Xây dựng qui trình định lượng và khảo sát độ ổn định của thuốc bột Cefuroxim

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 45 XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA THUỐC BỘT CEFUROXIM Nguyễn Thị Vương Thảo*, Trịnh Thị Thu Loan** TÓM TẮT Mục tiêu: Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng cefuroxim và khảo sát độ ổn định của thuốc bột cefuroxim. Phương pháp: Xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC với đầu dò PDA định lượng cefuroxim trong chế phẩm thuốc bột. Khảo sát độ ổn định của thuốc bột cefuroxim ở những điều kiện bảo quản khác nhau. Kết quả: Phương pháp HPLC với đầu dò PDA, cột C18 pha đảo, pha động gồm dung dịch đệm phosphat pH 4:Acetonitril (70:30), tốc độ dòng 1 ml/ phút, bước sóng phát hiện 280 nm. Khoảng nồng độ tuyến tính 10- 100 μg/ ml, phương trình hồi qui ŷ = 53504x với R2 = 0,9999, P < 0,005. Phương pháp cho thấy có sự tuyến tính trong khoảng nồng độ khảo sát, đạt độ chính xác và độ đúng. Về độ ổn định, hàm lượng cefuroxim trong chế phẩm từ 3 lô thuốc bột liên tiếp không thay đổi sau 24 tháng được bảo quản ở 30 oC. Tuổi thọ của thuốc được xác định là 24 tháng được bảo quản dưới 30 oC. Kết luận: Phương pháp HPLC đơn giản và chính xác, có thể được áp dụng để định lượng cefuroxim trong quá trình theo dõi độ ổn định của thuốc bột cefuroxim. Độ ổn định của thuốc bột cefuroxim đã được khảo sát ở 2 điều kiện bảo quản khác nhau. Tuổi thọ của thuốc bột cefuroxim được xác định là hai năm được bảo quản dưới 30oC. Từ khoá: cefuroxim, độ ổn định, tuổi thọ. ABSTRACT DETERMINATION OF CEFUROXIME AND ESTIMATION OF ITS STABILITY IN POWDER Nguyen Thi Vuong Thao, Trinh Thi Thu Loan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 45 - 49 Objective: The aim of this study was to develop a method for determination of cefuroxime and estimation of its stability in powder. Methods: A reversed-phase high performance liquid chromatographic method (HPLC) were described for the determination of cefuroxime in pharmaceutical preparations. The stability of cefuroxime powder was estimated at accelerated and long-term conditions. The shelf-life of cefuroxime powder was estimated by van’t Hoff equation. Results: The HPLC method depends upon using a resersed phase C18 column at ambient temperature with a mobile phase consisting of phosphate buffer solution pH 4:Acetonitril (70:30) at a flow rate 1ml.min-1. Quantitation was achieved by PDA detection at 280 nm. Calibration curve was linear over the concentration range 10-100 μg/ ml (R2 = 0.9999, RSD = 0.95%, recovery = 100.11%). The HPLC method showed good linearity, precision and accuration. Cefuroxime powder stabled after 24 months at 30 oC. The shefl-life of cefuroxime powder is 24 months storaged at below 30 oC. Conclusion: The HPLC method was successfully applied to assay of cefuroxime powder for oral suspension. The procedure was rapid, simple and suitable for quality control applications. The shefl-life of cefuroxime powder *Công ty Glomed, **Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS. Trịnh Thị Thu Loan ĐT: 0918256642 Email: trinhthithuloan@uphcm.