Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với Enterococcus Faecalis

Số27(Tháng09/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 11212 ,(78172,7,(88 112% 2,, Trịnh Thị Hương*, Lê Văn Hưng** TÓM TẮT Enterococcus faecalis là cầu khuẩn Gram dương, thuộc vi hệ bình thường ở đường ruột, cũng có thể tìm thấy trong miệng, hầu họng và âm đạo. Tuy nhiên, E. faecalis có thể gây ra nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm nội tâm mạc, viêm màng não. Tỷ lệ E. faecalis kháng thuốc đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt là kháng vancomycin khiến cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn. Mục tiêu: Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của nano bạc đối với Enterococcus faecalis phân lập tại Bệnh viện Da liễu Trung ương. Phương pháp nghiên cứu: 30 chủng E. faecalis phân lập từ bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu trung ương được cho tiếp xúc với nano bạc ở các nồng độ và khoảng thời gian khác nhau để đánh giá khả năng tiêu diệt E. faecalis của nano bạc. Kết quả: tác dụng diệt khuẩn của nano bạc tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc. MBC của nano bạc đối với E. faecalis ngay sau khi tiếp xúc, sau 15 phút, 1 giờ, 2 giờ và 4 giờ lần lượt là 62,5mg/L; 31,25mg/L; 31,25mg/L; 15,625mg/L; 3,95mg/L. Kết luận: Nano bạc có hiệu quả diệt khuẩn rất cao, ngay cả ở nồng độ thấp nếu thời gian tiếp xúc đủ dài. Từ khóa: nano bạc, Enterococcus faecalis, Bệnh viện Da liễu trung ương. * Bộ môn Vi sinh-Ký sinh trùng lâm sàng ** Bộ môn Da liễu, Trường Đại học Y Hà Nội I. ĐẶT VẤN ĐỀ Enterococcus faecalis là cầu khuẩn Gram dương, thuộc vi hệ bình thường ở đường ruột, cũng có thể tìm thấy trong miệng, hầu họng và âm đạo [1]. Tuy nhiên, khi suy giảm miễn dịch hoặc gặp điều kiện thuận lợi E. faecalis có thể gây ra nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm nội tâm mạc, viêm màng não [2]. Tỷ lệ E. faecalis kháng thuốc đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt là kháng vancomycin khiến cho việc điều trị gặp rất nhiều khó khăn. Bạc được biết đến như một kim loại có khả năng diệt khuẩn từ khá sớm. Trong lịch sử, dung dịch keo bạc được sử dụng để điều trị các bệnh nấm trên da, các vết thương, vết bỏng, các bệnh răng miệng. Giữa thế kỷ XX, sự xuất hiện của DALIỄUHỌCSố27(Tháng09/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC thuốc kháng sinh với hiệu lực kháng khuẩn mạnh đã làm cho mức độ sử dụng các thuốc có nguồn gốc từ bạc giảm dần. Tuy nhiên, những năm gần đây do sự xuất hiện và gia tăng nhanh chóng của nhiều vi khuẩn kháng thuốc, tính năng kháng khuẩn của bạc lại được chú ý. Các thuốc có nguồn gốc từ bạc có phổ kháng khuẩn rộng và rất hiếm khi bị vi khuẩn kháng tác dụng [3]. Công nghệ nano xuất hiện đã đem lại nhiều ý nghĩa to lớn, thúc đẩy sự phát triển trong mọi lĩnh vực đặc biệt là y học. Công nghệ nano giúp chia nhỏ phân tử bạc ở kích thước rất nhỏ, nano mét, làm tăng diện tích bề mặt của bạc và nhờ đó khả năng diệt khuẩn được tăng lên gấp nhiều lần. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy, nano bạc có hoạt tính kháng khuẩn cao trên cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm như Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholerae [4],[5]. Hiện nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu thực hiện trên E. faecalis. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn Enterococcus faecalis”. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng 30 chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis được phân lập từ bệnh phẩm mủ, dịch viêm của bệnh nhân mắc hội chứng tiết dịch âm đạo đến khám tại Bệnh viện Da liễu Trung ương. 2.2. Vật liệu - Dung dịch nano bạc có nồng độ 500mg/L được cung cấp bởi Phòng Công nghệ thân môi trường, Viện Công nghệ môi trường. Các hạt nano bạc có kích thước 10-30 nm được điều chế bằng phương pháp dùng Sodium Borohydride (NaBH4) khử dung dịch bạc nitrat. - Môi trường thạch máu, tủ ấm CO2 (Thermo), tủ an toàn sinh học, tủ lạnh thường, tủ âm sâu, máy đo độ đục (BioMérieux), máy vortex (IKA), bộ nhuộm Gram. 2.3. Phương pháp nghiên cứu: mô tả cắt ngang, thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm trong Labo 2.3.1. Chuẩn bị chủng E. faecalis 30 chủng E. faecalis thử nghiệm được phân lập từ bệnh phẩm mủ, dịch viêm của bệnh nhân có hội chứng tiết dịch âm đạo dựa trên các tiêu chuẩn: - Nhuộm soi: trên tiêu bản nhuộm Gram, vi khuẩn có hình cầu, bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi. - Nuôi cấy: sau 18-24 giờ nuôi cấy trên thạch máu E. faecalis tạo thành những khuẩn lạc màu xám, dạng S, có đường kính khoảng 1mm, gây tan máu hoàn toàn. Bắt khuẩn lạc nhuộm soi thấy cầu khuẩn bắt màu Gram dương, xếp thành chuỗi. Hình 2.1. Cấy chuyển E. faecalis trên thạch máu - Test Catalase: âm tính. - Phản ứng xác định nhóm liên cầu: âm tính. - Thử nghiệm Bile Esculin: dương tính. Các chủng E. faecalis sau khi phân lập được bảo quản trong môi trường Skim milk ở nhiệt độ Số27(Tháng09/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC -800C. Trước thử nghiệm, cấy chuyển 2 lần các chủng lên thạch máu để kiểm tra và ổn định các đặc tính sinh học. Sau khi kiểm tra, tiến hành pha huyền dịch vi khuẩn để thực hiện thử nghiệm. 2.3.2. Chuẩn bị dung dịch nano bạc với các nồng độ khác nhau Dung dịch nano bạc được pha loãng ở 10 nồng độ là 500mg/L; 250mg/L; 125mg/L, 62,5mg/ L;31,25mg/L; 15,625mg/L; 7,81mg/L; 3,95mg/L; 1,97mg/L; 0,95mg/L lần lượt tương ứng với các hệ số pha loãng 1, ½, ¼, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, 1/512. Ống chứng: cho vào 2ml nước cất vô trùng. Hình 2.2. Pha loãng dung dịch nano bạc ở các nồng độ khác nhau 2mlddNanobạc 2.3.3. Đánh giá khả năng diệt khuẩn của nano bạc đối với E. faecalis Pha hỗn hợp của huyền dịch vi khuẩn và dung dịch nano bạc ở các nồng độ khác nhau, điều chỉnh độ đục đạt 0,5 McFarland (tương đương 108 CFU/ml). Vortex để trộn đều hỗn hợp. Cấy trải 100µl hỗn hợp lên môi trường thạch máu, nuôi cấy ở 370C, 5-7%CO2. Đối chứng chỉ có nước cất vô trùng và khuẩn lạc của vi khuẩn E. faecalis. Tác dụng diệt khuẩn được đánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc của E. faecalis còn mọc trên môi trường so với nồng độ vi khuẩn ban đầu sau các khoảng thời gian tiếp xúc với dung dịch nano bạc. Số lượng khuẩn lạc của hỗn hợp ở từng nồng độ và thời gian tiếp xúc mọc trên đĩa nuôi cấy được tính trung bình trên 30 chủng. 2.3.4. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với E. faecalis Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimum Bactericidal Concentration-MBC) là nồng độ thấp nhất làm giảm 99,9% lượng vi khuẩn ban đầu. Trong nghiên cứu này, MBC của dung dịch nano bạc là nồng độ ở ống mà khi cấy lên môi trường không có khuẩn lạc mọc. Số liệu được xử lý theo chương trình Excell 2016. 3. KẾT QUẢ 3.1. Đánh giá khả năng diệt khuẩn của nano bạc đối với vi khuẩn Enterococcus faecalis Tại mỗi nồng độ và thời gian ủ cụ thể, hỗn hợp E. faecalis và dung dịch nano bạc được cấy lên môi trường thạch máu và ủ ở 370C, 5-7% CO2. Sau 24 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc mọc và tính ra giá trị trung bình trên 30 chủng. DALIỄUHỌCSố27(Tháng09/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC Biểu đồ 3.1 cho thấy ở nồng độ thấp và tiếp xúc trong thời gian ngắn, nano bạc đã có khả năng tiêu diệt được E. faecalis. Tác dụng diệt khuẩn của nano bạc tỷ lệ thuận với nồng độ và thời gian tiếp xúc. Ở nồng độ 31,25mg/L, nano bạc đã có khả năng tiêu diệt được trên 90% E. faecalis ngay khi vừa tiếp xúc. Ở nồng độ 3,91 mg/L, nano bạc có khả năng tiêu diệt 96,67% và 100% E. faecalis khi ủ tương ứng trong 2 giờ và 4 giờ. Biểu đồ 3.1. Khả năng diệt khuẩn của nano bạc đối với các chủng E. faecalis theo thời gian tiếp xúc Số27(Tháng09/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC 3.2. Xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với vi khuẩn Enterococcus faecalis Sau 24 giờ nuôi cấy, với thời gian tiếp xúc 0 giờ, 15 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ thì lần lượt tại các ống có nồng độ nano bạc là 62,5mg/L; 31,25mg/L; 31,25mg/L; 15,625mg/L; 3,95mg/L không phát hiện thấy khuẩn lạc của cả 30 chủng E. faecalis nghiên cứu xuất hiện trên môi trường. Nhóm nghiên cứu đã xác định được nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với E. faecalis theo 5 khoảng thời gian tiếp xúc (Bảng 3.1). Thời gian 0 giờ 15 phút 1 giờ 2 giờ 4 giờ MBC (mg/L) 62,5 31,25 31,25 15,625 3,91 Bảng 3.1. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với E. faecalis theo thời gian tiếp xúc 4. BÀN LUẬN 4.1. Khả năng diệt khuẩn của nano bạc đối với Enterococcus faecalis Hiệu quả diệt khuẩn của nano bạc được đánh giá dựa trên số lượng khuẩn lạc mọc sau 24 giờ nuôi cấy so với số lượng vi khuẩn ban đầu. Mẫu chứng được thực hiện đồng thời để kiểm soát chất lượng của 30 chủng E. faecalis nghiên cứu, môi trường nuôi cấy và thao tác của người thực hiện. Enterococcus faecalis là vi khuẩn có ở đường ruột của người khỏe mạnh, cũng có thể tìm thấy trong miệng, cổ và âm đạo. Tuy nhiên, khi suy giảm miễn dịch E. faecalis có thể gây ra nhiều nhiễm trùng nghiêm trọng như nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn tiết niệu, viêm nội tâm mạc, viêm màng não. Tỷ lệ E. faecalis kháng thuốc đang gia tăng nhanh chóng, đặc biệt là kháng vancomycin đặt ra thách thức lớn cho các nhà lâm sàng. Theo nghiên cứu của Trần Thị Thanh Nga tại Bệnh viện Chợ Rẫy (2013), E. faecalis là nguyên nhân thứ hai gây nhiễm trùng tiết niệu