Xây dựng quy trình định lượng đồng thời Calophyllolid và curcumin I trong dầu mù u – nghệ bằng phương pháp HPLC

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 229 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CALOPHYLLOLID VÀ CURCUMIN I TRONG DẦU MÙ U – NGHỆ BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC Nguyễn Hoàng Thảo My*, Nguyễn Hữu Lạc Thủy*, Võ Thị Bạch Huệ* TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Chế phẩm Dầu Mù u kết hợp với Nghệ (Dầu Mù u – Nghệ) l| hướng nghiên cứu kế thừa từ những dữ liệu khoa học đã được chứng minh về tác dụng tương hỗ của dầu Mù u và Nghệ v|ng cũng như giới thiệu và tiêu chuẩn hóa dạng sản phẩm mới. Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo s{t c{c điều kiện để xây dựng và thẩm định phương ph{p HPLC để định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong dầu Mù u – Nghệ. Đối tượng nghiên cứu: calophyllolid và curcumin I. Phương pháp nghiên cứu: khảo sát quy trình xử lý mẫu v| c{c điều kiện sắc ký để xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong mẫu dầu Mù u – Nghệ bằng phương ph{p HPLC. Kết quả: Quy trình xử lý mẫu: calophyllolid và curcumin trong mẫu thử được chiết bằng dung môi hòa tan và xử lý bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE). Điều kiện sắc ký: Cột C18 Waters (250 x 4,6 mm; 5 m); pha động: kỹ thuật rửa giải gradient với chương trình dung môi acetonitril  acid formic 0,1%; nhiệt độ cột: 40 oC; tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm: 10 μl; bước sóng phát hiện: 270 nm. Kết quả thẩm định: Quy trình đã được thẩm định với các chỉ tiêu về độ đặc hiệu, tính tuyến tính (curcumin I: y = 17386x, R2 = 0,9996, khoảng nồng độ khảo sát 1,0 – 16,0 ppm và calophyllolid: y = 29309x, R2 = 0,9998, khoảng nồng độ khảo sát 5,0 – 80,0 ppm), độ lặp lại (curcumin I RSD% = 2,00 v| calophyllolid RSD% = 1,79), độ chính xác trung gian (curcumin I RSD% = 1,98 và calophyllolid RSD% = 1,31) v| độ đúng (tỷ lệ phục hồi của curcumin I v| calophyllolid đều từ 98 – 102%; curcumin I RSD% = 1,34; calophyllolid RSD% = 1,28) với các thông số sắc ký đều đạt yêu cầu của một quy trình định lượng. Kết luận: Quy trình ph}n tích HPLC định lượng được đồng thời calophyllolid v| curcumin I đạt các yêu cầu thẩm định, l| cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm của dầu Mù u – Nghệ. Từ khóa: dầu Mù u – Nghệ, calophyllolid, curcumin I, HPLC, SPE, Ho C ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF CALOPHYLLOLIDE AND CURCUMIN I IN TAMANU – TURMERIC OIL BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) METHOD Nguyen Hoang Thao My, Nguyen Huu Lac Thuy, Vo Thi Bach Hue * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:229 - 234 Background – Objectives:The combination of Calophyllum inophyllum seed oil and Curcuma longa (also called tamanu – turmeric oil) is a study based on proven scientific data on the synergistic effects of tamanu oil and turmeric as well as introduce and standardize new product types. The objectives of this study, we researched some conditions for development and validation the determination of calophyllolide and curcumin I in tamanu – turmeric oil by HPLC method. *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 