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 46 is 24 months storaged at below 30 oC. Key words: cefuroxime, stability, shelf-life. ĐẶT VẤN ĐỀ Cefuroxim là một kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ 2, có phổ kháng khuẩn rộng, được dùng nhiều trong điều trị những bệnh nhiễm trùng(5,4). Cefuroxim được điều chế dưới nhiều dạng chế phẩm như viên để uống, bột pha hỗn dịch uống, dung dịch tiêm. Trong đó bột pha hỗn dịch uống là dạng thuốc thích hợp cho trẻ em. Để đảm bảo chất lượng của thuốc trong suốt quá trình bảo quản, lưu thông phân phối và sử dụng, độ ổn định của thuốc phải được công bố khi đăng ký lưu hành sản phẩm(2,1). Vì vậy, mục tiêu của đề tài này là xây dựng qui trình định lượng và khảo sát độ ổn định của chế phẩm thuốc bột cefuroxim pha hỗn dịch uống nhằm xác định tuổi thọ của thuốc và cung cấp dữ liệu cho hồ sơ đăng ký thuốc. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Thuốc bột cefuroxim pha hỗn dịch uống hàm lượng 125 mg. Nơi nghiên cứu bào chế: Bộ môn Bào Chế, khoa Dược - ĐH Y Dược TP.HCM. Ba lô thuốc bột được sử dụng trong nghiên cứu độ ổn định là lô 110908, lô 130908 và lô 230908. Hóa chất, dung môi Chất chuẩn: cefuroxim axetil, số lô: QT126 031007, hàm lượng 98,18% tương ứng 81,82% cefuroxim (Viện Kiểm Nghiệm thuốc TP.HCM); natri dihydrophosphat, natri dihydro phosphat đạt tiêu chuẩn dùng trong phân tích kiểm nghiệm (Prolabo); acetonitril và methanol đạt tiêu chuẩn dủng cho HPLC (Merck). Thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) WATERS 600E (Mỹ). Tủ vi khí hậu CARON (Mỹ), máy đo pH INOLAB pH 720 (Đức). Phương pháp nghiên cứu Xây dựng qui trình định lượng cefuroxim bằng phương pháp HPLC Cefuroxim axetil là một hỗn hợp hai đồng phân quang học không đối quang A và B. Hai đồng phân này có thời gian lưu khá gần nhau, vì vậy, điều kiện sắc k ý được khảo sát sao cho hệ số phân giải giữa hai đỉnh của đồng phân A và B không nhỏ hơn 2. Do cefuroxim axetil có tính acid yếu (pKa = 4,7) và phân cực nên điều kiện sắc ký được chọn là cột pha đảo, pha động gồm acetonitril và dung dịch đệm phosphat pH 4. Phương pháp sẽ được thẩm định và áp dụng trong khảo sát độ ổn định của thuốc bột cefuroxim. Mẫu thuốc bột cũng được bảo quản ở nhiệt độ cao (55oC) để tạo sản phẩm phân hủy nhằm chứng minh tính đặc hiệu của qui trình phân tích ngay khi có sự hiện diện của sản phẩm phân hủy trong mẫu. Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác một lượng cefuroxim axetil chuẩn tương đương 50 mg cefuroxim cho vào bình định mức 100 ml, thêm 10 ml methanol, lắc hòa tan, thêm dung dịch đệm phosphat pH 4 đến vạch. Lắc đều. Dung dịch chuẩn định lượng: Hút chính xác 10 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm phosphat pH 4 đến vạch. Lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dung dịch thử: Cân chính xác một lượng bột thuốc tương ứng với 50 mg cefuroxim từ 10 gói thuốc bột đã được nghiền trộn kỹ, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 30 ml methanol siêu âm trong 3 phút, bổ sung vừa đủ bằng dung dịch đệm phosphat pH 4. Lắc đều. Lọc (bỏ 10 ml dung dịch đầu), hút chính xác 10 ml dịch lọc cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung dung dịch đệm pH 4 vừa đủ. Lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Bơm mẫu chạy sắc ký. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 47 Thẩm định phương pháp định lượng (HPLC) Phương pháp được thẩm định về tính phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng theo nguyên tắc chung. Khảo sát độ ổn định của thuốc bột cefuroxim Để khảo sát độ ổn định, ba lô thuốc bột cefuroxim liên tiếp được bảo quản ở những điều kiện qui định. Các chỉ tiêu chất lượng được dùng để đánh giá độ ổn định của thuốc là cảm quan, hàm lượng nước, pH, hàm lượng cefuroxim và độ hòa tan. Tuổi thọ thực của thuốc được xác định tại thời điểm hàm lượng hoạt chất giảm đến giới