Xây dựng qui trình Multiplex PCR phát hiện đồng thời HPV (human papilloma virus) và lậu cầu khuẩn (neisseria gonorrhoeae)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 3 * 2011 174 XÂY DỰNG QUI TRÌNH MULTIPLEX PCR PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI HPV (HUMAN PAPILLOMA VIRUS) VÀ LẬU CẦU KHUẨN (NEISSERIA GONORRHOEAE) Trần Đăng Thắng*,**, Nguyễn Văn Trương*, Hồ Thị Thanh Thủy***, Nguyễn Thúy Hương** TÓM TẮT Việc xây dựng qui trình multiplex PCR phát hiện đồng thời hai tác nhân gây bệnh HPV và Neisseria gonorrhoeae có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán và điều trị, đồng thời cũng sẽ góp phần giảm thiểu tối đa chi phí trong sàng lọc các bệnh nhiễm ở đường sinh dục. Phương pháp: Hệ mồi được chúng tôi xây dựng dựa trên dữ liệu trình tự gien của HPV và Neisseria gonorrhoeae đã được công bố trên NCBI và khảo sát những điều kiện tối ưu cho việc xây dựng qui trình multiplex PCR phát hiện đồng thời HPV và Neisseria gonorrhoeae Kết quả: Hai cặp mồi chúng tôi thiết kế cho quy trình là hoàn toàn đặc hiệu với các trình tự mục tiêu, có hiệu quả nhân bản cao và độ nhạy hai cặp mồi có nồng độ ngưỡng mà phương pháp có thể xác định được đồng thời cả hai tác nhân gây bệnh này là 2 x 103 copies/ml. Và thử nghiệm được thực hiện trên 30 mẫu bệnh thu nhận ở Bệnh viện Hùng Vương, Bệnh Viện Da Liễu có 7 mẫu dương trong đó 4 mẫu dương với HPV (13%), 2 mẫu dương tính với Neisseria gonorrhoeae (6%) và 1 mẫu đồng nhiễm HPV với Neisseria gonorrhoeae (3%). Kết luận: Từ kết quả trên, chúng tôi kết luận đã xây dựng thành công quy trình Multiplex –PCR phát hiện đồng thời thời hai tác nhân gây bệnh HPV và Neisseria gonorrhoeae. Từ khóa: multiplex PCR, Human Papilloma Virus, Neisseria gonorrhoeae. ABSTRACT ESTABLISHMENT OF MULTIPLEX PCR ASSAY FOR SIMULTANEOUS DETECTION OF HUMANPAPILLOMA VIRUS AND NEISSERIA GONORRHOEAE Tran Đang Thang, Nguyen Van Truong, Ho Thi Thanh Thuy, Nguyen Thuy Huong * Y hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 – No. 3 – 2011: 172 - 176 Objective: The process construction of multiplex PCR for simultaneous detection of two pathogens Neisseria gonorrhoeae and HPV has important implications for diagnosis and treatment, and will also contribute to minimize the cost of screening genital tract infections. Method: Primers were designed basing on the sequence database of HPV and Neisseria gonorrhoeae (NCBI) and we examined optimal conditions for the assay in order to simultaneously detect HPV and Neisseria gonorrhoeae. Results: Two primer pairs showed completely specific to the target with a high sensitivity that approached the threshold which could be determined at 2 x 103 copies / ml. We have tested these primers on 30 samples collected at Hung Vuong Hospital, and Dermato-Venereological Hospital. There were seven positive samples: four samples (13%) positive with HPV, two samples (6%) positive with Neisseria gonorrhoeae and one sample (3%) positive with HPV and Neisseria gonorrhoeae. Conclusions: Given such results, we have successfully built a Multiplex-PCR assay for simultaneous  Bệnh viện Hùng Vương *, Khoa Kỹ Thuật Hóa Học, Đại Học Bách Khoa **, Công ty cổ phần Việt Á*** Tác giả liên lạc: CN. Trần Đăng Thắng ĐT: 0908212026 Email: thangxnhv@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học 175 detection of Neisseria gonorrhoeae and HPV. Key words: multiplex PCR, Human Papilloma Virus, Neisseria gonorrhoeae. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện tại, theo ước tính, Việt Nam có khoảng 800.000 đến 1.000.000 người mắc các bệnh nhiễm trùng lây qua đường sinh dục mỗi năm. Trong đó, HPV và Neisseria gonorrhoeae ngày càng được đặc biệt quan tâm. Các bệnh này có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng như: Vô sinh, lây truyền sang con (khi người phụ nữ có thai), hoặc có thể dẫn đến tử vong. Trước đây, việc chẩn đoán các bệnh HPV và Neisseria gonorrhoeae chủ yếu bằng các phương pháp truyền thống, như là phương pháp miễn dịch đối với HPV (Human Papilloma Virus) và phương pháp nuôi cấy đối với Neisseria gonorrhoeae, nhưng các phương pháp này không đủ nhạy, thời gian kéo dài và tỏ ra kém hiệu quả. Hiện tại, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, kit PCR phát hiện cùng lúc C. trachomatis và Neisseria gonorrhoeae đã được thương mại hóa. Trái lại, kit phát hiện phát hiện đồng thời HPV và Neisseria gonorrhoeae cũng có tiềm năng, nhưng hiện tại ở Viêt Nam chưa có kit phát hiện đồng thời hai tác nhân này. Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ khảo sát những điều kiện tối ưu để xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện đồng thời HPV và Neisseria gonorrhoeae. Quy trình sau khi được xây dựng thành công có thể được ứng dụng hỗ trợ trong chẩn đoán và điều trị, sẽ rất tiện lợi cho việc phát hiện hai tác nhân gây bệnh ở đường sinh dục người, cũng như góp phần giảm thiểu chi phí trong sàng lọc các bệnh nhiễm ở đường sinh dục. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Mẫu Đối chứng dương DNA vi khuẩn N. gonorrhoeae được cung cấp từ Trung Tâm Kiểm Chuẩn Xét Nghiệm Thành Phố (75a Cao Thắng, Phường 3, Quận 3, TP.HCM) có nồng độ DNA mẫu là 3.107 copies/ml và đối chứng dương HPV có nồng độ là 3.107 copies/ml được cung cấp từ Bệnh Viện Hùng Vương. Ba mươi mẫu phết âm đạo và dịch mủ bộ phận sinh dục được thu thập từ Viện Da Liễu, Bệnh Viện Hùng Vương. Mồi Hai hệ mồi (được tóm tắt trong bảng 1) sử dụng trong nghiên cứu này được chúng tôi thiết kế, dựa vào trình tự các porA gene của N. Gonorrhoeae và các trình tự gene L1 của tất cả các type HPV công bố trên ngân hàng gene và được tổng hợp bởi công ty IDT (MỸ). Bảng 1. Kết quả thiết kế hệ primer-probe Tên Chức năng Trình tự Chiều dài (bp) Kích thước sản phẩm PCR (bp) portA-N.gono Mồi xuôi GCCTGCTACTTTCACGCTG 19 207 portA-N.gono Mồi ngược GGATCGGTATCACTCGCTCTG 21 207 L1-HPV Mồi xuôi CGTCCMARRGGAWACTGATC 20 455 L1-HPV Mồi ngược GCMCAGGGWCATAAYAATGG 20 455 Phương pháp multiplex PCR DNA từ mẫu dịch phết tế bào âm đạo bệnh nhân được ly trích bằng phương pháp sử dụng phenol/chloroform, phỏng theo phương pháp của Chomczynski & Sacchi (1987): 100 l dịch tế bào được thêm vào 900 l Trizol. DNA sau đó được tủa bằng Isopropanol với chất trợ tủa GlycoBlue. DNA thu được sau tủa được cho vào 50µl dung dịch TE 1X và dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn, bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng. Phản ứng multiplex PCR được thiết lập trong 20 l gồm: Mix phản ứng, dịch DNA tách chiết, hai cặp mồi portA-N.gonof- portA- Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 3 * 2011 176 N. gonor và L1-HPVf- L1-HPVr, H2O (Bio – pure). Các mẫu sử dụng trong phản ứng gồm: các mẫu chứng có nồng độ từ 102-107, các mẫu thử. Chương trình luân nhiệt như sau: 1 chu kì 95oC - 5 phút; 40 chu kì 94oC - 30 giây, 50oC - 30 giây, 72oC - 30 giây; 1 chu kỳ 72 oC - 6 phút. Giải trình tự Sản phẩm PCR của HPV và Neisseria gonorrhoeae sau đó gửi đến công ty Macrogen, Hàn quốc để tinh sạch và giải trình tự. KẾT QUẢ – BÀN LUẬN Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của hai cặp mồi Mồi có độ đặc hiệu cao là mồi chỉ bắt cặp với trình tự N.gonorrhoeae hoặc HPV mà không bắt cặp với các vi sinh vật khác. Và sản phẩm khuếch đại đặc trưng là các đoạn DNA có kích thước như đã nghiên cứu, sau quá trình điện di được so với thang DNA chuẩn. Hình 1: Kết quả độ đặc hiệu của hai cặp mồi Giếng 1: HBV (+); Giếng 2: HBV (-); Giếng 3: HPV& N. gonorrhoeae (+); Giếng 4: HPV & N. gonorrhoeae (-); Giếng 5: C. trachomatis (+); Giếng 6: C. trachomatis (-); T: Thang DNA 100bp; Giếng 7: HSV (+); Giếng 8: HSV (-); Giếng 9: DNA Người(+); Giếng 10: DNA Người(-); Giếng 11: MTB (+); Giếng 12: MTB (-) Giếng 13: CMV (+); Giếng 14: CMV (-). Theo hình 1, chúng tôi nhận thấy ở giếng 3 hai vạch mục tiêu hiện sáng rõ điều đó có nghĩa là hai cặp mồi của chúng tôi có khả năng nhân bản tốt đúng trình tự mục tiêu, còn ở các giếng 1-5-7-9-11-13 thấy xuất hiện các vạch sáng đúng với vị trí bắt cặp của 6 mồi HBV, C. trachomatis, HSV, DNA người và MTB điều đó có nghĩa là 6 chứng dương chúng tôi chọn có khả năng sử dụng tốt phù hợp cho việc khảo sát độ đặc hiệu của hai cặp mồi chúng tôi thiết kế. Và điều quan trọng khi nhìn trên hình điện di chúng tôi nhận thấy ở các giếng 2-4-6-8-10-12-14 cho kết quả âm tính với hai cặp mồi N. gonorrhoeae –HPV. Như vậy chúng tôi có thể kết luận rằng hai cặp mồi chúng tôi thiết kế có khả năng nhân bản hiệu quả và đặc hiệu với trình tự mục tiêu N. gonorrhoeae, HPV mà không bắt cặp với các trình tự của vi sinh vật khác trên người. Hai cặp mồi chúng tôi sử dụng cho quy trình là hoàn toàn đặc hiệu với các trình tự mục tiêu, có hiệu quả nhân bản cao. Kết quả khảo sát độ nhạy của quy trình Để khảo sát độ nhạy của quy trình chúng tôi sử dụng nồng độ DNA trong bản mẫu là 2 x 107 copies/ml. Tiến hành pha loãng mẫu theo bậc 10 và cho chạy phản ứng PCR cho từng nồng độ. Hình 2: Kết quả độ nhạy của mẫu. Giếng 1(107): Nồng độ 2 x 107 copies/ml. Giếng 2(106): Nồng độ 2 x 106 copies/ml; Giếng 3(105): Nồng độ 2 x 105 copies/ml; Giếng 4(104): Nồng độ 2 x 104 copies/ml; Giếng 5(103): Nồng độ 2 x 103 copies/ml; Giếng 6(102): Nồng độ 2 x 102 copies/ml; Giếng 7(101): Nồng độ 2 x 101 copies/ml; Giếng T: Thang 100bp. Kết quả hình 2 cho ta thấy, từ giếng 1 đến giếng 5 các vạch mục tiêu vẫn xuất hiện, giếng 5 (2 x 103 copies/ml) cường độ sáng yếu đi nhiều và đến giếng 6 thì không còn nhìn thấy vạch mục tiêu xuất hiện, điều đó chứng tỏ rằng nồng độ ngưỡng mà phương