091.551.7890 Email: nguyenhuulacthuy@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 230 Methods: Finding out the sample processing and the suitable chromatographic conditions for determination of calophyllolide and curcumin I by HPLC method, after that it was validated in system suitability, selectivity, linearity range, precision and accuracy. Results: The sample was processed by solid phase extraction (SPE). The suitable chromatographic conditions for separation of calophyllolide and curcumin I were obtained using: a stainless steel column (250 x 4.6 mm), packed with octadecylsilane bonded to porous silica (5 m); mobile phase: a mixture of acetonitrile and formic acide 0.1% with gradient elution technique; flow rate 1 ml per minute; injection volume 10 µl; column temperature 40 oC; 270 nm PDA detector. The method were validated selectivity and showed linearity range of calophyllolide (5.0 – 80.0 ppm; ŷ = 29309x; R2 = 0.9998) and curcumin I (1.0 – 16.0 ppm; ŷ=17386x; R2 = 0.9996), respectively of calophyllolide and curcumin I, precision of both calophyllolide and curcumin I with RSD ≤ 2.0%; accuracy with recovery ratio in 98 – 102 %. Conclusions: HPLC method was succeessfully determinated calophyllolide and curcumin I as well as validated this process, which is databased to construct the analytical standards of tamanu – turmeric oil. Keywords: tamanu – turmetic oil, calophyllolide, curcumin I, HPLC, SPE ĐẶT VẤN ĐỀ Dầu Mù u – Nghệ là sự phối hợp của dầu Mù u với dầu Nghệ tạo dạng thành phẩm mang hoạt tính điều trị tốt hơn nhờ vào tác dụng tƣơng hỗ củ h i dƣợc liệu này. Các nghiên cứu định lƣợng calophyllolid trong Mù u hay curcumin I trong Nghệ(1) đã đƣợc một số tài liệu công bố, tuy nhiên hiện nay vẫn chƣ có c ng trình n|o c ng bố phƣơng ph{p định lƣợng đồng thời 2 hoạt chất này trong thành phẩm dầu Mù u – Nghệ. Calophyllolid là một marker trong dầu Mù u với hoạt tính kháng viêm, kháng khuẩn và giúp mau lành vết thƣơng(2,4). Curcumin I là nhóm hoạt chất mang tác động kháng viêm(5) và chống oxi hóa(3). Vì vậy, mục tiêu đề tài là xây dựng và thẩm định phƣơng ph{p định lƣợng đồng thời calophyllolid và curcumin trong thành phẩm dầu Mù u – Nghệ bằng sắc ký lỏng hiệu năng c o HPLC , từ đó đề nghị giới hạn h|m lƣợng của hai hoạt chất này trong chế phẩm. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Calophyllolid và curcumin I. Nguyên vật liệu Chất đối chiếu calophyllolid (94,90%) và curcumin I (92,93%) do nhóm nghiên cứu phân lập. Mẫu nghiên cứu Thành phẩm dầu Mù u – Nghệ do nhóm nghiên cứu điều chế. Thiết bị chính HPLC Alliance 2695-2996, đầu dò PDA; cột C18 Waters (250 x 4,6 mm; 5 µm) và một số thiết bị kh{c đã đƣợc hiệu chuẩn định kỳ theo quy định. Dung môi - hóa chất Acetonitril, methanol đạt tiêu chuẩn HPLC Merck ; nƣớc cất 2 lần dùng cho sắc ký lỏng. Phƣơng pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Khảo sát dung môi hòa tan mẫu: methanol và acetonitril, chọn dung m i hò t n đƣợc c lophyllolid v| curcumin; đƣờng nền trên sắc ký đồ HPLC ổn định. Xử lý mẫu: dùng dung m i hò t n đã khảo s{t để chiết curcumin I và calophyllolid từ dầu mẫu thử, tiếp tục xử lý bằng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE). Khảo