Xác định độc lực của rắn lục đuôi đỏ và tác động gây loét trên chuột

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 43 XÁC ĐỊNH ĐỘC LỰC CỦA RẮN LỤC ĐUÔI ĐỎ VÀ TÁC ĐỘNG GÂY LOÉT TRÊN CHUỘT Nguyễn Tấn Hiệp*, Nguyễn Thúy Hương**, Nguyễn Thị Nguyệt Thu***, Nguyễn Lê Trang TÓM TẮT Đặt vấn đề: Lở loét và hoại tử mô tại chỗ còn là một vấn đề mà kháng huyết thanh không đem lại hiệu lực tác dụng nào, đặc biệt với nhiễm độc nọc rắn lục đuôi đỏ. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu nào ở Việt Nam báo cáo về tác động gây loét khi bị rắn lục cắn. Mục tiêu: Xác định thành phần gây độc chính trong nọc rắn lục đuôi đỏ (Trimeresurus albolabris) và các yếu tố ảnh hưởng. Độc lực, liều gây tổn thương được tiến hành khảo sát trên chuột và hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh kháng nọc. Phương pháp nghiên cứu: Thí nghiệm trên chuột thông qua đường tiêm i.v, s.c. và giải phẫu vùng da bị xuất huyết. Kết quả: Nọc rắn lục gây xuất huyết tại chỗ được chứng minh rõ ràng, độ trầm trọng lệ thuộc vào liều nọc. Độc lực của nọc rắn lục được xác định qua đường tiêm tĩnh mạch đuôi chuột (20g ±2, N=5): LD50 = 9,27 µg nọc/chuột (0,464 µg/g). Liều nọc tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm vùng dưới da chuột MHD = 2 µg/ chuột. Hiệu lực trung hòa 3 liều nọc MHD của kháng huyết thanh là 1,175 µg (protein kháng huyết thanh). Enzyme serine protease trong nọc rắn lục đã được tinh chế qua cột Benzamidine Sepharose 6B và chiếm tỉ lệ 8,72% (g protein/100g nọc khô). Kết luận: Sự hiện diện với tỷ lệ đáng kể của serine proteinase trong nọc là nguy cơ tiềm năng hoạt hóa nhiều hệ thống tiền enzyme trong cơ thể của nạn nhân: hệ thống bổ thể, hệ thống cầm máu, gây hoại tử và biến chứng. Nghiên cứu bước đầu cho thấy tác động gây xuất huyết của serine protease và khả năng trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc của kháng huyết thanh. Từ khóa: Trimeresurus albolabris, nọc rắn lục, gây loét. ABSTRACT TRIMERESURUS ALBOLABRIS VENOM’ TOXIN STRENGTH AND NECROTIZING ACTIVITY WAS DETERMINED IN MICE Nguyen Tan Hiep, Nguyen Thuy Huong, Nguyen Thi Nguyet Thu, Nguyen Le Trang * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - No 2 - 2014: 43 - 49 Background: Local tissue necrosis is an important problem when patients was bite by Trimeresurus albolabris because treating with antiserum is not effected. There hasn’t been any study of necrotizing activity with T. albolabris bite in Vietnam. Objective: Identification of serine protease activities in Trimeresurus albolabris venom and its affecting. Venom’ toxin strength, minimum hemorrhagic dose were test of mice injected and neutralization of enzyme activities of Trimeresurus albolabris venom by antivenom. Method: Testing on mice via i.v, s.c. injection and haemorrhagic spot in mice local tissue necrosis. Results: The venom obviously causes local haemorrhage. The LD50 of the venom was determined by i.v. injections of different doses into the caudal vein of mice (20±2, N=5): LD50 = 9.27 µg (0,464 µg/g). MHD is 2.0 µg/20g. Neutralization of 3MHD (6.0 µg) needed 1,175 µg antivenom protein. The yield of Serine protease occupied 8.72% of dry venom protein. *Bệnh Viện Đại Học Y Dược CS1 ** Đại Học Bách Khoa Tp. HCM ***Viện Pasteur Tp.HCM Tác giả liên lạc: Nguyễn Tấn Hiệp ĐT: 0909338254 Email: hiep.nt@umc.