Vi khuẩn khử sunphat ưa ấm sử dụng dầu thô desulfovibrio desulfuricans ĐH3P phân lập từ giếng khoan dầu khí mỏ Đại Hùng, Vũng Tàu

21 Tạp chí Khoa học và Công nghệ biển T11 (2011). Số 4. Tr 21 - 33 VI KHUẨN KHỬ SUNPHAT ƯA ẤM SỬ DỤNG DẦU THÔ DESULFOVIBRIO DESULFURICANS ðH3P PHÂN LẬP TỪ GIẾNG KHOAN DẦU KHÍ MỎ ðẠI HÙNG, VŨNG TÀU NGUYỄN THỊ THU HUYỀN, TRƯƠNG ðẠI DƯƠNG, LẠI THUÝ HIỀN Viện Công nghệ sinh học Tóm tắt: Vi khuẩn khử sunphat ưa ấm ñược biết ñến từ lâu với khả năng tạo H2S gây ăn mòn kim loại. Gần ñây các nhà khoa học trên Thế giới ñã công bố là các vi khuẩn này còn có khả năng phân hủy dầu thô ở ñiều kiện kỵ khí. Trong nghiên cứu này, lần ñầu tiên, chúng tôi công bố khả năng sử dụng dầu thô ở ñiều kiện kỵ khí của vi khuẩn khử sunphat ưa ấm ở Việt Nam. Chủng vi khuẩn khử sunphat ưa ấm ðH3P ñược phân lập từ giếng khoan dầu khí mỏ ðại Hùng, Vũng Tàu có khả năng sử dụng dầu thô. Chủng ðH3P là vi khuẩn Gram âm, hình que cong, có tiên mao. Kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng này là loài Desulfovibrio desulfuricans (99.8% ñộ tương ñồng). ðiều kiện tối ưu cho sinh trưởng của chủng ðH3P trong môi trường Postgate B cải tiến là 1% (v/v) dầu thô, 2 - 3% NaCl (g/l), pH 8 và nuôi cấy ở 30oC. Trong ñiều kiện môi trường tối ưu cho sinh trưởng, chủng này ñã sử dụng ñược 6.5% hàm lượng dầu tổng số và thành phần dầu bị chủng này phân huỷ là các n- parafin có mạch C ≥ 45 sau 1 tháng thử nghiệm ở ñiều kiện kỵ khí. ðây là những dữ liệu rất quan trọng ñể cảnh báo thêm về mối nguy hại của vi khuẩn khử sunphat ưa ấm ñến quá trình khai thác, sử dụng và bảo quản dầu mỏ ở nước ta. Từ khoá: Desulfovibrio, ðH3P, ðại Hùng, sử dụng dầu thô, vi khuẩn khử sunphat ưa ấm. I. MỞ ðẦU Vi khuẩn khử sunphat (KSF) là 1 nhóm các vi khuẩn kỵ khí nghiêm ngặt sống trong môi trường yếm khí như là bùn ñáy ao, hồ, trầm tích biển, có khả năng khử sunphat thành sunphua (Muyzer, Stam, 2008). Trong phòng thí nghiệm, KSF có thể chỉ sản sinh ra 1 lượng nhỏ khí H2S nhưng trong tự nhiên, chẳng hạn như trong trầm tích, KSF có thể giải phóng một lượng ñáng kể khí H2S. Khí này kết hợp với các ion kim loại sẽ tạo ra các muối kết tủa. Cho ñến nay, rất nhiều loài KSF ñã ñược tìm thấy ở các mỏ dầu. Tuy nhiên, sự sinh trưởng của chúng ñã làm chua hóa quá trình hình thành dầu mỏ do chúng ñã sản sinh ra khí H2S làm tăng lượng khí này lên trong các giếng dầu. ðồng thời chúng còn tham gia vào quá trình ăn mòn sinh học các thiết bị kim loại (Cord-Ruwisch et al., 1987; Vance, 22 Thrasher, 2005). ðiều này ñã làm ảnh hưởng nghiêm trọng ñến các vấn ñề về kinh tế, sức khỏe, an toàn và kỹ thuật ñối với khai thác dầu khí. Trong quá trình sinh trưởng, các vi khuẩn này thường sử dụng các nguồn cơ chất ưa thích như là lactate và acetate. Việc nghiên cứu quá trình phân hủy các hydrocacbon dầu mỏ bởi nhóm vi khuẩn này ñã ñược tiến hành trong thời gian gần ñây và ñã ñạt ñược những thành tựu nhất ñịnh. Cho ñến nay, nhiều chủng KSF có khả năng phân hủy hydrocacbon ñã ñược phân lập (Kniemeyer et al., 2003; Cravo-Laureau et al., 2004; 2007; Ommedal, Torsvik , 2007). Vì thế, ñối với công nghiệp dầu khí, việc nghiên cứu khả năng phân hủy dầu thô của KSF ñang là một vấn ñề nghiên cứu cấp thiết. Ở Việt Nam, công nghiệp dầu