với tỷ lệ kháng vancomycin của vi khuẩn này là 4,1% [6]. Cho đến nay, các nhà khoa học đã đưa ra nhiều thuyết về cơ chế diệt khuẩn của nano bạc, trong đó lý thuyết hấp thụ thuyết phục hơn cả. Bản chất của thuyết này là ở chỗ tế bào vi khuẩn bị vô hiệu hóa là do kết quả của quá trình tương tác tĩnh điện giữa bề mặt mang điện tích âm của tế bào và ion Ag+ được hấp phụ lên đó, các ion này sau đó xâm nhập vào bên trong tế bào vi khuẩn và vô hiệu hóa chúng. Với kích thước nhỏ bé, các hạt nano bạc có diện tích bề mặt lớn để tương tác lớn, từ đó giúp cho nano bạc có hiệu quả diệt khuẩn vượt trội. Kết quả thử nghiệm của nhóm nghiên cứu cho thấy, nano bạc đã có khả năng tiêu diệt E. faecalis ngay khi vừa tiếp xúc. Ở nồng độ 31,25mg/L, nano bạc đã có khả năng tiêu diệt được trên 90% E. faecalis ngay khi vừa tiếp xúc (<200 khuẩn lạc mọc). Khi tăng thời gian tiếp xúc thì tác dụng diệt khuẩn của nano bạc tăng mạnh. Ở nồng độ 7,81mg/L, trung bình trên 30 chủng có <200 khuẩn lạc mọc và ở nồng độ 3,95mg/L có <20 khuẩn lạc mọc. Theo nghiên cứu của Nguyễn Như Lâm và cộng sự (2009), khả năng tiêu diệt của nano bạc đối với cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, gồm S. aureus, E. coli, P. aeruginosa rất tốt [4],[7]. Nhiều nghiên cứu khác cho thấy, nano bạc có tác dụng chống nấm nhanh và hiệu quả DALIỄUHỌCSố27(Tháng09/2018) NGHIÊNCỨUKHOAHỌC trên nhiều loài phổ biến như Aspergillus, Candida và Saccharomyces [8]. 4.2. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu của nano bạc đối với Enterococcus faecalis Kết quả thử nghiệm cho thấy MBC của nano bạc đối với E. faecalis ngay sau khi tiếp xúc, sau 15 phút, 1 giờ, 2 giờ, 4 giờ lần lượt là 62,5mg/L; 31,25mg/L; 31,25mg/L; 15,625mg/L; 3,95mg/L. Năm 2015, Ramesh Krishnan và cộng sự đã xác định MBC của nano bạc đối với E. faecalis sau khi tiếp xúc trong 24 giờ là 5mg/L [9]. Nghiên cứu của Ramesh Krishnan đã sử dụng nano bạc với kích thước hạt 45-50nm, lớn hơn kích thước hạt của chúng tôi (10-30nm). Do đó, MBC mà nhóm nghiên cứu đã xác định ở nồng độ thấp hơn trong khi tiếp xúc với thời gian ngắn hơn. Tác dụng diệt khuẩn vượt trội của nano bạc đã được nhiều nhà khoa học chứng minh. Với kích thước nhỏ bé (tương đương với kích thước virus), các hạt nano bạc có thể xâm nhập và tích lũy bên trong tế bào của sinh vật sống. Tuy nhiên, bạc có độc tính rất thấp, ít tác dụng phụ, chỉ 2-4% lượng bạc khi ăn phải được giữ lại trong mô. Nghiên cứu của Nguyễn Như Lâm và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng ở nồng độ 5000 ppm, dung dịch nano bạc không gây ra nhiễm độc đáng kể nào trên chuột nhắt trắng thử nghiệm [7]. Độc tính phổ biến của bạc được quan sát thấy là hiện tượng da bị nhuộm màu xám, xanh xám (argyria) xảy ra khi sử dụng sản phẩm chứa bạc với lượng lớn và trên diện rộng. 5. KẾT LUẬN Nano bạc có khả năng diệt khuẩn rất tốt, MBC của nano bạc đối với Enterococcus faecalis khi tiếp xúc trong 4 giờ là 3,95mg/L. Trong chuyên ngành Da liễu, vi khuẩn E. faecalis gây ra nhiều các nhiễm trùng như: viêm âm hộ, âm đạo, hội chứng tiết dịch niệu đạo, âm đạonhư vậy, tác dụng của nano bạc sẽ mở ra hướng đi mới: sử dụng các dung dịch, thuốc kháng sinh, băng vệ sinh, bỉm có nano bạc để điều trị các bệnh nhiễm trùng. Ngoài ra, có thể ứng dụng nano bạc vào trong sản xuất các miếng dán, kem trị vết bỏng, vết thương, chất khử mùi và nhiều sản phẩm khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ryan KJ, Ray CG.