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 44 Conclusion: The venom serine protease potentially activates hemostatic zymogen systems and causes local necrosis. Preliminary results showed that haemorrhagic activity of serine protease and neutralization of enzyme activities of Trimeresurus albolabris venom by antivenom. Key words: Trimeresurus albolabris, snake venom, snakebite ulcers. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam thuộc vùng có địa hình và khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho sự sinh sống, phát triển của các loài rắn nói chung và rắn độc nói riêng. Rắn độc ở Việt Nam có thể chia làm hai loại: các loài rắn thuộc họ nhỡn kính (elapidae) có nọc gây độc thần kinh (neurotoxic) và các loài rắn thuộc họ rắn lục (viperidae) có nọc gây độc hệ huyết mạch (hemotoxic). Huyết thanh kháng nọc rắn lục (Trimeresurus albolabris) và kháng một số nọc rắn nhỡn kính đã được sản xuất và thử nghiệm thành công trên bệnh nhân nhiễm độc nọc rắn(7,10). Huyết thanh kháng nọc rắn đã chứng tỏ có hiệu quả để điều trị nhiễm độc nọc rắn(1,3). Tuy nhiên, bệnh nhân thường chỉ được điều trị sau một thời gian trì hoãn (để đến trung tâm y tế). Thời gian trì hoãn là một nguyên nhân làm tăng nguy cơ gây tử vong và cũng làm tăng nguy cơ tạo các biến chứng sinh lý bệnh gây tàn phế, đặc biệt làm tăng độ trầm trọng về gây hoại tử tại chỗ(2). Nguyên nhân lở loét được quy cho các proteins gây độc trong nọc lưu tụ tại chỗ cắn, các protein đó chủ yếu là các Serine proteases, hoạt động với cơ chế xúc tác. Khi nhiễm độc nọc rắn lục, các proteins này sẽ phân hủy các thành phần của mô, phá vỡ mô, gây tổn thương cho vành mạch, làm tăng tuần hoàn máu tập trung vào vết thương và là nguyên nhân gây sưng phù, xuất huyết tại chỗ(2). Rắn lục là loài có nanh nọc độc phát triển nhất trong các loài rắn. Chấn thương và sự nhiễm khuẩn do nanh nọc độc gây nên không thể không tạo ra những đáp ứng tự bảo vệ của cơ thể nạn nhân, trong đó có sự khởi động của các yếu tố cầm máu (đa số đều là tiền serine proteinase) với sự hoạt hóa của hệ kinin- kallikrein(5). Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát Khảo sát Proteinase của nọc rắn lục đuôi đỏ và tác động gây loét trên chuột. Mục tiêu chuyên biệt 1. Xác định độc lực qua liều gây tử vong 50% số chuột thí nghiệm (LD50) của nọc rắn lục đuôi đỏ. 2. Xác định thành phần gây độc chính ở rắn lục đuôi đỏ và các yếu tố ảnh hưởng. 3. Xác định liều gây tổn thương đường kính 10mm vùng dưới da chuột (MHD). 4. Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh kháng nọc. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Vật liệu Nọc rắn lục khô do Trung tâm Nuôi trồng Nghiên cứu Chế biến Dược liệu quân khu 9, Tiền Giang cung cấp. Chuột nhắt trắng 18-20g được cung cấp từ Viện Pasteur Tp.HCM. Kháng huyết thanh kháng nọc do Viện Vắc xin Nha Trang cung cấp. Các bước tiến hành Xác định liều gây tử vong 50% số chuột thí nghiệm (LD50) của nọc rắn lục Nguyên tắc Thử nghiệm độc tính cấp này dựa trên phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 45 Nguyên tắc của thử nghiệm là tiêm một liều duy nhất thuốc thử nghiệm vào con vật với điều kiện ấn định, ghi phân suất tử vong trong một thời gian quy định. Độc lực thường được biểu thị bằng giá trị LD50 (lethal dose 50%) – liều tối thiểu gây chết 50% số động vật thí nghiệm. Chất có độc tính càng cao giá trị LD50 càng thấp. Động vật thí nghiệm trong công trình này là chuột nhắt trắng hoàn toàn khỏe mạnh, cùng