hạn dưới theo qui định khi được bảo quản ở điều kiện dài hạn. Trong trường hợp này, tuổi thọ thực của thuốc được xác định khi hàm lượng cefuroxim giảm còn 90% so với hàm lượng nhãn dưới điều kiện bảo quản 30 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH. Tuy nhiên, để phục vụ hồ sơ đăng ký thuốc, tuổi thọ của thuốc có thể được ước tính theo nguyên lý van’t Hoff từ kết quả nghiên cứu độ ổn định ở 40 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Thẩm định phương pháp HPLC định lượng cefuroxim Điều kiện sắc ký để định lượng cefuroxim đã được xác định. Hai đỉnh cefuroxim axetil A và B tách hoàn toàn với hệ số phân giải lớn hơn 2, đỉnh cefuroxim đối xứng. Hình 1. Sắc ký đồ của cefuroxim axetil chuẩn (a), cefuroxim axetil trong mẫu thử (b) và mẫu thử được bảo quản ở 55 oC. Điều kiện sắc k ý: Cột Gemini-NX, pha đảo, C18 (4,5× 50 mm, 5 μm). Pha động: Đệm phosphat pH 4:Acetonitril (70:30 tt/tt). Tốc độ dòng: 1 ml/ phút. Bước sóng phát hiện: 280 nm. Thể tích tiêm mẫu: 20 μl. Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. Bảng 1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của qui trình định lượng trên dung dịch mẫu chuẩn Tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn (n = 6) Thời gian lưu (phút) Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Giá trị thống kê Đỉnh B Đỉnh A Tổng diện tích đỉnh (AU) Đỉnh B Đỉnh A Hệ số phân giải Đỉnh B Đỉnh A X 12,72 14,25 2590037 1,08 1,07 2,30 7303 7513 SD 0,04 0,04 12933 0,01 0,02 0,02 143,56 58,21 RSD (%) 0,31 0,25 0,50 0,66 1,59 0,74 1,97 0,77 Bảng 2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của qui trình định lượng trên dung dịch mẫu thử Tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử (n = 6) Thời gian lưu (phút) Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Giá trị thống kê Đỉnh B Đỉnh A Tổng diện tích đỉnh (AU) Đỉnh B Đỉnh A Hệ số phân giải Đỉnh B Đỉnh A X 13,08 14,59 2605938 1,11 1,08 2,33 7303 7513 SD 0,07 0,13 18143,95 0,01 0,04 0,03 143,56 58,21 RSD (%) 0,53 0,89 0,70 0,48 4,06 1,29 1,97 0,77 (c) (a) (b) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 48 Bảng 3. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của qui trình định lượng trên dung dịch mẫu thử được bảo quản ở 55 oC Tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử (n = 6) Thời gian lưu (phút) Hệ số bất đối Số đĩa lý thuyết Giá trị thống kê Đỉnh B Đỉnh A Tổng diện tích đỉnh (AU) Đỉnh B Đỉnh A Hệ số phân giải Đỉnh B Đỉnh A X 12,945 14,45 1713062 1,10 1,06 2,35 7317 7832 SD 0,03 0,03 11671,06 0,04 0,01 0,03 114,38 124,85 RSD(%) 0,22 0,19 0,68 0,88 0,59 1,13 1,56 1,59 Kết quả cho thấy hệ số bất đối trung bình của đỉnh cefuroxim axetil B và A khoảng 1, hệ số phân giải lớn hơn 2, số đĩa lý thuyết lớn hơn 5000. Giá trị RSD của các thông số sắc ký của cefuroxim axetil trong tất cả các mẫu thử đều nhỏ hơn 2%. Vậy qui trình định lượng cefuroxim trong thuốc bột đạt tính phù hợp hệ thống. Bảng 4. Kết quả về độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng của phương pháp Yêu cầu thẩm định Kết quả Độ tuyến tính Nồng độ 10-100 μg/ ml Phương trình hồi qui: yˆ = 53504,5x (P<0,0005) Hệ số tương quan R2 = 0,9999 Độ chính xác (RSD%, n = 6) 1,00% Độ đúng (Tỉ lệ phục hồi, n = 9) 100,04% Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ khảo sát; phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác cho định lượng cefuroxim với RSD = 1%; tỉ lệ phục hồi nằm trong giới hạn 98-102%. Vậy qui trình định lượng cefuroxim đạt tính phù hợp hệ thống, độ đúng và độ chính xác theo đúng qui định(3,6). Khảo sát độ ổn định của thuốc bột cefuroxim Kết quả cho thấy hàm lượng cefuroxim của những mẫu nghiên cứu độ ổn định dưới điều kiện 40 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH giảm theo thời gian bảo quản dẫn đến độ hòa tan của thuốc cũng giảm vì độ hòa tan được tính theo hàm lượng nhãn. Bảng 5. Kết quả về tính chất sản phẩm của 3 lô thuốc sau 6 tháng được bảo quản ở 40 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH Độ ổn định ở điều kiện 40 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH Kết quả Chỉ tiêu Mức chất lượng Lô 110908 Lô 130908 Lô 230908 Cảm quan Bột trắng hoặc trắng ngà, khô tơi, mùi thơm Ngà sậm Ngà sậm Ngà sậm Hàm lượng nước ≤ 6% Đạt (4,42%) Đạt (4,87%) Đạt (4,01%) pH 3,5-7,0 Đạt (5,70) Đạt (5,74) Đạt (5,65) Hàm lượng cefuroxim (%) 90-110% hàm lượng nhãn 95,18 95,65 96,39 Độ hòa tan (%) Không nhỏ hơn 60% sau 30 phút 75,12 74,53 74,94 Tuổi thọ của thuốc được ước tính theo phương trình van’t Hoff và được xác định là 24 tháng (2 năm) khi được bảo quản ở điều kiện 30 ± 2 oC/ 75±5% RH. Bảng 6. Kết quả về tính chất sản phẩm của 3 lô thuốc sau 24 tháng được bảo quản ở 30 ± 2 oC/ 75±5% RH Kết quả Chỉ tiêu Mức chất lượng Lô 110908 Lô 130908 Lô 230908 Cảm quan Bột trắng hoặc trắng ngà, khô tơi, mùi thơm Ngà Ngà Trắng Hàm lượng nước ≤ 6% Đạt (4,76%) Đạt (4,74%) Đạt (4,62%) pH 3,5-7,0 Đạt (5,73) Đạt (5,71) Đạt (5,73) Hàm lượng cefuroxim (%) 90-110% hàm lượng nhãn 100,68 101,32 100,61 Độ hòa tan (%) Không nhỏ hơn 60% sau 30 phút 77,27 77,29 77,41 Kết quả cho thấy sau 24 tháng được bảo quản ở điều kiện 30 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH, tất cả các chỉ tiêu chất lượng của thuốc đều đạt. Tuy Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 49 nhiên, cảm quan của 2 lô 110908 và 130908 trở nên ngà. Trong khi đó, nếu được bảo quản ở 25 ± 2 oC/ 75 ± 5% RH tất cả các chỉ tiêu chất lượng của thuốc từ 3 lô nghiên cứu độ ổn định đều đạt. Vì vậy tuổi thọ thực của thuốc được đề nghị là 24 tháng, được bảo quản ở nhiệt độ dưới 30oC. KẾT LUẬN Phương pháp HPLC đơn giản, nhạy, đạt độ chính xác, độ đúng đáp ứng yêu cầu cho việc ứng dụng để định lượng cefuroxim trong thuốc bột. Tuổi thọ của thuốc bột cefuroxim được đề nghị là 2 năm được bảo quản ở nhiệt độ dưới 30oC. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. ICH Harmonised Tripartite guideline (2005), Stability data package for registration applications in climatic zones III and IV, Q1F. 2. ICH Harmonised Tripartite guideline (2005), Stability Testing of new Drug Substances and Products, QI A, pp. 1-25. 3. Ivanovic I, Zivanovic L and Zecevic M (2006), A stability indicating assay method for cefuroxime axetil and its application to analysis of tablets exposed to accelerated stability test conditions, journal of chromatography A, 1119: 209-215. 4. Palacios G. C., Gonzalez S. N., Perez F. L., Cuevas S. F. and Solorzano S. F. (2002), Cefuroxime vs a Dicloxacillin/Chloramphenicol Combination for the Treatment of Parapneumonic Pleural Effusion and Empyema in Children, Pulmonary Pharmacology & Therapeutics, 15(1), 17-23. 5. Rastegar AL, Alinejad F., Rahmani M., Mohamadi H., Mostafavi H., Farzandy G. and Alaghehbandan R. (2007), Comparison of cefuroxime and amoxicillin/clavulanate in the treatment of acute sinusitis in a sample of Iranian population, Int. J. of Antimcrobial Agents, 29(2), S672. 6. The United States Pharmacopeia (2007), 30th, Vol I, II, pp. 533- 579, 1683-1685.