pháp có thể xác định được đồng thời cả hai tác nhân gây bệnh là 2 x 103 copies/ml hay nói cách khác là với phương Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học 177 pháp Multiplex – PCR này thì chúng tôi có thể phát hiện được sự tồn tại của hai tác nhân gây bệnh ngay cả khi số lượng của chúng trong mẫu tối thiểu là 2x103 copies/ml. Kết quả khảo sát trên mẫu bệnh thực tế Sau khi khảo sát các điều kiện tối ưu cho một phản ứng Multiplex –PCR, chúng tôi khảo sát trên mẫu bệnh thực tế ở nhiệt độ lai tối ưu là 50oC. Kết quả điện di sản phẩm PCR 12 mẫu bệnh phẫm (lô 1) Hình 3: Kết quả điện di sản phẩm PCR lô 1. Giếng 1: Chứng Dương; Giếng 2: Chứng Âm Giếng 3 →14: mẫu số 1 đến mẫu số 12; Giếng T: Thang 100 bp Nhìn trên hình 3 chúng tôi nhận thấy ở giếng số 3 có xuất hiện vạch sáng ứng với vị trí 207bp và 455bp, giếng 5 vạch sáng xuất hiện ứng với vị trí 207 bp và duy nhất giếng số 9 có vạch sáng ứng với vị trí 445 bp. Như vậy, có thể kết luận được rằng trong lô mẫu chúng tôi khảo sát thì mẫu số 3 đồng nhiễm với HPV và N. gonorrhoeae, mẫu số 5 dương tính với N. gonorrhoeae và mẫu số 9 dương tính với HPV. Kết quả điện di sản phẩm PCR 12 mẫu bệnh phẫm (Lô 2) Hình 4: Kết quả điện di sản phẩm PCR Lô 2 Giếng (+): Chứng Dương; Giếng (-): Chứng Âm; Giếng T: Thang 280 bp -447 bp -585 bp; Giếng 13→ 24: mẫu 13 đến 24. Kết quả điện di trên hình 4 cho thấy trong 12 mẫu bệnh phẩm chúng tôi khảo sát được có 2 mẫu nằm ở giếng 13 và giếng 19 dương tính với HPV và mẫu ở giếng 15 dương tính với N. gonorrhoeae. Kết quả điện di sản phẩm PCR 6 mẫu bệnh phẫm (Lô3) Theo như kết quả điện di trên hình 5 cho thấy trong 6 mẫu bệnh phẩm chúng tôi khảo sát được có 1 mẫu nằm ở giếng 28 dương tính với HPV. Hình 5: Kết quả điện di sản phẩm PCR Lô 3: Giếng (+): Chứng Dương; Giếng (-): Chứng Âm; Giếng T: Thang 280 bp -447 bp -585 bp; Giếng 25→ 30: mẫu 25 đến 30. KẾT LUẬN Như vậy chúng tôi đã bước đầu xây dựng thành công quy trình Multiplex – PCR để phát hiện đồng thời HPV và Neisseria gonorrhoeae với độ đặc hiệu và độ nhạy cao. Và thử nghiệm được thực hiện trên 30 mẫu bệnh thu nhận ở Bệnh viện Hùng Vương, Bệnh Viện Da Liễu có 7 mẫu dương trong đó 4 mẫu dương với HPV (13%), 2 mẫu dương tính với Neisseria gonorrhoeae (6%) và 1 mẫu đồng nhiễm HPV với Neisseria gonorrhoeae (3%). Bước đầu, các kết quả này đã được kiểm chứng lại bằng giải trình tự sản phẩm PCR và kết quả của cả hai phương pháp cho thấy hoàn toàn trùng khớp với nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cao Thị Bảo Vân (2006). Xây dựng và chuẩn hóa bộ kit phát hiện C. trachomatis và N. gonorrhoeae trong bệnh phẩm. Viện Pasteur TP. HCM. 2. Chernesky M, Freund GG, Hook E III (2007). Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeaeInfections in North American Women by Testing SurePath Liquid-Based Pap Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Số 3 * 2011 178 Specimens in APTIMA Assays. Volume 45, pages 2434-2438. 3. Koumans EH. (2002). Comparison of Methods for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Using Commercially Available Nucleic Acid Amplification Tests and a Liquid Pap Smear Medium. Volume 41, Pages 1507-1511. 