sát các dung môi rửa giải qua SPE, dịch rửa giải qu SPE đƣợc phân tích bằng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 231 HPLC. Chọn ph}n đoạn thu đƣợc curcumin và calophyllolid với tỷ lệ phục hồi trên 98%. Các khảo sát về phƣơng ph{p ph}n tích để lựa chọn điều kiện sắc ký cho sắc ký đồ đạt yêu cầu về độ phân giải giữ c{c pic định lƣợng và các pic lân cận, cũng nhƣ c{c yêu cầu thông số pic sắc ký nhƣ độ bất đối, độ tinh khiết pic. Khảo sát các điều kiện sắc ký tách đồng thời calophyllolid và curcumin I bằng HPLC C{c điều kiện dự kiến: tốc độ dòng 1 mL/phút, bƣớc sóng 270 nm, nhiệt độ cột 40 oC. Khảo s{t ph động (pH và tỷ lệ dung môi) và kỹ thuật rửa giải đẳng dòng, gradient). Dung môi khảo sát gồm acetonitril hoặc meth nol đƣợc phối hợp với acid formic. Thẩm định quy trình phân tích HPLC Thẩm định theo hƣớng dẫn chung về thẩm định quy trình: khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng S u khi quy trình đạt các yêu cầu về thẩm định, áp dụng phƣơng ph{p lên 3 mẫu sản xuất thử nghiệm, đề nghị giới hạn định lƣợng curcumin I và calophyllolid cho sản phẩm. KẾT QUẢ Kết quả khảo sát điều kiện xử lý mẫu Trên sắc ký đồ HPLC, mẫu thử chiết bằng meth nol cho đƣờng nền ổn định và hệ số phân giải giữa các pic hiệu quả hơn mẫu thử chiết bằng acetonitril. Xử lý mẫu Cân chính xác khoảng 1,0 g dầu cho vào bình định mức 50 ml, hò t n v| điền đầy bằng methanol. Để yên 30 phút, dung dịch tách thành 2 lớp, lấy chính xác 10 ml lớp dịch bên trên, cho b y hơi hết dung m i đến cắn. Cho toàn bộ cắn này vào cột SPE, loại tạp bằng 5 ml hỗn hợp methanol – nƣớc (50 : 50); tiếp tục rửa giải bằng 5 ml dung môi methanol – nƣớc (60 : 40), cho toàn bộ dịch chiết vào bình định mức 10 ml, điền dung m i đến vạch. Tỷ lệ phục hồi đƣợc khảo sát trên mẫu chuẩn trƣớc và sau khi xử lý qua SPE (bảng 1, hình 1). Bảng 1: Tỷ lệ phục hồi của hỗn hợp mẫu chuẩn trước và sau khi qua SPE. Nồng độ chuẩn S Chưa qua SPE (µV x giây) S Qua cột SPE S (µV x giây) Tỷ lệ phục hồi (%) Curcumin (40 ppm) 788130 772529 98,02 Calophyllolid (250 ppm) 7496766 7465498 99,58 Mẫu chuẩn curcumin I v| calophyllolid chưa xử lý qua SPE Mẫu chuẩn curcumin I và calophyllolid sau khi xử lý qua SPE Hình 1: Sắc ký đồ hỗn hợp mẫu chuẩn trước và sau khi xử lý qua SPE Kết quả khảo sát các điều kiện sắc ký tách đồng thời calophyllolid và curcumin I bằng HPLC Mẫu trắng: dung môi pha mẫu. Mẫu hỗn hợp đối chiếu: calophyllolid và curcumin I nồng độ tƣơng ứng 20 v| 3,5 µg/mL đƣợc pha trong ph động. - Các hệ ph động đã khảo sát bao gồm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 232 acetonitril phối với acid formic 0,1% với các tỷ lệ (65 : 35), (60 : 40), (57 : 43) và (55 : 45). Kết quả khảo sát cho thấy: tỷ lệ dung môi acetonitril - acid formic (60 : 40) cho kết quả SKĐ tối ƣu hơn về thông số độ phân giải. Tuy nhiên, các khảo sát với kỹ thuật isocratic trên đều chƣ đạt yêu cầu về độ tinh khiết, vì vậy các khảo sát tiếp theo đƣợc thực hiện nhằm cải thiện thông số độ tinh khiết của 2 pic calophyllolid và curcumin I. - Thử nghiệm tiếp theo đƣợc khảo sát trên một vài tỷ lệ ph động của acetonitril – dung dịch acid formic 0,1 % với kỹ thuật rửa giải gradient. Kết quả cho thấy tại bƣớc sóng 270 nm có pic curcumin I