giới tính, độ tuổi, cùng dòng, không mang mầm bệnh và không mang thai. Gây nhiễm + Lô đối chứng: tiêm vào chuột 0.2 mL nước muối sinh lý 0,9%. + Lô thử: tiêm vào chuột các lượng nọc và độc tố khác nhau theo cấp số nhất định sao cho trong đó chứa phân suất gây chết 0% và 100% động vật thí nghiệm. - Đọc kết quả trong 48 giờ kế từ tiêm. - Kết quả được tính theo công thức Kaber- Behrens: Với Df: liều tối thiểu làm chết tất cả thú vật trong lô; a: trị số trung bình của tổng số thú vật chết ở 2 lô kế tiếp; b: hiệu số 2 liều kế tiếp; n: số thú vật dùng ở mỗi liều. Độc lực của nọc được xác định bằng cách tiêm vào tĩnh mạch đuôi (I.V.) của chuột nhắt trắng 18-20 g. Xác định pH các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Tiến hành cho 0,2 mg nọc rắn được ủ với casein 2% và các dung dịch đệm ở các pH khác nhau tại 37°C trong 10 phút. Thêm TCA (trichloroacetic acid) 5% vào, ly tâm thu nước nổi và xác định giá trị hấp phụ quang ở 280 nm. Tinh chế serine protease trong nọc rắn lục qua cột Bezamidine Sepharose 6B Nguyên tắc Benzamidine SepharoseTM là p- aminobenzamidine cộng hóa trị với Sepharose 6B bằng phương pháp cộng hợp thông qua nhóm epoxy (một nguyên tử oxy liên kết với hai nguyên tử carbon): p- aminobenzamidine (PAB) là chất ức chế tổng hợp của trypsin dạng serine protease. Các Trypsin dạng serine protease này liên kết đặc hiệu với Benzamidine Sepharose 6B được giữ lại trên cột. Sau đó, đẩy Serine Protease ra khỏi cột bằng dung dịch đệm có tính acid mạnh. Rửa cột và bảo quản ở 4OC. Xác định tỷ lệ protein thu hồi và đánh giá kết quả tinh chế bằng điện di trên thạch polyacrylamide 12% với Sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE)(6), hoạt tính enzyme được xác định qua điện di SDS-PAGE 12%-gelatine 0,1%. Thực hiện Cho 11 mL nọc qua cột Bezamidine Sepharose 6B 3 lần. Rửa cột bằng dung dịch đệm Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,5 M, pH=7,4 cho đến khi dịch rửa không còn protein (OD280=0). Đẩy thành phần bám trên cột dung dịch glycine 50mM, pH=3.0 (đến khi dịch ra có OD280=0), trung hòa bằng Tris 1 M, pH=8. Thu enzyme cần tinh chế. Cân bằng cột với dung dịch Tris-HCl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH=7,5. Bảo quản cột ở 40C để sử dụng cho các lần tinh chế sau. Xác định liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm vùng dưới da chuột (MHD) Nọc rắn được pha loãng hàng loạt theo bậc hai từ 4-0,5 µg. Tiêm 0,1 ml vào vùng dưới da mỗi chuột (Sc). Các chuột chứng được tiêm cùng lượng nước muối sinh lý. Sau 2 giờ, giải phẫu chuột, xác định đường kính vùng xuất huyết. LD50 = Df - n abΣ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 46 Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh kháng nọc Dung dịch kháng huyết thanh được pha loãng hàng loạt theo bậc 2: 1/2-1/32. Ủ dung dịch kháng huyết thanh với nọc ở 3MHD tại 37°C trong 30 phút. Tiêm 0,1 ml vào vùng dưới da mỗi chuột (S.C). Các chuột chứng được tiêm 3MHD pha trong nước muối sinh lý. Sau 2 giờ, giải phẫu chuột, xác định đường kính vùng xuất huyết. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Độc lực của nọc rắn lục đuôi đỏ Kết quả cho thấy độc tính của nọc rắn lục đuôi đỏ ở Việt Nam LD50 = 9,27µg/chuột (chuột 18-20g). Khảo sát pH các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bảng 1: Các dung dịch đệm với pH khác nhau Dung dịch đệm pH Phosphate 0,2 M 5,5 6,5 7,5 8,0 Tris-HCl 0,2 M 7,5 8,0 8,5 9,0 Glycine 0,2 M 8,5 9,5 10 10,5 Hình 1: Các dung dịch đệm ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Trong các dung dịch đệm khác nhau, nhưng enzyme vẫn hoạt động tối ưu ở khoảng pH = 8-8,5. Tinh chế enzyme serine protease trong nọc rắn lục qua cột Bezamidine-Sepharose 6B Dung dịch nọc rắn được nạp vào cột ở pH = 7.4 với đệm Tris HCl 20mM, NaCl 0,5M; các thành phần không bám đi ra khỏi cột và serine protease được giữ lại trên cột. Đẩy serine protease ra khỏi cột bằng glycine 0,1M, pH 2,5. Xác định giá trị từng phân đoạn (1,5 mL) bằng hấp phụ quang ở 280 nm. Hình 2: Phân đoạn serine protease giải hấp từ cột Đánh giá kết quả tinh chế bằng điện di trên thạch polyacrylamide SDS-PAGE 12% và hoạt tính enzyme được xác định qua điện di SDS- PAGE 12%-gelatine 0,1%. Hình 3: Kiểm tra các thành phần sau tinh chế SDS- PAGE 12% Hàng 1, 2, 3: Serine protease sau tinh chế có xử lý DTT Hàng 4: Serine protease sau tinh chế không xử lý DTT. Hàng 6, 7, 8: Nọc rắn lục có xử lý DTT. Hàng 9, 10: Nọc rắn lục không xử lý DTT Mẫu enzyme do tinh chế cho một vạch ngang với vạch enzyme có trong nọc rắn lục, 0 0.1 4 6 8 10 12 A b s (2 8 0 n m ) pH Phosphate Tris-HCl Glycine 0 0.3 0.6 0.9 1.2 0 2 4 6 8 10 A b s2 8 0 Đoạn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 47 chứng tỏ enzyme thu được sau tinh chế là tinh sạch và nồng độ cao. Hoạt tính enzyme cũng cho kết quả tương tự. Hình 4: Kiểm tra hoạt tính enzyme sau tinh chế SDS-PAGE 12%-gelatine 0,1% Hàng 1, 2: Serine protease sau tinh chế Hàng 4: Serine protease chuẩn Hàng 5, 6, 7: Nọc rắn lục Xác định liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm vùng dưới da chuột (MHD) Liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm vùng dưới da chuột là liều cho phép ta quan sát đường kính xuất huyết rõ nhất dưới da chuột, không có biểu hiện xuất huyết trên da. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định được MHD của nọc rắn lục là 2µg. Tại nồng độ huyết thanh pha loãng 1/8 (0,5875 µg/µl) đã cho phép chứng minh khả năng trung hòa gần như hoàn toàn và tại nồng độ huyết thanh pha loãng 1/4 (1,175 µg/µl) cho thấy kháng huyết thanh hoàn toàn trung hòa được nọc rắn lục toàn phần. Hàm lượng nọc / 0,1 ml / chuột Mẫu chứng 4 µg 2 µg 1 µg 0,5 µg NaCl 0,9% Hình 5: Xác định MHD trên chuột Xác định hiệu lực trung hòa hoạt tính enzyme trong nọc toàn phần của kháng huyết thanh kháng nọc KHT 1/32 KHT 1/16 KHT 1/8 KHT ¼ KHT 1/2 3MHD Hình 6: Kháng huyết thanh trung hòa nọc rắn lục toàn phần BÀN LUẬN Trên thế giới, các loài rắn thuộc họ rắn lục (viperidae) có nọc gây độc hệ huyết mạch (hemotoxic) thường có độc lực khá cao. Theo tác giả Nget Hong Tan và cộng sự(9) nghiên cứu về độc lực nhiều loài rắn Trimeresurus ở Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ đã xác định giá trị LD50 (µg/g) như sau: T. albolabris (0,60µg/g), T. purpureomaculatus (1,27µg/g), T. samatranus (0,60µg/g), T. popeorium (1,45µg/g), T. flavoviridis (2,5µg/g), T. muscrosquamatus (1,50µg/g), T. erythrurus (2,10µg/g), T. okinavensis (5,0µg/g), T. stejnegeri (1,78µg/g), T. elegans (5,00µg/g), T. macrops (10,00µg/g), T. wagleri (1,05µg/g). Trong Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 48 nghiên cứu này, chúng tôi xác định độc lực qua liều gây tử vong 50% số chuột thí nghiệm (LD50) của rắn lục đuôi đỏ (T. albolabris) ở Việt Nam là 0.464 µg/g. Theo Kaber-Behrens, chất có độc tính càng cao