4. Mahony JB, Song X, Chong S., Faught M., Salonga T., Kapala J. (2001). Evaluation of the NucliSens Basic Kit for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genital Tract Specimens Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of 16S rRNA. Volume 39, Pages 1429-1425. 5. Nguyễn Hoàng Chương (2005). Xây dựng quy trình PCR phát hiện papillomavirus (hpv) trong dịch phết âm đạo. Y Học TP. Hồ Chí Minh, Tập 9, số 1. 6. Whiley PJ, et al (2004). A new confirmatory Neisseria gonorrhoeae real-time PCR assay DM. targeting the porA pseudogene. TẦN SUẤT NGUY CƠ MẮC TIỀN ĐÁI THÁO ĐƯỜNG VÀ KHẢ NĂNG RÚT NGẮN THỜI GIAN THỰC HIỆN NGHIỆM PHÁP DUNG NẠP GLUCOSE Trần Ngọc Thanh*. Nguyễn Thị Lệ** TÓM TẮT Mở đầu: Việt Nam nằm trong nhóm nước có tỷ lệ bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) tăng nhanh nhất trên thế giới. Theo báo cáo của Trung tâm dinh dưỡng TPHCM cho biết, có từ 40 - 50% có biến chứng ở thời điểm chẩn đoán. Trong đó, số người dưới 30 tuổi mắc bệnh ngày càng gia tăng, thậm chí có những trẻ dưới 10 tuổi cũng mắc bệnh và như vậy là tỉ lệ mắc tiền ĐTĐ còn cao hơn nữa.. Do đó, việc tầm soát tiền ĐTĐ mang lại một ích lợi quan trọng trong bối cảnh chưa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống là một trong ba cách giúp chẩn đoán ĐTĐ và là cách để phát hiện tiền ĐTĐ. Tuy nhiên, thời gian 2 giờ cần cho việc thực hiện nghiệm pháp là khá lâu và là một trong những rào cản đối với việc ứng dụng nghiệm pháp này trong thực tế nên cần thiết phải đánh giá khả năng cải tiến. Mục tiêu: Xác định tần suất rối loạn dung nạp glucose và khả năng rút ngắn thời gian thực hiện nghiệm pháp dung nạp glucose. Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu cắt ngang trên 98 học viên đến thực tập tại Bộ môn sinh lý học – Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả: Tần suất rối loạn dung nạp glucose (tiền đái tháo đường) là 26,5%. Tần suất rối loạn dung nạp glucose có liên quan với tiền căn gia đình mắc tiền đái tháo đường hoặc đái tháo đường. (RR= 2,69), với việc chơi thể thao (RR= 3,23); Ghi nhận tần suất này có gia tăng theo tuổi. Có khả năng rút ngắn thời gian thực hiện nghiệm pháp dung nạp glucose dành cho các đối tượng có kết quả bình thường tại thời điểm 90 phút và tỉ lệ trường hợp có thể được rút ngắn là 49%. Từ khóa: nghiệm pháp dung nạp glucose, đường huyết lúc đói, tiền đái tháo đường, rối loạn dung nạp glucose. ABSTRACT PREVALENCE OF PRE-DIABETES BY ORAL GLUCOSE TOLERANCE TEST AND THE PROBABILITY OF SHORTERNING TEST TIME Tran Ngoc Thanh, Nguyen Thi Le * Y hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 – No. 3 – 2011: 176 - 182 Background: Vietnam is one of the most increasing prevalence of diabetes mellitus countries. According to HCMC Center for Nutrition, approximately 40-50% diabetes patients have had complications at diagnosis. The number of under 30 year old patients is increasing with pre-diabetes. Therefore, screening and defining the * Bộ moân Sinh Lí Học, Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, ** Bộ moân Sinh Lí Học, Đại Học Y Dược TP.HCM. Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Thị Lệ ĐT: 0903311507. Email: bs.nguyenthile@gmail.com