và calophyllolid tách hoàn toàn khỏi các pic lân cận v| đạt độ tinh khiết theo yêu cầu sắc ký. Nhƣ vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để định lƣợng đồng thời calophyllolid và curcumin I: cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µL, bƣớc sóng phát hiện 270 nm, nhiệt độ cột 40 oC. Ph động là hệ dung môi acetonitril – dung dịch cid formic 0,1 % pH 3,5 theo chƣơng trình gr dient đƣợc trình bày ở bảng 2. Bảng 2: Chương chình dung môi Thời gian (phút) Tỉ lệ acetonitril – acid formic 0,1% (pH 3,5) 0 10 25 35 60 : 40 55 : 45 65 : 35 60 : 40 Điều kiện n|y đã t{ch ho|n to|n 2 pic khảo sát, có thể tiến hành các thử nghiệm khảo sát tính phù hợp hệ thống và thẩm định quy trình. Khảo sát tính phù hợp hệ thống Tiến hành sắc ký 6 lần dung dịch hỗn hợp đối chiếu (bảng 3) và mẫu thử (bảng 4). Bảng 3: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên dung dịch hỗn hợp đối chiếu Chất phân tích Giá trị thống kê Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (µVxs) Hệ số bất đối Độ phân giải Curcumin I TB 6,55 60087 1,4 3,7 RSD 0,09% 1,39 % Calophyllolid TB 28,28 627097 1,1 3,7 RSD 0,09 % 0,61% Bảng 4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử dầu Mù u – Nghệ Chất phân tích Giá trị thống kê Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (µVxs) Hệ số bất đối Độ phân giải Curcumin I TB 6,53 61031 1,3 3,7 RSD 0,22% 1,97% Calophyllolid TB 27,96 656984 1,0 3,3 RSD 0,36% 0,54% Như vậy, RSD thời gi n lƣu v| diện tích của 2 pic khảo s{t đều < 2 %, hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải giữa 2 pic > 1,5: quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. Thẩm định quy trình Tính đặc hiệu Kết quả khảo s{t tính đặc hiệu: sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu pic tại thời gian lƣu của các pic trong mẫu đối chiếu tƣơng ứng. Dung dịch thử: sắc ký đồ có các pic tách nhau hoàn toàn và thời gi n lƣu của hai pic cần định lƣợng trong mẫu thử tƣơng đƣợng với trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu, chiều cao và diện tích của pic curcumin I và c lophyllolid tăng lên so với mẫu thử; phổ Uv – Vis của 2 pic hoạt chất cần định lƣợng trong mẫu thử tƣơng ứng với phổ Uv – Vis trong mẫu đối chiếu. Sử dụng chức năng kiểm tr độ tinh khiết cho thấy các pic khảo s{t đều đạt yêu cầu. Như vậy, quy trình đạt yêu cầu về độ đặc hiệu (Hình 2). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 233 Sắc ký đồ (SKĐ) mẫu trắng SKĐ hỗn hợp mẫu đối chiếu SKĐ mẫu thử dầu Mù u – Nghệ SKĐ mẫu đối chiếu + thử Hình 2: SKĐ độ đặc hiệu của quy trình định lượng Kết quả thẩm định khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác Kết quả dữ liệu thống kê cho thấy quy trình định lƣợng đồng thời calophyllolid và curcumin I đạt các yêu cầu về thẩm định. Bảng 5: Kết quả các thử nghiệm theo yêu cầu thẩm định quy trình Curcumin I Calophyllolid Phương trình hồi quy Hệ số tương quan ŷ = 17386 x R = 0,9996 ŷ = 29309 x R = 0,9998 Khoảng tuyến tính 1, 0 – 16,0 µg/mL 5 – 80 µg/mL Độ chính xác (n=6) - Độ lặp lại - Độ chính xác trung gian RSD 2,00% ≤ 2% RSD 1,98% ≤ 2% RSD 1,79% < 2% RSD 1,31% < 2% Độ đúng (n = 9) Mẫu thử thêm đối chiếu (50%, 100% và 150%) Tỷ lệ phục hồi 98,0 – 101,1% RSD 1,34 % Tỷ lệ phục hồi 98,12 – 101,95 % RSD 1,28 % Quy trình đƣợc ứng dụng để x{c định hàm lƣợng hoạt chất của mẫu thử từ 3 lô dầu Mù u – Nghệ sản xuất thử: Lô 1 Lô 2 Lô 3 Hàm lượng TB curcumin I (%) 0,031 0,031 0,030 Hàm lượng TB calophyllolid (%) 0,22 0,23 0,22 Từ kết quả định lƣợng trên 3 lô sản xuất thử, kiến nghị về giới hạn h|m lƣợng của hai hoạt chất này trong dầu Mù u – Nghệ: H|m lƣợng C% của curcumin I trong dầu Mù u – Nghệ phải ≥ 0,03%. H|m lƣợng C% của calophyllolid trong dầu Mù u – Nghệ ≥ 0,20%. BÀN LUẬN Kết quả thực nghiệm minh chứng cho quy trình định lượng đồng thời calophyllolid và curcumin I đạt các yêu cầu của một quy trình định lượng. Mẫu thử nghiệm là mẫu có thành phần phức tạp nên công đoạn xử lý mẫu qua SPE là cần thiết. Kết quả cùa việc xử lý mẫu ảnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 234 hưởng lớn đến độ đúng và độ chính xác của quy trình, vì vậy việc thực hiện bước xử lý mẫu cần tỉ mỉ, chính xác. Chúng tôi cũng đã thực hiện thử nghiệm xác định tỷ lệ phục hồi về hàm lượng trước và sau khi qua SPE, chứng minh được hàm lượng thu hồi của cả hai hoạt chất trên 98%, kết quả này góp phần khẳng định độ đúng của quy trình phân tích. Các điều kiện sắc ký cũng đã được khảo sát, kết quả thử nghiệm cho thấy pha động có dung môi acetonitril và được acid hóa bằng acid formic cho các thông số sắc ký đạt yêu cầu hơn so với dung môi methanol. Mặc dù kỹ thuật rửa giải gradient khó đạt độ chính xác đối với kết quả định lượng, tuy nhiên do mẫu thử có thành phần là sự phối hợp của cao chiết từ hai dược liệu nên thành phần rất tạp. Các thử nghiệm bằng kỹ thuật isocratic cho sắc ký đồ không đạt độ tinh khiết tại thời gian lưu của cả hai pic urcumin I và calophylloid. Vì vậy, chúng tôi chọn kỹ thuật rửa giải gradient cho quy trình phân tích. KẾT LUẬN Bằng phƣơng ph{p sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu do dãy diod qu ng, quy trình định lƣợng đồng thời calophyllolid và curcumin I trong mẫu thử dầu Mù u – Nghệ đã đạt các yêu cầu theo theo thẩm định Đ}y l| cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho thành phẩm với mức kiến nghị cho h|m lƣợng % curcumin I là ≥ 0,03% và calophyllolid là ≥ 0,20% TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ardi N, Abdul R, Endang L, Nuning R and Sudjadi (2015). Analysis of Curcumin in ethanolic extract of Curcuma longa Linn. and Curcuma xanthorriza Roxb using High Performance Liquid Chromatography with UV-Detection. Research Journal of Phytochemistry, 9: 188-194. 2. Bin ZM, Ilham Z (2014), Anti - infalmmatory activity of Calophyllum inophyllum fruits extracts, Procedia Chemistry, 13: 218-220. 3. Borra SK, Prema G, Jayamathi RC (2013), Antioxidation and free radical scavenging activity of curcumin determined by using different in vitro and ex vivo models, Journal of Medicinal Plants Research. 7 (36): 2680-2690. 4. Shanmugapriya CY (2016), Calophyllum inophyllum: A medical Plant with multiple curative values. Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Medical,7 (4): 1446 - 1452. 5. Soheil ZM, Hbash AK, Pouya H (2014), A review on Antibacterial, Antiviral and Antifungal activity of Curcumin, BioMe Research International. pp. 337-339. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018