khí cũng ñang phải ñối mặt với việc chua hóa dầu và ăn mòn thiết bị kim loại gây ra bởi nhóm vi khuẩn này, trong ñó có KSF ưa ấm. ðó là bởi vì trong quá trình khai thác dầu khí ngoài khơi, một lượng lớn nước biển ñã loại bỏ oxy thường ñược bơm vào các giếng dầu nhằm duy trì áp suất trong giếng và tăng cường khai thác dầu thứ cấp. Vì thế, các vi khuẩn bản ñịa xung quanh khu vực có dầu cũng ñược theo vào trong giếng khoan. Các ñiều kiện kỵ khí kết hợp với hàm lượng sunphat cao trong nước biển ñã thúc ñẩy sự sinh trưởng mạnh mẽ của KSF trong các giếng khoan cũng như hệ thống khai thác, tồn chứa và vận chuyển dầu (Lại Thúy Hiền và cs, 2000). Như vậy, ñi kèm với lợi ích thu ñược từ khai thác thứ cấp nhờ bơm ép nước, tác hại của KSF theo nước biển vào giếng khoan (KSF ưa ấm) gây ra cũng không nhỏ. Tính ñến nay, mới chỉ có một số loài vi khuẩn khử sunphat ưa ấm ñã ñược phân lập từ các mỏ dầu Bạch Hổ, Vũng Tàu (Lại Thúy Hiền, Lê Phi Nga, 1992; Lại Thúy Hiền, ðặng Phương Nga, 1998). Gần ñây, Nguyễn Thị Thu Huyền và ñồng tác giả (2010) ñã phát hiện khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất là hiện tượng khá phổ biến của KSF ưa ấm lấy từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu. Vì vậy, trong bài báo này, lần ñầu tiên, chúng tôi công bố chủng khử sunphat ưa ấm ðH3P phân lập từ mỏ ðại Hùng, Vũng Tàu có khả năng sử dụng dầu thô. Những kết quả thu ñược là cơ sở dữ liệu hữu ích góp phần vào việc xây dựng các chiến lược phòng ngừa và kiểm soát quá trình sản sinh khí H2S sinh học trong giếng khoan dầu khí. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Vật liệu Chủng nghiên cứu. Chủng ðH3P ñược phân lập từ giếng số 3 (giếng khai thác dầu thứ cấp bằng cách bơm nước biển từ ngoài vào) mỏ ðại Hùng, Vũng Tàu. Môi trường và ñiều kiện nuôi cấy. Môi trường dùng ñể hoạt hóa KSF là môi trường Postgate B cải tiến 1% NaCl [Lại Thúy Hiền và cs, 2003]. Môi trường dùng ñể phân lập 23 và nghiên cứu khả năng sử dụng dầu thô của KSF ðH3P là môi trường dầu thô trong ñó cơ chất lactate và axetat trong môi trường Postgate B cải tiến 1% NaCl ñược thay bằng cơ chất dầu thô và chất thêm cao men bị loại bỏ khỏi thành phần môi trường. Môi trường ñể thu sinh khối cho việc tách DNA tổng số là môi trường Postgate C với thành phần như sau: KH2PO4 0.5 g/l, KCl 0.5 g/l, NH4Cl 1 g/l, NaCl 15 g/l, CaCl2 0.06 g/l, Na2SO4 1g/l, MgSO4 0.06 g/l, natri lactat 6 g/l, natri xitrat 0.3 g/l, nước biển (200 ml/l). Các thành phần chất thêm, vitamin và vi lượng tương tự như môi trường Postgate B cải tiến ngoại trừ hàm lượng FeSO4 ñược bổ sung là 0.004 g/l. ðối với môi trường thạch thì 12 g agar ñược bổ sung vào 1lit môi trường. Tất cả các thí nghiệm ñều ñược tiến hành nuôi cấy trong ñiều kiện kỵ khí ở 30oC (ngoại trừ thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ) với 1% giống ban ñầu ñang ở giai ñoạn pha log ñược hoạt hóa trong môi trường Postgate B cải tiến 1% NaCl. 2. Phương pháp Phân lập. Mẫu KSF lấy từ giếng số 3 mỏ ðại Hùng ñược hoạt hóa lại trong môi trường Postgate B cải tiến 1% NaCl. Sau ñó, mẫu này ñược nuôi cấy trong môi trường chứa 1% dầu thô (lặp lại liên tiếp) cho ñến khi KSF ðH3P có khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa dầu thô làm nguồn cơ chất duy nhất. Việc phân lập ñơn chủng KSF ðH3P sử dụng dầu thô ñược tiến hành bằng phương pháp pha loãng tới hạn trong môi trường thạch chứa 1% dầu thô. Nhuộm Gram. Sau khi cấy hoạt hóa, chủng ðH3P ñược nuôi cấy trên môi trường Postgate B cải tiến 1% NaCl. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành nhuộm Gram và quan sát trên kính hiển vi quang học. Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi ñiện tử quét. Chủng ðH3P ñược cấy hoạt hóa trên môi trường Postage B cải tiến 1% NaCl. Sau ñó, các chủng này ñược nuôi cấy trên môi trường chứa 1% dầu thô. Khi các chủng này sinh trưởng tốt, lọc bỏ cặn FeS rồi ly tâm 8000 vòng/phút ở 4 oC trong 10 phút ñể thu tế bào, rửa lại bằng PBS (pH 7.2). Qui trình chuẩn bị mẫu và soi trên kính hiển vi ñiện tử quét HITACHI S4800 theo Phạm Thị Hằng và Lại Thúy Hiền (2010). Phân tích trình tự gen 16S rRNA. Chủng ðH3P ñược cấy hoạt hóa trên môi trường Postage B cải tiến 1% NaCl. Sau ñó, các chủng này ñược nuôi cấy trên môi trường Postgate C trong 4 ngày ở 30oC. Sau ñó, lọc bỏ cặn FeS rồi ly tâm 8000 vòng/phút ở 4oC trong 10 phút ñể thu tế bào. DNA tổng sổ của các chủng này ñược tách theo kit tách DNA vi khuẩn (Qiagen, Mĩ). Chất lượng DNA tổng số ñược kiểm tra trên gel agarose. Các bước tiếp theo ñược tiến hành theo Sakiyama et al. (2009). 24 ðánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường ñến sinh trưởng của chủng ðH3P trong môi trường chứa dầu thô. Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng dầu thô, nhiệt ñộ, nồng ñộ muối NaCl và pH ñến sinh trưởng của chủng ðH3P ñã tuần tự ñược thực hiện. Chủng ðH3P ñược cấy hoạt hóa trên môi trường Postage B cải tiến 1% NaCl. Sau ñó, các chủng này ñược nuôi cấy trên các môi trường có hàm lượng dầu thô, nhiệt ñộ, nồng ñộ muối NaCl và pH khác nhau. Sự sinh trưởng của các chủng KSF này trong các ñiều kiện khác nhau ñược ñánh giá thông qua hàm lượng H2S tạo thành (xác ñịnh bằng phương pháp chuẩn ñộ iot). Phân tích hàm lượng dầu tổng số và thành phần dầu thô. Chủng ðH3P ñược cấy hoạt hóa trên môi trường Postage B cải tiến 1% NaCl. Sau ñó, chủng này ñược nuôi cấy trên môi trường chứa dầu thô. Sau 4 tuần nuôi cấy, hàm lượng dầu tổng số và thành phần dầu thô bị sử dụng bởi ðH3P sẽ ñược xác ñịnh bằng phương pháp tách dầu trong nước và phương pháp sắc kí khí. Xác ñịnh hàm lượng dầu tổng số bằng phương pháp tách dầu trong nước Lọc mẫu nuôi cấy ðH3P trong môi trường chứa 1% dầu thô bằng giấy lọc. Dầu và các sản phẩm lơ lửng không tan trong nước ñược giữ trên giấy lọc. Giấy lọc sau ñó ñược ñược rửa vài lần bằng cách nhúng trong cốc ñựng chloroform và ñược thu hồi vào một cốc cân. Sau khi thực hiện xong bước này, phần lớn mẫu dầu sau thí nghiệm còn bám trên thành chai ñựng mẫu. Vì vậy, tiến hành tráng rửa chai vài lần bằng chroroform và thu hồi vào cùng cốc cân nói trên. ðể dung môi trong cốc cân bay hơi qua ñêm ở ñiều kiện nhiệt ñộ 20oC. Sau khi bay hơi hết dung môi. Cân cốc cân ñể xác ñịnh khối lượng dầu. Xác ñịnh thành phần dầu bằng phương pháp sắc kí khí Phân tích ñịnh lượng thành phần nhóm (speudo) và thành phần các n-parafin của mẫu dầu ñến C45+ bằng cách thiết lập hệ số ñáp ứng cho mẫu chuẩn ñịnh lượng n-paraffin với việc sử dụng chất lỏng chuẩn 244TM1P với ñộ tinh