giá trị LD50 càng thấp(9), điều này chứng tỏ độc lực của rắn lục đuôi đỏ ở Việt Nam trong nghiên cứu này khá cao. Benzamidine SepharoseTM là p- aminobenzamidine (PAB) là chất ức chế tổng hợp của trypsin dạng serine protease. Các Trypsin dạng serine protease này liên kết đặc hiệu với Benzamidine Sepharose 6B được giữ lại trên cột. Dung dịch nọc rắn lục được nạp vào cột ở pH = 7,4 với đệm Tris HCl 20mM, NaCl 0,5M; các thành phần không bám đi ra khỏi cột và serine protease được giữ lại trên cột. Đẩy serine protease ra khỏi cột bằng glycine 0,1M, pH 2,5. Mẫu enzyme do tinh chế cho một vạch ngang với vạch enzyme có trong nọc rắn lục, chứng tỏ enzyme thu được sau tinh chế là tinh sạch và nồng độ cao. Theo tác giả Hoffmann và cộng sự(4), tinh chế serine protease từ nọc rắn lục Bothrops atrox, nọc được pha trong đệm sodium phosphate (pH=7,5) để nạp vào cột. Khoảng pH tối ưu từng loại đệm khảo sát trên đã giúp cho lựa chọn đúng pH cho từng loại đệm tương ứng khi tinh chế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định được liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm (MHD) vùng dưới da chuột của nọc rắn lục đuôi đỏ là 2µg. Khi so sánh với nồng độ khác được tìm thấy trong nghiên cứu của Kabburalli Sunitha và cộng sự(8), khảo sát ở các loài rắn lục phổ biến ở vùng Trung Đông và Trung Á với 2MHD như sau: Echis carinatus (1µg), Echis cariatus sochureki (10µg), Echis carinatus leakeyi (5µg), Echis eceollatus (5µg), Crotalus atrox (5µg). Qua đó, liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10 mm của loài rắn lục đuôi đỏ khá thấp, chứng tỏ độc lực của nọc gây loét là khá cao so với các loài rắn cùng họ. Theo tác giả Nget Hong Tan và cộng sự(9) đã tiến hành trung hòa độc tính của nọc T. albolabris và kháng huyết thanh kháng nọc với nồng độ trung hòa như sau: đối với kháng huyết thanh kháng nọc Trimeresurus đa giá NIPM (National Institute of Preventive Medicine, Taiwan): 2,0 mg/mL (mg trung hòa/mL kháng huyết thanh), kháng huyết thanh đơn giá GPV (Thai Red Cross Society, Thailand): 1,9 mg/mL. Kháng huyết thanh NIPM được pha loãng (1:8) (0,25 mg/mL), lượng nọc sử dụng T. albolabris (3,5 µg) đủ để gây tổn thương đường kính 11mm ở chuột. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm trung hòa tại nồng độ huyết thanh pha loãng 1/8 (0,5875 mg/mL) đã cho phép chứng minh khả năng trung hòa gần như hoàn toàn và tại nồng độ huyết thanh pha loãng 1/4 (1,175 mg/mL) cho thấy kháng huyết thanh hoàn toàn trung hòa được nọc rắn lục toàn phần 3MHD (6,0 µg). Như vậy, nồng độ huyết thanh (0.392 mg/mL) đã trung hòa hoàn toàn lượng nọc T.albolabris (2,0 µg) liều tối thiểu gây xuất huyết đường kính 10mm. So sánh với thí nghiệm trên, nồng độ kháng huyết thanh để trung hòa đường kính 11 mm của tác giả Nget Hong Tan và cộng sự (9) là 0,25 mg/mL, so với thí nghiệm chúng tôi là 0,392 mg/mL. Qua đó, chứng tỏ kháng huyết thanh kháng nọc của Viện Vaccin Nha Trang có tác dụng trung hòa thành phần gây xuất huyết được thử nghiệm trên chuột. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu trên, chúng tôi xác định độc lực qua liều gây tử vong 50% số chuột thí nghiệm (LD50) của rắn lục đuôi đỏ (Trimeresurus Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 49 albolabris) ở Việt Nam là 0,464 µg/g, chiếm độc lực khá cao so với rắn lục cùng họ. Nọc độc gây xuất huyết tại chỗ đã được chứng minh rõ ràng. Sử dụng sắc ký ái lực với benzamidine đã cho phép tinh chế được serine protease để xác định tỷ lệ của các enzyme này trong nọc và xác định được khoảng pH tối ưu cho hoạt tính enzyme là 8-8,5. Do nọc rắn lục gây rối loạn đông cầm máu, xuất huyết tại chỗ nên bước đầu chúng tôi đã xác định được giá trị MHD của nọc là 2µg, liều gây xuất huyết tối thiểu đường kính 10mm. Để ngăn ngừa triệu chứng xuất huyết khi nhiễm độc nọc rắn lục, kháng huyết thanh kháng nọc có khả năng trung hòa tác động xuất huyết ở 3MHD là 1,175µg. ĐỀ XUẤT Từ những kết luận trên chúng tôi xin đưa ra một số đề suất như sau: Cần có nghiên cứu thêm phương pháp chống lại các biến chứng bệnh lý của nhiễm độc nọc rắn lục đuôi đỏ do serine protease gây nên. Cần sử dụng kháng huyết thanh kháng nọc rắn lục khi tai nạn do rắn cắn kết hợp với biện pháp chống gây loét ngay từ đầu càng sớm càng tốt. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Calmette A (1892), "Etude expérimentale du venin de Naja Tripudians ou Cobra Capel et exposé d'une méthode de neutralisation de ce venin dans l'organisme" VI (3), 160-183. 2. Chotenimitkhun R and Rojnuckarin P (2008), "Systemic antivenom and skin necrosis after green pit viper bites" Clinical toxicology, 46, 122-125. 3. Gutierrez J M, Theakston R D and Warrell D A (2006), "Confronting the neglected problem of snake bite envenoming: the need for a global partnership" PLoS medicine, 3, e150. 4. Hofmann H. and Bon C (1987), "Blood coagulation induced by the venom of Bothrops atrox. 2. Identification, purification, and properties of two factor X activators", Biochemistry, 26, 780-787. 5. Kashuba E, Bailey J, Allsup D and Cawkwell L (2013), "The kinin-kallikrein system: physiological roles, pathophysiology and its relationship to cancer biomarkers" Biomarkers: biochemical indicators of exposure, response, and susceptibility to chemicals, 18, 279-296. 6. Khow O, Chanhome L, Omori-Satoh T, Puempunpanich S and Sitprija V (2002), "A hemorrhagin as a metalloprotease in the venom of Trimeresurus purpureomaculatus: purification and characterization" Toxicon: official journal of the International Society on Toxinology, 40, 455-461 7. Lê Đức Tâm, Nguyễn Thi Kê, Lê Văn Bé, Lê Văn Hiệp và CS. (2003), "Nghiên cứu thử nghiệm trên người huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất (Naja kaouthia), huyết thanh kháng nọc rắn lục tre (Trimeresurus albolabris)", Tạp chí Y học dự phòng, tập XIII, số 6 (63). 8. Sunitha K, Hemshekhar M, Gaonkar S L, Sebastin Santhosh M, Suresh Kumar M, Basappa, et al. (2011), "Neutralization of haemorrhagic activity of viper venoms by 1-(3- dimethylaminopropyl)-1-(4-fluorophenyl)-3-oxo-1,3- dihydroisobenzofuran-5-car bonitrile " Basic & clinical pharmacology & toxicology, 109, 292-299. 9. Tan Nget Hong, Choy Sow Kuen, Chin Khon Min and Ponnudurai Gnanajothy (1994), "Cross-reactivity of monovalent and polyvalent Trimeresurus antivenoms with venoms from various species of Trimeresurus (lance-headed pit viper) snake" Toxicon: official journal of the International Society on Toxinology, 32, 849-853. 10. Trinh Xuan Kiem et al, (2008), 8th IST Asia Pacific meeting on animal, plant and microbial toxins, biotoxins from nature to human deseases. Hanoi & Halong Bay - Vietnam, In, 31, 58, 165. Ngày nhận bài báo: 21/01/2014 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 11/03/2014 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2014