thể dựa thêm vào sự tương hợp của các locus khác để tìm người cho phù hợp. KẾT LUẬN Kết quả của nghiên cứu cho thấy việc ứng dụng kỹ thuật PCR-SSP để xác định các loci HLA-A, -B, -C, -DRB1, -DRB3/4/5 và –DQB1 đã đáp ứng được nhu cầu ghép tế bào gốc tạo máu tại BVTMHH. Đây còn là cơ sở cho việc định danh HLA cho các mẫu máu cuống rốn nhằm phục vụ việc phát triển ngân hàng máu cuống rốn tại bệnh viện. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Choo SY. (2007). The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications. Yonsei Medical Journal, 48: 11-23. 2. Ferrer A. et al. (2005). Overview on HLA and DNA typing methods. Biotechnologia Aplicada, 22: 91-101. 3. Hoa BK. (2008). HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam. Tissue Antigens, 71(2): 127-134. 4. Shankarkumar U. (2010) Complexities and similarities of HLA antigen distribution in Asian subcontinent. Indian J Hum Genet, 16(3): 108-110. 5. Shen C. (2008). Genetic polymorphisms at HLA-A, -B, and – DRB1 loci in Han population of Xi’an city in China. Croat Med J., 49: 476-482. 6. Sullivan KA. KIPPS TJ. (2010). Human leukocyte and platelet antigens. In: Williams Hematology, 8ed. MacGraw-Hill, Inc. International edition, New York. 7. Zhu B. et al. (2010). Distribution of HLA-A and –B alleles and haplotypes in the Yi ethnic minority of Yunnan, China: relationship to other populations. Journal of Zhejiang University-Science, 11(2): 127-135.