Ứng dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng xác định mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein ở mô ung thư

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học 36 ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP PCR BÁN ĐỊNH LƢỢNG VÀ ĐỊNH LƢỢNG XÁC ĐỊNH MỨC ĐỘ SAO CHÉP CỦA HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN Ở MÔ UNG THƢ Trần Vân Khánh*, Tạ Thành Văn* Phương pháp PCR bán định lượng và định lượng là những phương pháp đơn giản, chính xác và cho độ tin cậy tương đối cao được sử dụng rất rộng rãi để xác định mức độ biểu hiện của mỗi gen được khuyếch đại sau mỗi phản ứng PCR. Mục tiêu: Sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng để đánh giá mức độ sao chép của Heparansulphat Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư so với mô lành tính; so sánh kết quả của 2 phương pháp trên. Phương pháp: Tách triết mRNA tổng số từ mô ung thư và lành tính; tổng hợp cDNA; xác định mức độ sao chép của HIP sử dụng phương pháp PCR bán định lượng và định lượng. Kết quả: Cả phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau; HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp trên mẫu lành tính. Kết luận: Mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách rõ rệt. Chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp PCR bán định lượng và định lượng trên để đánh giá mức độ sao chép của HIP trong chẩn đoán bệnh ung thư. Từ khóa: HIP/L29; cancer; transcript. ABSTRACT THE DETERMINATION HEPARANSULPHAT INTERACTING PROTEIN (HIP) TRANSCRIPT IN CANCER TISSUES USING SEMIQUANTITATIVE PCR AND QUANTITATIVE PCR METHODS Tran Van Khanh, Ta Thanh Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 11 – Supplement of No 3 – 2007: 36 – 40 Semiquantitative PCR and quantitative PCR are accurate and simple methods. They are commonly used to determine amplified gene levels in PCR reaction. Objective: Using semiquantitative PCR and quantitative PCR methods to determine HIP transcript levels in cancer and normal tissue; to evaluate sensibility of tow methods. Methods: mRNA was extracted from cancer and normal tissues, cDNA synthesis by reverse transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR); HIP transcript determination using semiquantitative PCR and quantitative PCR methods. Results: Both methods showed the same results: HIP transcript was up regulated in cancer tissues. Conclusion: Levels of HIP transcript was different between cancer tissue and the normal control. Semiquantitative PCR and quantitative PCR are useful methods to determine HIP transcript for cancer diagnosis. Key words: HIP/L29; cancer; transcript ĐẶT VẤN ĐỀ Heparin và heparansulfate (HP/HS) là đại phân tử mang điện âm với độ sulphate hóa rất cao, chính vì vậy chúng có khả năng tương tác với nhiều loại protein trong các quá trình sinh học khác nhau và đóng vai trò rất quan trọng trong việc hình thành và duy trì cấu trúc chức * Trường Đại học Y Hà Nội Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học 37 năng của tế bào(6). Daniel D. Carson và cộng sự đã phát hiện ra một protein bề mặt tế bào biểu mô thận người và một số dòng tế bào khác, protein này được đặt tên là Heparansulphat Interacting Protein (HIP)(2). Đây là một protein có chiều dài 155 aa với trọng lượng phân tử khoảng 18 kDa(3). Khi nghiên cứu sâu hơn về chức năng sinh học của HIP các tác giả đã phát hiện ra rằng HIP cũng có chức năng tương