(2004). Sherris Medical Microbilogy (4th). McGraw Hill.pp 294-295. 2. Richard A. Harvay. (2013). Microbilogy (3th). pp 87-88. 3. Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM.(2010). Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications. Trends Biotechnol. 2010 Nov; 28(11):580-8. 4. Feng QL, et al.(2000). A mechanistic study of the antibacterial eect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J Biomed Master Res 52: 662-668. 5. Trần Thị Ngọc Dung, Ngô Quốc Bưu, Nguyễn Hoài Châu, Nguyễn Vũ Trung. (2009). Nghiên cứu hiệu lực khử khuẩn của nano bạc đối với phẩy khuẩn Vibrio cholerae gây bệnh tả. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. 6. Trần Thị Thanh Nga. (2014). Tác nhân gây nhiễm trùng tiểu và tình hình đề kháng kháng sinh tại bệnh viện Chợ Rẫy 2013. Tạp chí Nghiên cứu Y học, tập 18, phụ bản số 4/2014, Tr 119-122. 7. Nguyễn Như Lâm, Nguyễn Gia Tiến, Trương Thu Huyền, Nguyễn Hoài Châu, Trần Thị Ngọc Dung.(2009). Nghiên cứu nồng độ diệt khuẩn tối Số27(Tháng09/2018)DALIỄUHỌC NGHIÊNCỨUKHOAHỌC thiểu và độc tính cấp tính của dung dịch nano bạc. Tạp chí Học Thảm Học và Bỏng. 8. Wright JB, et al.(1999). Ecacy of topical silver against fungal burn wound pathogens. 1999 Aug;27(4):344-50. 9. Krishnan R, Arumugam V, Vasaviah SK.(2015). The MIC and MBC of Silver Nanoparticles against Enterococcus faecalis – A Facultative Anaerobe. J Nanomed Nanotechnol 6:285. SUMMARY DETERMINATION OF MINIMAL BACTERICIDAL CONCENTRATION OF SILVER NANOPARTICLES TO ENTEROCOCCUS FAECALIS Enterococcus faecalis is Gram positive coccus, commensal microorganism in the intestine of human and also found in oral cavity, oropharynx and vagina. However, E. faecalis can cause some severe infections such as sepsis, genital infection, endocarditis and meningitis. E. faecalis is increasing its resistance to antibiotics, especially to vancomycin, causing many diculties for treatment. Purpose: to determine the minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles to E. faecalis isolated in National hospital of Dermatology and Venereology. Method: E. faecalis was isolated from 30 patients with vaginal discharge syndrome who attended National hospital of Dermatology and Venereology. 30 isolates were contacted silver nanoparticles at dierent concentrations and durations to evaluate the eect of silver nanoparticles. Results: bactericidal eect of silver nanoparticles is directly proportional to concentration and contacting time period. MBCs of silver nanoparticles to E. faecalis immediately, after 15 minutes, 1 hour, 2 hours and 4 hours were 62.5mg/L, 31.25mg/L, 31.25mg/L, 15.625mg/L and 3.95mg/L, respectively. Conclusions: bactericidal eect of silver nanoparticles was high, even at low concentration if contacting time period is long enough. Key word: silver nanoparticle, Enterococcus faecalis, National hospital of Dermatology and Venereology.