khiết ≥99,5% như chất nội chuẩn và sử dụng hỗn hợp chuẩn ñịnh lượng Agilent P/N gồm các n-parafin từ nC5-nC45 như một mẫu chuẩn ñịnh lượng ña cấu tử n-paraffin. Chế ñộ phân tích sắc ký khí mẫu dầu thí nghiệm và mẫu chuẩn ñịnh lượng như sau: Column (HP-5, 30 m x0.25 mm x0.25 µm), Oven (35oC (3 min), 4oC/min to 310 (40 min)), Carrier (Helium, 44.4 ml/min, pressure : 10.5 psig), Injection (Split 45:1, 330oC), Detector (FID, 330oC). III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. ðặc ñiểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng ðH3P Theo công bố của Nguyễn Thị Thu Huyền và ñồng tác giả (2010), tập ñoàn KSF 25 ðH3P có khả năng sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất duy nhất cho sinh trưởng. ðể có thể hiểu rõ hơn về các ñặc ñiểm sinh học của ñơn chủng KSF có khả năng sử dụng dầu thô, chúng tôi tiến hành phân lập ñơn chủng ðH3P, và từ ñó tiến hành nghiên cứu các ñặc ñiểm sinh học của nó. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch chứa 1% dầu thô làm nguồn cơ chất, khuẩn lạc chủng ðH3P có hình tròn, ñen, mép khuẩn lạc không gọn, ñường kính khuẩn lạc khoảng 2 mm (hình 1). Kết quả nhuộm Gram cho thấy chủng ðH3P là vi khuẩn Gram âm. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trong và ngoài nước rằng hầu hết KSF ưa ấm là các vi khuẩn Gram âm (Lại Thúy Hiền, Lê Phi Nga, 1992 ; Lại Thúy Hiền, ðặng Phương Nga, 1998; Muyzer, Stams, 2008). Quan sát hình thái tế bào trên kính hiển vi ñiện tử quét SEM cho thấy tế bào chủng ðH3P có hình que cong, có tiên mao có thể giúp cho chủng này di chuyển tốt hơn trong môi trường (hình 1). ðây cũng là một trong những hình dạng phổ biến của KSF (Madigan et al., 2009). (A) ðC ðH3P (B) Hình 1: Hình thái khuẩn lạc (A) và tế bào dưới kính hiển vi ñiện tử quét (B) của chủng ðH3P 2. Xác ñịnh tên loài theo phân tích trình tự gen 16S rRNA ðể có thể tiến hành những nghiên cứu sâu hơn về khả năng sử dụng dầu thô của chủng ðH3P, chủng này ñược ñịnh tên dựa trên phân tích trình tự 16S rRNA. Kết quả phân tích ñược trình bày ở hình 2. Kết quả cho thấy chủng này có ñộ tương ñồng 99.8% 26 với loài Desulfovibrio desulfuricans. ðiều này hoàn toàn phù hợp bởi chi Desulfovibrio rất phổ biển trong nước biển Việt Nam. Hình 2: Vị trí phân loại của chủng KSF ðH3P với các loài có quan hệ họ hàng dựa vào trình tự gen 16S rRNA 3. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường ñến sinh trưởng của ðH3P trong môi trường chứa dầu thô ðể xác ñịnh ñược ñâu là ñiều kiện tối ưu cho khả năng sinh trưởng của chủng ðH3P khi nó sử dụng dầu thô làm nguồn cơ chất, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường như hàm lượng dầu thô, nhiệt ñộ, nồng ñộ NaCl và pH ñã ñược khảo sát. Kết quả ñược thể hiện ở hình 3. Có thể thấy rằng chủng ðH3P có khả năng sử dụng dầu khá cao. Nó có khả năng sinh trưởng trên nguồn cơ chất dầu thô từ 0.5% ñến 20% (hình 3A). Chúng tôi cũng thử khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn này trong môi trường chứa 30% dầu thô nhưng không thấy sự sinh trưởng của chủng này. Trong môi trường chứa 1% dầu thô thì chủng ðH3P sinh trưởng tốt nhất (hình 3A). Các nghiên cứu khác nhau trên Thế giới ñã cho thấy hàm lượng dầu ưa thích của KSF là từ 0.5% ñến 5% (Rabus et al., 