Xây dựng quy trình định lượng Palmitoyl Pyrazinamid bằng phương pháp HPLC và ứng dụng để xác định hệ số phân bố log P của palmitoyl pyrazinamid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 197 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG PALMITOYL PYRAZINAMID BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHÂN BỐ LOG P CỦA PALMITOYL PYRAZINAMID Nguyễn Duy Phương*, Phạm Đình Duy*, Phan Văn Hồ Nam* TÓM TẮT Mở đầu: Tiền chất của pyrazinamid, palmitate pyrazinamid, được tổng hợp mới để bào chế tiểu phân xốp nhằm đạt được yêu cầu riêng của hệ phân phối thuốc đến phổi. Để kiểm soát chất lượng hoạt chất mới n|y, đề t|i “X}y dựng quy trình định lượng palmitate pyrazinamid bằng phương ph{p HPLC v| ứng dụng để khảo sát hằng số LogP của hợp chất n|y” được thực hiện. Mục tiêu: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid bằng phương ph{p HPLC, ứng dụng để khảo sát hệ số phân bố log P của palmitoyl pyrazinamid. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Thăm dò c{c điều kiện sắc ký bằng HPLC. Tiến hành thẩm định quy trình theo hướng dẫn của ICH. Sử dụng phương ph{p thêm chuẩn để định lượng palmitoyl pyrazinamid trong c{c pha để x{c định hệ số phân bố Log P của hoạt chất này. Kết quả: Đã x}y dựng được quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid với c{c điều kiện sắc ký là: Cột sắc ký Intersil, 250 x 4,6 mm x 5 µm; Nhiệt độ cột 30 oC; Bước sóng phát hiện 268 nm; Pha động gồm 100% ACN; Tốc độ dòng 1 mL/phút; Thể tích tiêm 20 µL; Nồng độ mẫu 150 µg/mL. Quy trình định lượng này đạt các yêu cầu về tính tương thích hệ thống, độ lặp lại, tính tuyến tính, độ đúng, v| được ứng dụng để x{c định hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid bằng thực nghiệm là 4,39, không khác biệt nhiều so với dự đo{n bằng các phần mềm chuyên dụng. Kết luận: Đã x}y dựng được quy trình định lượng palmitoyl pyrazinamid. X{c định được hệ số phân bố Log P của palmitoyl pyrazinamid bằng thực nghiệm là 4,39. Từ khóa: palmitoyl pyrazinamid, HPLC, Log P ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF PALMITATE PYRAZINAMIDE BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY AND THE APPLICATION IN FINDING ITS PARTITION COEFFICIENT (LOG P) Nguyen Duy Phuong, Pham Dinh Duy, Phan Van Ho Nam * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1 - 2018: 197 - 203 Introduction: A precursor of pyrazinamide, palmitate pyrazinamide, was synthesized to form small particles that met predetermined requirements for lung-distributing system. To monitor the quality of this novel substance, the study “Quantitative determination of palmitate pyrazinamide by high performance liquid chromatography and the application in finding its partition coefficient (log P)” was conducted. Objectives: Establish qualification and validation processes of palmitoyl pyrazinamide via HPLC system, applied to investigate its partition coefficient (log P). *Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phan Văn Hồ Nam ĐT: 0909615007 Email: phanvanhonam@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 198 Materials and Methods: Examine various HPLC conditions. Appraise validation process based on ICH guiedlines. Standard addition method was carried out to determine palmitoyl pyrazinamide contents in different phases and to figure out its partition coefficient. Results: HPLC conditions for the qualification process of palmitoyl pyrazinamide: Intersil column (250 x 4.6 mm x 5 µm); column temperature 30 oC; wave length 268 nm; mobile phase ACN 100%; flow rate 1mL/min; injection column 20 µL; sample content 