tự như những protein gắn ái lực với HP/HS và chúng được tổng hợp nhiều ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin và protein như: ung thư tuyến giáp trạng và ung thư vú, ung thư đại tràng... Đặc biệt mức độ biểu hiện của HIP liên quan chặt chẽ với quá trình phát triển và xâm lấn của ung thư và phụ thuộc vào mức độ ác tính của các dòng ung thư(1,7). Việc nghiên cứu tìm hiểu cơ chế ung thư ở mức độ phân tử, từ đó tìm ra phương pháp chẩn đoán hữu hiệu và điều trị sớm là một lĩnh vực đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Trong một vài nghiên cứu gần đây, bằng phương pháp RT-PCR chúng tôi đã phát hiện thấy mRNA của HIP được sao chép với một lượng đáng kể trong mô ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt trong khi đó không phát hiện được hoặc phát hiện rất thấp ở mô u xơ(4,5). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp RT-PCR bán định lượng và định lượng để xác định mức độ sao chép của HIP ở mô ung thư, từ đó so sánh kết quả, đánh giá độ tin cậy của 2 phương pháp trên để ứng dụng chúng xác định mức độ sao chép của HIP và các gen khác trong chẩn đoán bệnh ung thư. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng 30 bệnh nhân ung thư được chẩn đoán xác định dựa trên lâm sàng, cận lâm sàng (siêu âm, hoá sinh, mô bệnh học) tại Bệnh viện K Hà nội. Chúng tôi sử dụng 15 mẫu mô lành tính để làm đối chứng. Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết mRNA và tổng hợp cDNA RNA tổng số được tách chiết từ mô ung thư theo quy trình chuẩn đã được mô tả trước đây(5). 5µg RNA tổng số được sử dụng để tổng hợp chuỗi cDNA bổ xung bằng phản ứng reverse transcript-polymerase chain reaction RT- PCR. Phương pháp PCR bán định lượng Cặp mồi đặc hiệu với HIP có trình tự như sau: HIP-F: 5’-GCT TAT GGT GCA GAC ATG G -3’; HIP-R: 5’-CAG AGA TAT CTA CTC TGA AGC-3’. PCR được tiến hành với tổng thể tích 20µl gồm: 4 µl cDNA, 2 µl 10x Ex Taq Buffer, 2 µl 2.5mM dNTPs, 10 pmol mồi xuôi và ngược, 1 unit Ex Taq Polymerase (Takara Bio Inc.Kyoto, Japan). Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: Biến tính 940C - 5 phút, 35 chu kỳ 940C - 50 giây, 580C - 50 giây, 720C - 50 giây , 720C - 5 phút. Sử dụng gen nội chuẩn GAPDH để đánh giá chất lượng RNA và so sánh lượng mẫu sử dụng trong phản ứng RT-PCR. Đậm độ mỗi vạch HIP và GAPDH được xác định nhờ phần mềm chuyên dụng. Mức độ sao chép của HIP được tính bằng tỉ lệ HIP/GAPDH rồi vẽ đồ thị. Phương pháp PCR định lượng (Agilent 2100 Bioanalyzer with DNA 1000 Lab Chips; Agilent Technologies, Palo Alto, CA): Phương pháp PCR định lượng được ứng dụng để đánh giá độ tin cậy của phương pháp trên. Quy trình PCR được tiến hành tương tự như phương pháp PCR bán định lượng. Vì phương pháp này rất nhạy và có thể đánh giá được mức độ sao chép của HIP cho dù ở mức độ rất thấp nên chu kỳ của phản ứng được giảm từ 35 xuống 24 chu kỳ. Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên hệ thống capillary (Capillary electrophoresis) và mức độ sao chép của HIP được xác định thông qua hệ thống máy tính. Kết quả PCR định lượng được Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học 38 biểu thị trên đồ thị tương ứng với các đỉnh. GAPDH cũng được sử dụng để so sánh lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Để xác định mức độ sao chép của HIP, sử dụng cặp mồi đặc hiệu với HIP chúng tôi tiến hành phản ứng RT-PCR bán định lượng trên những mẫu RNA tổng số tách từ mẫu ung