1996; Kniemeyer 27 et al., 2003; Ommedal, Torsvik, 2007; Nakagawa et al., 2008). Do ñó, kết quả nghiên cứu này là minh chứng khẳng ñịnh một lần nữa khoảng hàm lượng dầu thô ưa thích cho sinh trưởng của KSF. A B C D Hình 3: Hàm lượng H2S tạo thành của chủng ðH3P trong môi trường có hàm lượng dầu thô (% v/v) (A), nhiệt ñộ (B), nồng ñộ NaCl (C) và pH (D) khác nhau 28 Như vậy khả năng sinh trưởng trong môi trường chứa dầu thô của ðH3P là khá tốt (chỉ với hàm lượng nhỏ dầu thô, các chủng này vẫn có khả năng sinh trưởng ñược). Các chủng này sinh trưởng mạnh trên cơ chất dầu thô với hàm lượng H2S sinh ra khá lớn (≥ 40 mg/l) sẽ là dấu hiệu cảnh báo sự tích tụ cao khí H2S trong các giếng dầu của Vũng Tàu, nâng cao mối nguy hại cho sức khỏe công nhân và sự ăn mòn kim loại trong các ñường ống dẫn. ðiều ñó ñặt ra một thách thức lớn cho ngành công nghiệp dầu khí, làm thế nào ñể hạn chế ñược sự sinh trưởng của chúng trong các giếng dầu. Các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng của chủng này như nguồn cơ chất (dầu thô), nguồn chất nhận ñiện tử SO4 (nước biển) và các yếu tố môi trường (nhiệt ñộ, nồng ñộ muối NaCl, pH). Nguồn cơ chất thì không thể loại bỏ vì ñây là giếng khai thác dầu. Nguồn chất nhận ñiện tử SO42- cũng khó hạn chế vì cho ñến nay phương pháp bơm ép bằng nước biển vẫn là phương pháp hiệu quả ñể khai thác thứ cấp. Vì vậy, chỉ có yếu tố thứ 3, yếu tố môi trường là có thể tác ñộng ñược. Do ñó, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (nhiệt ñộ, nồng ñộ muối NaCl, pH) ñến sinh trưởng của nó lần lượt ñược nghiên cứu. Việc hiểu biết về các yếu tố này ảnh hưởng ra sao ñến sinh trưởng của chúng sẽ cho ta phương pháp tác ñộng hiệu quả nhất, làm thay ñổi ñiều kiện sống tối ưu của ðH3P, từ ñó có thể hạn chế sự sinh trưởng của chủng này trong các giếng khoan ở Vũng Tàu. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến sinh trưởng của chủng ðH3P (hình 3B) cho thấy chủng này không sinh trưởng ñược ở 4oC và 55oC, có khả năng sinh trưởng trong dải nhiệt ñộ từ 20oC ñến 45oC và sinh trưởng tối ưu ở nhiệt ñộ 30oC. Kết quả này phù hợp với khoảng nhiệt ñộ sinh trưởng của KSF ưa ấm [Davidova et al., 2006; Cravo- Laureau et al., 2007; Ommedal, Torsvik, 2007; Madigan et al., 2009]. Chủng ðH3P phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu trên biển. Vì vậy, nồng ñộ NaCl là một trong những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp ñến sinh trưởng của nó. Do ñó, chúng tôi tiến hành thử nghiệm chủng này trong môi trường có hàm lượng dầu thô tối ưu tại nhiệt ñộ tối ưu với các nồng ñộ muối NaCl khác nhau. Kết quả phân tích (hình 3C) cho thấy chủng ðH3P có khả năng sinh trưởng trong khoảng từ 0% NaCl ñến 10% NaCl và sinh trưởng tối ưu trong môi trường chứa 2 - 3% NaCl (ñây cũng là nồng ñộ muối của nước biển khu vực giàn khoan Vũng Tàu). Chủng này tách từ giếng khoan khai thác thứ cấp bằng cách bơm ép nước biển. Vì vậy, kết quả này cho thấy chủng này có thể có nguồn gốc từ nước biển bên ngoài giếng khoan. Môi trường pH trung tính là môi trường thích hợp nhất ñối với ña số vi khuẩn. ðối với KSF, khoảng pH thích hợp nằm trong khoảng từ 6-9. Tuy nhiên, ñối với từng loại KSF lại có pH thích hợp riêng. KSF ưa ấm có pH thích hợp nằm khoảng 6.8 - 7.5 . Tuy vậy chúng vẫn có thể sống ñược nếu pH giảm xuống ñến 5 hay tăng lên ñến 10 (Dang et al., 1996; Lien, Beeder, 1997; Feio et al., 2004). Vậy chủng ðH3P có khoảng pH tối ưu cho 29 sinh trưởng giống như các KSF ưa ấm khác không? ðể trả lời câu hỏi ñó, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng này ở ñiều kiện hàm lượng dầu, nhiệt ñộ và nồng ñộ NaCl tối ưu với các pH môi trường khác nhau. Kết quả (hình 3D) cho thấy chủng ðH3P có khả năng sinh trưởng trong dải pH từ 5 ñến 8 và pH trung tính hơi kiềm (pH 7-8) là pH tối ưu cho sinh trưởng của chủng này. Kết quả này một lần nữa khẳng ñịnh lại dải pH phù hợp cho sinh trưởng của KSF ưa ấm nói chung (Lien, Beeder, 1997; Feio et al., 2004; Cravo- Laureau et al., 2004; 2007) cũng như KSF ưa ấm phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu (Dang và cs, 1996; Lại Thúy Hiền, ðặng Phương Nga, 1998). Tóm lại, các kết quả này sẽ là cơ sở giúp chúng ta có thể tạo ra một môi trường không thích hợp cho KSF, từ ñó hạn chế ñược sự sinh trưởng của vi khuẩn này trong giếng khoan. ðồng thời cũng biết ñược các ñiều kiện môi trường tối ưu cho sinh trưởng của chủng này, ñể từ ñó ñánh giá khả năng sử dụng dầu thô của chủng này trong ñiều kiện tối ưu. 4. ðánh giá khả năng sử dụng dầu thô qua biến ñổi hàm lượng dầu tổng số và thành phần dầu mỏ Chủng KSF ðH3P có khả năng sử dụng dầu thô cao. Tuy nhiên, chúng có khả năng sử dụng bao nhiêu phần trăm dầu và thành phần dầu ñược sử dụng như thế nào thì vẫn ñang là câu hỏi còn ñể ngỏ. ðể trả lời cho câu hỏi ñó, chủng này ñược nuôi cấy trong môi trường tối ưu cho khả năng sử dụng dầu thô của chúng. Sau 30 ngày thí nghiệm, hàm lượng và thành phần dầu bị biến ñổi trong mẫu thí nghiệm ñược phân tích. ðỒ THỊ PHÂN BỐ N-PARAFFINS 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 nC 6 nC 8 nC 10 nC 12 nC 14 nC 16 nC 18 nC 20 nC 22 nC 24 nC 26 nC 28 nC 30 nC 32 nC 34 nC 36 nC 38 nC 40 nC 42 nC 44 ðH3P ðC % K H Ố I L Ư Ợ N G TU YỆ T ð Ố I % K H Ố I L Ư Ợ N G TU YỆ T ð Ố I Hình 4: Thành phần n-parafin bị biến ñổi sau 1 tháng thử nghiệm của chủng KSF ưa ấm ðH3P so với ñối chứng 30 Kết quả phân tích hàm lượng dầu tổng số cho chủng ðH3P sử dụng ñược 6.5 % hàm lượng dầu tổng số. Kết quả phân tích thành phần dầu của mẫu ñối chứng và mẫu thí nghiệm ðH3P cho thấy các mẫu ðH3P có hàm lượng n-parafin cao hơn so với mẫu ñối chứng (hình 4). ðiều ñó chứng tỏ chủng này có khả năng sử dụng các thành phần dầu có hydrocarbon mạch dài C≥45, ví dụ như asphaltene. Nhờ ñó, dầu thô trở nên lỏng hơn. Do ñó, có thể sử dụng những chủng này trong việc xử lý các phân ñoạn hydrocacbon nặng (C≥45) sau khai thác. IV. KẾT LUẬN Chủng vi khuẩn khử sunphat ưa ấm ðH3P ñược phân lập từ giếng khoan dầu khí mỏ ðại Hùng, Vũng Tàu là vi khuẩn Gram âm, hình que cong, có tiên mao. Kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng này thuộc loài Desulfovibrio desulfuricans (99.8% ñộ tương ñồng). Chủng ðH3P sinh trưởng tối ưu trong môi trường chứa 1% (v/v) dầu thô, 2 - 3% NaCl (g/l), pH 8 và ở 30oC. Chủng này ñã sử dụng ñược 6.5% hàm lượng dầu thô tổng số và thành phần dầu bị chủng này phân huỷ là các n-parafin có ñộ dài C≥45 sau 1 tháng thử nghiệm ở ñiều kiện kỵ khí trong môi trường tối ưu cho vi khuẩn này sinh