150 µL/mL. This process met requirements of system suitability, repeatability, linearity and accuracy and was applied to find out palmitoyl pyrazinamide's partition coefficient (4.39), which comparatively similar to prediction of softwares. Key words: palmitoyl pyrazinamid, HPLC, Log P ĐẶT VẤN ĐỀ Pyrazinamide (PZA) là một trong 4 kháng sinh chính dùng trong ph{c đồ điều trị bệnh lao của Tổ chức Y tế thế giới (WHO)(5). Bên cạnh các dạng thuốc có tác dụng toàn thân, việc nghiên cứu các hệ phân phối thuốc kháng lao đến phổi đƣợc xem nhƣ một chiến lƣợc thay thế thuốc dùng đƣờng uống v| tiêm để có đƣợc nồng độ thuốc cao hơn v| t{c dụng trực tiếp hơn đến các tổn thƣơng tại cơ quan đích l| phổi(4). Các tiểu phân xốp mang PZA là một ứng viên tiềm năng, tuy nhiên, vì khi c{c tiểu phân xốp đƣợc phân phối tới phổi thì PZA đƣợc hòa tan và hấp thu vào hệ tuần hoàn nhanh chóng, nồng độ thuốc tại chỗ sẽ không duy trì l}u d|i, hơn nữa nồng độ PZA đo đƣợc trong đại thực bào phế nang thấp có thể không đủ để tiêu diệt các vi khuẩn lao thể không hoạt động(1). Do vậy, sử dụng tiền chất của PZA, palmitate pyrazinamide (PP), để bào chế tiểu phân xốp sẽ giúp nó bền hơn về mặt khí động học, và sự phóng thích PZA vào dịch phế quản phổi sẽ giảm dẫn đến sự hấp thu vào tuần hoàn giảm, giúp đạt đƣợc yêu cầu của hệ trị liệu mới này(3). Việc kiểm soát chất lƣợng hoạt chất mới này là một yêu cầu không tránh khỏi nhƣng vì l| một chất đƣợc tổng hợp mới nên chƣa có công bố n|o định lƣợng hoạt chất này. Do vậy đề t|i “X}y dựng quy trình định lƣợng palmitate pyrazinamid bằng phƣơng ph{p HPLC v| ứng dụng để khảo sát hằng số LogP của hợp chất n|y” đƣợc thực hiện với mong muốn góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng và khảo sát hằng số logP cho một nguyên liệu mới sử dụng làm thuốc, cũng nhƣ sẽ là tiền đề cho việc xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cho các chế phẩm bào chế từ nó. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Palmitoyl pyrazinamid đƣợc tổng hợp tại Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh. Chất đối chiếu Palmitoyl pyrazinamide đƣợc tổng hợp và x{c định công thức cấu tạo cũng nhƣ độ tinh khiết tại Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh đạt tiêu chuẩn là chất chuẩn, có h|m lƣợng 99,98% tính trên chế phẩm làm khan. Hóa chất – dung môi Acid hydrocloric, acid phosphoric, natri 1- heptansulfonat, acid percloric, kali hydroxyd đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Acetonitril (ACN), methanol đạt tiêu chuẩn sắc ký lỏng (Merck). Trang thiết bị Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters Alliance 2695, đầu dò dãy diod quang 2996 (Waters, Mỹ). Cân phân tích Sartorius CP 224D (Sartorius, Đức). M{y đo pH Metrohm 744 (Metrohm, Đức). Bể siêu âm Elma T840 DH (Elma, Đức). Phƣơng pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện sắc ký Công thức phân tử của PP là C21H35O2N3, có khối lƣợng phân tử M = 361,53 g/mol Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 199 Hình 1: Công thức cấu tạo của palmitoyl pyrazinamid PP là một hợp chất kém phân cực trong đó có nh}n pyrazin tƣơng đối phân cực hơn so với các phần cấu trúc còn lại dẫn đến hợp chất này dễ tan trong cloroform, rất kém tan trong nƣớc. Các tạp chất liên quan có thể có bao gồm nguyên liệu palmitoyl clorid và pyrazinamide còn tồn dƣ l| c{c hợp chất rất hoặc tƣơng đối phân cực. Do vậy phƣơng ph{p sắc ký lỏng pha đảo đƣợc lựa chọn vì tính phổ biến, dung môi pha động phân cực ít độc hại hơn, v| dễ dàng phát triển để định lƣợng, thử tinh khiết các hợp chất và chế phẩm liên quan. Đầu dò dãy