thư và mẫu lành tính. Sau khi được điện di trên agarose 2%, sản phẩm PCR nhận được có kích thước phân tử 444 bp (hình 1a). Quan sát chúng ta thấy đậm độ vạch PCR ở những mẫu ung thư rõ hơn so với những mẫu lành tính, kết quả gợi ý rằng HIP tăng cường sao chép ở những mô ung thư trong khi đó sao chép rất thấp ở những mô lành tính. 1 2 3 4 5 6 7 HIP GAPDH 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1 2 3 4 5 6 7 Hình 1: Kết quả của phản ứng RT-PCR của HIP và GAPDH ở mô ung thư và mô lành tính (a). Sản phẩm được khuyếch đại từ cDNA của mô ung thư (1-5) và mô lành tính (6-7). Kết quả định lượng của HIP/GAPDH tương ứng với hình a đã được tính và vẽ đồ thị (b). Nhận xét: Sản phẩm PCR đặc hiệu của gen GAPDH trên những mẫu ung thư và những mẫu lành tính tương ứng có kích thước 350 bp (hình 1a). GAPDH là một gen thể hiện trên mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được dùng như một gen nội chuẩn. Kết quả của phản ứng khuếch đại GAPDH chỉ ra rằng cả 7 bệnh nhân nghiên cứu đều có chất lượng mRNA tốt đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, đồng thời không có sự khác biệt về lượng mẫu đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR. Kết quả vẽ đồ thị của tỉ lệ HIP/GAPDH ở hình 1b cho thấy HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp trên những mẫu lành tính. Điều này khẳng định rõ sự khác biệt về mức độ biểu hiện của HIP ở mô ung thư so với mô lành tính. 1 2 3 4 5 6 7 a. b. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh – Tế Bào Bệnh Học 39 Hình 2: Hình ảnh của phản ứng RT-PCR định lượng. Kết quả PCR định lượng của HIP tương ứng với đỉnh H ở mô ung thư và mô lành tính (bên trái). Kết quả PCR của gen GAPDH tương ứng với đỉnh G (bên phải). Đỉnh M tương ứng với marker 15 và 1500 bp. Sản phẩm được khuyếch đại từ cDNA của mô ung thư (1-5) và mô lành tính (6-7) Nhận xét: Kết quả PCR định lượng đánh giá mức độ sao chép của HIP sử dụng hệ thống điện di cappilary (hình 2) chỉ rõ: đỉnh H (bên trái) tương ứng với mức độ mức độ biểu hiện của HIP ở những mẫu ung thư (1-5) cao hơn rõ ràng so với những mẫu lành tính (6-7) trong khi đó đỉnh G (bên phải) tương ứng với mức độ biểu hiện của gen GAPDH không thấy có sự khác biệt, điều này chứng tỏ không có sự khác biệt về lượng mẫu sử dụng trong mỗi phản ứng. Kết quả này một lần nữa khẳng định HIP được tăng cường sao chép rất rõ ở những mô ung thư. BÀN LUẬN Việc nghiên cứu tìm hiểu những gen tăng cường tổng hợp ở mô ung thư sẽ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế phân tử của bệnh, từ đó cho phép chúng ta tìm ra những marker có giá trị để chẩn đoán xác định và mức độ tiến triển GAPDH M M G M M G M M G M M G M M G M M G M M G 1 2 3 4 5 6 7 HIP M M H M M H M i 3** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 11 * Phụ bản Số 3 * 2007 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh– Tế Bào Bệnh Học 40 của mô ung thư. HIP là một protein bề mặt tế bào được phát hiện lần đầu tiên ở dòng tế bào biểu mô thận người và được tổng hợp rất nhiều ở các dòng tế bào nội mạc và tế bào biểu mô trưởng thành. HIP gắn trực tiếp vào Heparin, một loại protein có khả năng tương tác với nhiều loại protein khác nhau vì vậy HIP tham gia vào quá trình liên kết tế bào – tế bào, tế bào – khoảng gian bào. Rohde và cộng sự đã chứng minh rằng HIP giúp cho những tế bào trophoblast gắn vào biểu mô thận và tăng cường quá trình xâm lấn tế bào. Một vài nghiên cứu trong và ngoài nước gần đây đã chứng minh rằng HIP được tăng cường tổng hợp ở các dòng tế bào và mô ung thư ở cả mức độ RNA thông tin và protein(1,4,5,7). Sự tăng cường tổng hợp của HIP ở những mô ung thư sẽ thúc đẩy sự tương tác tế bào-tế bào, tế bào- ngoại bào đồng thời nó có thể đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển, khư trú và xâm lấn của khối u. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã dùng phương pháp RT-PCR bán định lượng và định lượng để xác định mức độ biểu hiện của gen HIP ở mô ung thư so sánh với mô lành tính. Đây là những kỹ thuật đơn giản, chính xác và cho độ tin cậy tương đối cao. Cả 2 phương pháp này đều cho kết quả tương tự như nhau: HIP được tăng cường tổng hợp rất rõ ở những mô ung thư trong khi đó phát hiện được rất thấp ở mô lành tính. Điều này giúp cho chúng tôi có những định hướng tiếp theo và có thể ứng dụng những phương pháp này như một công cụ hữu ích không chỉ trong việc đánh giá mức độ biểu hiện của HIP ở những mô ung thư mà trong cả việc nghiên cứu tìm hiểu đánh giá mức độ biểu hiên của những marker khác trong chẩn đoán bệnh ung thư. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả nước ngoài cho thấy mức độ sao chép mRNA của HIP được tăng cường ở dòng tế bào và mô ung thư trong khi đó không biểu hiện hoặc biểu hiện rất thấp ở mô lành tính. Sự tăng cường tổng hợp của HIP ở những mô ung thư cho phép chúng ta kết luận rằng, HIP có mối liên hệ chặt chẽ với sự phát triển mô ung thư và có thể dùng HIP như một marker có giá trị góp phần chẩn đoán bệnh ung thư. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi rút ra một số kết luận sau: - Mức độ biểu hiện của HIP giữa mô ung thư và mô lành tính khác biệt nhau một cách rõ rệt. - Cả 2 phương pháp PCR bán định lượng và định lượng đều cho kết quả tương tự nhau với độ tin cậy cao. Chúng ta có thể dùng một trong hai phương pháp này để đánh giá mức độ sao chép của HIP và một số marker khác trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. De Nigris, F., Visconti, R.,Fusco, A., et al. (1998). Overexpression of the HIP gene coding for a heparin/ heparin sulfate – binding protein in human thyroid carcinomas. Cancer Res. 58, 4745-4751. 2. Jacobs, A.L., Julian, J.A., Sahin, A.A., and Carson, D.D. (1997). Heparin/Heparansulfate interacting protein expression and functions in human breast cancer cells and normal breast epithelia. Cancer Research 57, 5148-5154. 3. Liu. S., Smith, E. Sott, Julian, J., Rohde, H.L, Karin, J. Norman., and Carson, D.D. (1996). cDNA Cloning and expression of HIP, a novel cell surface heparan sulfate/heparin-binding protein of human uterine Epithelial cells and cell lines. Journal of biological chemistry.271, 11817-11823. 4. Nguyễn Thị Phương Ngọc, Trần Vân Khánh, Đào Kim Chi, Phạm Thị Lý và Tạ Thành Văn (2006). Tăng cường tổng hợp heparan sulfate interacting protein ở mô ung thư tuyến tiền liệt. Tạp chí dược học. 367, 132-135. 5. Phan Tôn Hoàng và Tạ Thành Văn (2005). Sự sao chép Heparin/Heparan Sulfate Interacting Protein (HIP) ở mô ung thư vú. Tạp chí nghiên cứu Y học. 38, 5-10. 6. Tạ Thành Văn (1989). Heparin: Sự tương tác với protein Tạp chí nghiên cứu Y học 6, 69-72. 7. Wang, Y., Cheong, D., Chan, S., Chuan Hooi, S. (1997). heparin/heparan sulfate interacting protein gene expression is up – regulated in human colorectal carcinoma and correlated with differentiation status and metastasis. Cancer Res. 59, 2989-2994.