trưởng. Lời cảm ơn: Công trình ñược thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí trích từ ñề tài cơ sở cấp Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số CSK09- 10_7 do TS. Nguyễn Thị Thu Huyền làm chủ nhiệm và với sự cộng tác của Viện Nghiên cứu Khoa học và Triển khai, Xí nghiệp khai thác dầu khí Vũng tàu Vietsopetro; Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương; Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Trường ðại học Quốc gia Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cord-Ruwsich, R., Kleinitz, W., Widdel, F., 1987. Sulfate-reducing bacteria and their activites in oil production. Journal of Petroleum Technology, January: 97-106. 2. Cravo-Laureau, C., Labat, C., Joulian, C., Matheron, R., Hirschler-Réa, A., 2007. Desulfatiferula olefinivorans gen. nov., sp. nov., a long-chain n-alkene- degrading, sulfate-reducing bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(Pt 11): 2699-2702. 3. Cravo-Laureau, C., Matheron, R., Cayol, J.L., Joulian, C., Hirschler-Réa, A., 2004. Desulfatibacillum aliphaticivorans gen. nov., sp. nov., an n-alkane- and n- 31 alkene-degrading, sulfate-reducing bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: 77-83. 4. Dang, P.N., Dang, T.C.H., Lai, T.H., Sta-Lotter, H., 1996. Desulfovibrio vietnamensis sp. nov., a halophilic sulfate-reducing bacterium from Vietnamese oil field. Anaerobe 2: 385-392. 5. Davidova, I.A., Duncan, K.E., Choi, O.K., Suflita, J.M., 2006. Desulfoglaeba alkanexedens gen. nov., sp. nov., an n-alkane-degrading, sulfate-reducing bacterium. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56: 2737-2742. 6. Feio, M.J., Zinkevich, V., Beech, I.B., Llobet-Brossa, E., Eaton, P., Schmitt, J., Guezennec, J., 2004. Desulfovibrio alaskensis sp. nov., a sulphate-reducing bacterium from a soured oil reservoir. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: 1747-1752. 7. Kniemeyer, O., Fischer, T., Wilkes, H., Glöckner, O.F., Widdel, F., 2003. Anaerobic Degradation of Ethylbenzene by a New Type of Marine Sulfate-Reducing Bacterium. Applied and Environmental Microbiology 69 (2): 760-768. 8. Lại Thúy Hiền, ðặng Phương Nga, 1998. Một số ñặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn KSF phân lập từ mỏ dầu Bạch Hổ. Tạp chí Sinh học 20(2): 33-38. 9. Lại Thuý Hiền, Lê Phi Nga, 1992. Nghiên cứu khả năng gây ăn mòn kim loại của vi khuẩn Desulfovibrio vulgaris. Tạp chí sinh học 14(4): 26-29. 10. Lại Thuý Hiền, ðỗ Thu Phương, Lê Phi Nga, ðặng Phương Nga, Phạm Thu Thuỷ, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng, 2000. Khu hệ vi sinh vật trong khu vực dầu khí Vũng Tàu và hướng ứng dụng các vi sinh vật hữu ích. Hội nghị Sinh học Quốc gia: 77-83. 11. Lại Thúy Hiền, ðỗ Thu Phương, Vũ Phương Anh, Nguyễn Thị Thu Huyền, Kiều Hữu Ảnh, 2003. ðặc ñiểm sinh lý, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn khử sunphat ưa nhiệt phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu. Tạp chí Khoa học công nghệ 41(4): 1-7. 12. Lien, T., Beeder, J., 1997. Desulfobacter vibrioformis sp. nov., a sulfate reducer from a water-oil separation system. International Journal of Systematic Bacteriology 47(4): 1124-1128. 13. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V., Clark, D.P., 2009. Brock biology of microorganism. Pearson Education, Inc.: 141-174; 398-444. 32 14. Muyzer, G., Stams, A.J.M., 2008. The ecology and biotechnology of sulphate- reducing becteria. Nature Reviews Microbiology 6(6): 441-454. 15. Nakagawa, T., Sato, S., Fuku, M., 2008. Anaerobic degradation of p-xylene in sediment-free sulfate-reducing enrichment culture. Biodegradation 19: 909-913. 16. Nguyễn Thị Thu Huyền, Trương ðại Dương, Lại Thúy Hiền, 2010. Khảo sát khả năng sử dụng dầu thô của vi khuẩn khử sunphat phân lập từ giếng khoan dầu khí Vũng Tàu. Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1975-2010, Tiểu ban Khoa học sự sống: 208-218. 17. Ommedal, H., Torsvik, T., 2007. Desulfotignum toluenicum sp. nov., a novel toluene-degrading, sulphate-reducing bacterium isolated from an oil-reservoir model column. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(Pt 12): 2865-2869. 18. Phạm Thị Hằng, Lại Thúy Hiền, 2010. Nghiên cứu vi khuẩn Dietzia sp. A343.4 mới phát hiện trong JetA1 và ảnh hưởng của nó ñến chất lượng nhiên liệu máy bay. Tạp chí Công nghệ sinh học 8(3A): 853-863. 19. Rabus, R., Fukui, M., Wilkes, H., Widdel, F., 1996. Degradative Capacities and 16S rRNA-Targeted Whole-Cell Hybridization of Sulfate-Reducing Bacteria in an Anaerobic Enrichment Culture Utilizing Alkylbenzenes from Crude Oil. Applied and Environmental Microbiology 62(10): 3605-3613. 20. Sakiyama, Y., Nguyen, K.N.T., Nguyen, M.G., Miyadoh, S., Duong, V.H., Ando, K., 2009. Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 59: 550-554. 21. Vance, I., Thrasher, D.R., 2005. Reservoir souring: mechanisms and preventation. In Ollivier B and Magot M, eds. Petroleum microbiology. ASM press, Washongton, DC: 123-142. CRUDE OIL-ULTILIZING STRAIN DESULFOVIBRIO DESULFURICANS DH3P, A MESOPHILIC SULFATE-REDUCING BACTERIUM ISOLATED FROM DAIHUNG OIL FIELD, VUNGTAU NGUYEN THI THU HUYEN, TRUONG DAI DUONG, LAI THUY HIEN Summary: Mesophilic sulfate-reducing bacteria were well known as a factor to cause microbial metal corrosion for long time ago. Recently, they have been discovered as 33 organisms that can degrade crude oil in anaerobic condition. In the present work, it firstly reported that mesophilic sulfate-reducing bacteria isolated from Vietnam can also utilize crude oil in anoxic condition. A crude oil-utilizing, mesophilic sulfate-reducing bacterium, strain DH3P, was isolated from Daihung field, Vungtau. The cells were found to be Gram- negative, curved rod shape, and to have a flagellum. On the basis of 16S rRNA gene sequence analyses, strain DH3P is Desulfovibrio desulfuricans (99.8% identity). Optimum growth of strain DH3P in crude oil medium occurred at 1% (v/v) crude oil, 2-3% NaCl (w/v), pH 8 and 30oC. In optimal conditions, strain DH3P can consume 6.5% of crude oil total and oxidize heavy crude oil (≥ C45) for one month at anoxic condition. These results are first, important data for warning more harmful effects of sulfate-reducing bacteria on oil exploitation, utilization and preservation in Vietnam. Key words: crude oil utilization, Daihung, Desulfovibrio, DH3P, mesophilic sulfate- reducing bacteria Ngày nhận bài: 07 - 7 - 2011 Người nhận xét: PGS. TS. Lê Gia Hy