diod quang - photodiode array detector (PDA) cũng đƣợc ƣu tiên để nghiên cứu vì PP có 2 đỉnh hấp thu cực đại ở bƣớc sóng λ = 220,5 nm và 268,0 nm. Trong khi PZA có 2 đỉnh hấp thu cực đại là 207 nm và 268 nm. Tiến hành khảo sát 4 hệ pha động khác nhau: ACN – Acid acetic 1% (85:15); ACN – Acid acetic 1,5% (90:10); ACN 100%; MeOH-H2O (95:5); 2 loại cột sắc ký pha đảo C18: Phenomenex; Intersil; và cố định các yếu tố khác bao gồm: nhiệt độ cột 30 0C, thể tích tiêm mẫu 20 µl, tốc độ dòng 1ml/phút. Thẩm định quy trình định lượng PP Tiến hành thẩm định quy trình theo hƣớng dẫn của ICH (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Sau khi đƣợc thẩm định, quy trình này sẽ đƣợc ứng dụng để tìm hệ số phân bố log P của PP. Mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng Pha dung dịch PP chuẩn và thử có nồng độ 150 ppm trong ACN: cân chính xác 150 mg PP chuẩn hoặc PP nguyên liệu cho vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 65 ml ACN, siêu âm 5 phút. Thêm ACN vừa đủ thể tích, lắc đều. Hút chính xác 10 mL dung dịch này pha loãng thành 100 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. Mẫu trắng là dung môi pha mẫu thử. Xác định hệ số phân bố của palmitoyl pyrazinamid Dựa vào phần mềm MarvinSketch 17,7 và MarvinView 17,7 của ChemAxon để chọn pH mà ở đó PP chỉ tồn tại ở dạng không ion hóa, pH mà PP tồn tại ở dạng không ion hóa là 3,8 – 4,0. Pha dung dịch chuẩn nồng độ 55,5 ppm trong pha octanol hoặc trong pha nƣớc. Trong pha nƣớc sử dụng dung dịch đệm pH = 3,8 (hệ đệm CH3COOH/CH3COONa 0,1 M) để pha dung dịch Hút chính xác 20 mL dung dịch chuẩn trong pha nƣớc cho vào mỗi bình lắng gạn 60 mL, sau đó cho tiếp mỗi bình lắng gạn 20 mL dung dịch chuẩn trong pha octanol. Thực hiện tất cả là 3 bình lắng gạn. Lắc phân bố mỗi bình trong 30 phút, tiếp đục để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Hút chính xác 2 mL từ pha octanol cho vào bình định mức 100 mL, thêm dung môi Acetonitril vừa đủ 100 mL. L|m tƣơng tự cho 2 bình định mức còn lại tƣơng ứng với các bình lắng gạn. X{c định nồng độ PP bằng quy trình định lƣợng đã đƣợc thẩm định ở trên. Hút chính xác 10 mL dung dịch chuẩn 55,5 ppm, và 2 mL dung dịch trong pha nƣớc cho v|o bình định mức 20 mL. Lắc đều, thực hiện tƣơng tự đối với 2 bình định mức 20 mL còn lại tƣơng ứng với c{c pha nƣớc trong bình lắng gạn. X{c định nồng độ PP bằng quy trình định lƣợng đã đƣợc thẩm định ở trên. Nồng độ PP trong pha octanol đƣợc tính nhƣ sau: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 200 Nồng độ PP trong pha nƣớc đƣợc tính nhƣ sau: Hệ số phân bố: Log P Trong đó: Sthử: diện tích pic thử Schuẩn: diện tích pic chuẩn N: hệ sô pha loãng (N=50) H%: h|m lƣợng % PP chuẩn tính theo chế phẩm làm khan CPha octanol: Nồng độ của PP trong pha octanol CPha nƣớc: Nồng độ của PP trong pha octanol KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký Kết quả khảo s{t điều kiện sắc ký trên mẫu chuẩn 100 ppm đƣợc thể hiện qua bảng 1. Bảng 1: Kết quả khảo s{t điều kiện sắc ký trên mẫu chuẩn 100 ppm khi thay đổi pha động và cột sắc ký Pha động khảo sát Thông số pic Cột sắc ký Nồng độ mẫu (ppm) Thời gian ưu (phút) Diện tích (µAu x giây) Chiều cao Độ phân giải RS Hệ số kéo đuôi T ACN – Acid acetic 1% (85:15) Phenomenex 100,0 21,734 961499 20506 10,56 1,48 ACN – Acid acetic 1,5% (90:10) Intersil 100,0 23,935 2742253 66896 24,08 1,23 ACN 100% Intersil 100 9,651 2989975 272879 1,11 MeOH-H2O (95:5) Intersil 99,6 14,644 3961137 209545 5,74 1,12 (a) (b) (c) (d) Hình 2: Sắc ký đồ thu được khi khảo s{t điều kiện sắc ký kh{c nhau: a) Pha động ACN – Acid acetic 1% (85:15) / cột Phenomenex; b) Pha động ACN – Acid acetic 1,5% (90:10) / Cột Intersil; c) Pha động ACN 100% / Cột Intersil; d) Pha động MeOH – H2O (95:5) / Cột Intersil Điều kiện sắc ký thích hợp đƣợc lựa chọn để tiến h|nh c{c bƣớc tiếp theo là: Cột sắc ký: Intersil, 250 x 4,6 mm; 5 µm; Nhiệt độ cột: 30 oC; Detector: PDA; Bƣớc sóng phát hiện: 268 nm; Pha động: 100% CAN; Tốc độ dòng: 1 mL/phút; Thể tích tiêm: 20 µL; Nồng độ mẫu: 150 µg/mL. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 201 Thẩm định quy trình định lƣợng PP Tính tương thích hệ thống Bảng 2: Kết quả khảo s{t tính tương thích của hệ thống trên mẫu chuẩn (n=6) Thời gian ưu (phút) Diện tích pic (µAu x giây) Số đĩa lý thuyết Hệ số dung ượng K Độ phân giải Hệ số kéo đuôi % diện tích pic TB 9.617 4486292 73778 1.57 5.25 1.15 99.58 RSD% 0.13 0.18 0.74 0.26 1.02 1.02 0.01 Kết quả thu đƣợc cho thấy hệ thống phù hợp cho việc phân tích PP trong nguyên liệu bằng phƣơng ph{p HPLC do tất cả các thông số sắc ký thu đƣợc qua 6 lần tiêm mẫu chuẩn 150 ppm đều có RSD ≤ 2%; hệ số kéo đuôi của pic PP nằm trong khoảng 0,9 – 1,5; Số đĩa lý thuyết N ≥ 2000. Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu trắng, thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 3: Kết quả khảo s{t độ đặc hiệu của phương pháp: a) Sắc ký đồ của mãu trắng; b) Sắc ký đồ của mẫu chuẩn; c) Sắc ký đồ của mẫu thử; d) Sắc ký đồ của mẫu thử thêm chuẩn; e) Phổ hấp thu tử ngoại khả kiến của PP thu được từ pic chính của sắc ký đồ mẫu thử; f) Đồ thị minh họa độ tinh khiết của pic PP trong mẫu thử Kết quả thu đƣợc cho thấy: phổ UV-Vis tại thời gian lƣu của pic PP trong mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau, thời gian lƣu của pic trong mẫu chuẩn (hình 3b) tƣơng đƣơng với thời gian lƣu của pic PP trong mẫu thử (hình 3c), mẫu trắng là dung môi hòa tan mẫu ACN không cho pic của PP trên sắc ký đồ tại thời gian lƣu 9,59 phút (hình 3a), sử dụng chức năng kiểm tra độ tinh khiết của pic cho thấy pic PP trong mẫu thử tinh khiết (hình 3f), Chiều cao mẫu thử thêm chuẩn tăng tƣơng ứng với lƣợng thêm vào (hình 3d). Do đó, có thể khẳng định qui trình ph}n tích có tính đặc hiệu. Tính tuyến tính Dựa vào phần mềm Excel, lập đƣợc đƣờng tuyến tính biểu diễn sự tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh (Hình 4): ŷ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 202 = 30244 x + 23819, hệ số tƣơng quan: R2 = 0,9997, Hệ số slope a = 30244 và hệ số intercept b = -23819. Phƣơng trình tƣơng thích với độ tin cậy 95% (< α = 0,05); Pa= 35,86E-10 < α = 0,05 (Hệ số a có ý nghĩa); Pb 0,510226 > α = 0,05 (Hệ số b không có ý nghĩa). Vậy phƣơng trình tƣơng quan hồi quy giữa nồng độ và diện tích đỉnh của PP tại bƣớc sóng 268 nm l|: ŷ = 30244 x. Khoảng nồng độ tuyến tính của PP là: 12,5 – 250 µg/mL. Giới hạn phát hiện: LOD = 5,8 µg/mL. Giới hạn định lƣợng: LOQ = 17,6 µg/mL. Hình 4: Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ và diện tích pic PP Độ chính xác Độ lặp lại: Phƣơng ph{p đạt độ lặp lại với h|m lƣợng trung bình của mẫu là 99,98%, RSD = 0,91% (n = 6). Độ chính x{c trung gian: Phƣơng ph{p đạt độ chính xác với h|m lƣợng trung bình của mẫu là 99,36%, RSD = 0,96% (n = 12). Độ đúng X{c định dựa vào tỷ lệ phục hồi ở 80%, 100% và 120% nồng độ PP so với nồng độ tiến hành. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 3. Tỷ lệ hồi phục của các mẫu thực nghiệm đều nằm trong giới hạn cho phép (97,67 – 99,52%). Vậy phƣơng ph{p đề xuất đạt yêu cầu về độ đúng. Từ kết quả trong bảng 3, PP có thể định lƣợng bằng phƣơng ph{p HPLC, phƣơng ph{p có tính chính x{c cao, x{c định chính xác lƣợng tạp nếu có. Bảng 3: Kết quả khảo s{t độ đúng Mức thêm chuẩn Tỷ lệ phục hồi (%) 80% 98,36 97,60 97,87 100% 99,75 99,52 99,84 120% 99,19 99,50 99,52 Trung bình 99,02 RSD% 0,86 Khảo sát hằng số phân bố Log P của PP Dựa vào phần mềm Marvin Sketch 17.7 và Marvin Sketch 17.7, dự đo{n gi{ trị logP của palmitoyl pyrazinamid là 5,24 (Hình 5). Hình 5: Kết quả dự đoán giá trị logp theo phần mềm Marvin Stretch 17.7 và Marvin View 17.7 của chemaxon Bảng 4: Kết quả tính toán giá trị logP của PP Mẫu Nồng độ PP trong pha nước (ppm) Nồng độ PP trong pha octanol (ppm) P LogP M1 0,070 1593 22757 4,36 M2 0,115 1608 13983 4,15 M3 0,035 1612 46057 4,66 Trung Bình 4,39 BÀN LUẬN Pha động có acid khiến chiều cao peak giảm đáng kể do acid acetic có ảnh hƣởng đến độ hấp thu ở bƣớc sóng khảo sát, pic kéo đuôi (hệ số kéo đuôi >1,20), xuất hiện pic tạp lớn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 203 bất thƣờng, dự đoán do pH không phù hợp khiến PP tồn tại ở các dạng muối khác nhau có độ phân cực khác nhau dẫn đến bị rửa giải không cùng lúc. Tình trạng này lặp lại khi sử dụng pha động có thêm nƣớc. Do vậy pha động chứa acetonitril 100% là phù hợp nhất với các thông số sắc ký tối ƣu, chiều cao pic đạt đƣợc tối đa, pic gọn và đẹp. Vì palmitoyl pyrazinamid là một chất sơ nƣớc, rất khó tan trong nƣớc, nên nồng độ của hợp chất PP trong pha nƣớc rất thấp, dƣới ngƣỡng phát hiện của đầu dò PDA. Do đó, dùng phƣơng ph{p thêm chuẩn để định lƣợng PP trong pha nƣớc. Do vậy mẫu PP trong pha nƣớc trong dung dung dịch tiêm HPLC đã đƣợc thêm 10 mL dung dịch PP chuẩn có nồng độ 55,5 ppm trƣớc khi pha loãng thành 20 mL. Kết quả tính toán giá trị logP bằng thực nghiệm đƣợc trình bày ở Bảng 4 cho thấy so với giá trị dự đo{n thì gi{ trị logP của thực nghiệm nhỏ hơn 0,85. Gi{ trị pH của pha nƣớc trƣớc và sau khi lắc phân bố nằm trong khoảng 3,8 - 4,0. Sử dụng phần mềm Marvin Sketch 17.7 và Marvin Sketch 17.7, dự đo{n dạng tồn tại của PP theo pH, nhận thấy phân tử palmitoyl pyrazinamid tồn tại trong dung dịch ở dạng không ion hóa 100%. KẾT LUẬN Đề t|i đã x}y dựng và thẩm định đƣợc qui trình định lƣợng PP nguyên liệu bằng phƣơng ph{p HPLC đạt yêu cầu quy trình phân tích về tính tƣơng thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ chính x{c v| độ đúng trong khoảng tuyến tính. Quy trình đã đƣợc ứng dụng để x{c định hệ số phân bố Log P của PP bằng thực nghiệm là 4,39, với kết quả không khác biệt nhiều so với dự đo{n bằng các phần mềm chuyên dụng. Từ kết quả đạt đƣợc đề tài có thể đƣợc phát triển để áp dụng trong việc tiêu chuẩn hóa nguyên liệu và chế phẩm bào chế từ PP cũng nhƣ theo dõi động học v| sinh dƣợc học của PP trong hệ thống phân phối tới phổi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Edwards DA, Hanes J, Caponetti G, Hrkach J, Ben-Jebria A, Eskew ML, Mintzes J, Deaver D, Lotan N, Langer R (1997). Large porous particles for pulmonary drug delivery. Science. 276(5320):1868-1871. 2. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005). Validation of analytical procedures: text and methodology. 1-5. 3. Pham DD (2014). Particulate systems for lung delivery of pyrazinamide for tuberculosis treatment. Thèse de doctoral. Université Paris Sud - Paris XI. Paris. 4. Tsapis N, Bennett D, O'Driscoll K, Shea K, Lipp MM, Fu K, Clarke RW, Deaver D, Yamins D, Wright J, Peloquin CA, Weitz DA, Edwards DA. (2003). Direct lung delivery of para-aminosalicylic acid by aerosol particles. Tuberculosis (Edinb). 83(6):379-385. 5. WHO (2010). Treatment of Tuberculosis Guidelines.1-5. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018