Xây dựng quy trình Multiplex PCR định týp gen vacA và cagA trên mẫu mô sinh thiết ung thư dạ dày

1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR ĐỊNH TÝP GEN vacA VÀ cagA TRÊN MẪU MÔ SINH THIẾT UNG THƯ DẠ DÀY Lê Thị Thanh Bình*, Trần Thiện Trung** TÓM TẮT Đặt vấn ñề: ung thư dạ dày là căn bệnh gây tử vong ñứng hàng thứ II trên thế giới chỉ sau ung thư phổi. Helicobacter pylori (H. pylori) ñược Viện Nghiên Cứu Ung Thư Quốc Tế xếp loại là tác nhân loại I gây UTDD vào năm 1994 dựa trên hai protein gây ñộc chính là VacA và CagA . Mục tiêu: xây dựng quy trình Multiplex PCR nhằm xác ñịnh nhanh ñồng thời các týp gen vacA và cagA của Helicobacter pylori từ mẫu mô sinh thiết ung thư dạ dày. Phương pháp: ñun mô sinh thiết trong dung dịch ñệm PBS, tối ưu chương trình nhiệt và các thành phản ứng cho quy trình Multiplex PCR, ñiện di, giải trình tự, ño ñộ nhạy của quy trình, so sánh kết quả quy trình với hai tiêu chuẩn vàng CLOtest và Chẩn ñoán mô bệnh học (Giải phẫu bệnh). Kết quả: xây dựng thành công quy trình có ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu hoàn toàn phù hợp với kết quả CLOtest, chẩn ñoán mô bệnh, kết quả giải trình tự và các kết quả nghiên cứu của các tác giả trong và ngoài nước. Kết luận: quy trình có thể ñưa vào ứng dụng ñể xác ñịnh các kiểu gen vacA và cagA của Helicobacter pylori trên bệnh nhân ung thư dạ dày và những bệnh nhân bị viêm loét dạ dày tá tràng ñể phân loại nhóm nguy cơ cao và nguy cơ thấp. Từ ñó ñưa ra chiến lược tầm soát và ñiều trị H. pylori triệt ñể góp phần dự phòng UTDD. Từ khóa: Helicobacter pylori, ung thư dạ dày, quy trình Multiplex PCR. ABSTRACT ESTABLISHING A MULTIPLEX PCR FOR GENOTYPING OF vagA AND cagA GENES OF HELICOBACTER PYLORI FROM GASTRIC CANCER BIOPSY SAMPLES Le Thi Thanh Binh, Tran Thien Trung Background: gastric cancer (stomach cancer) is the second most common cause of death worldwide behind cancer of the lung. Helicobacter pylori has been as a class I carcinogen by the International Agency for Research on Cancer 1994 through VacA and CagA proteins. Objective: establishing a multiplex PCR for identification of the vagA and the cagA genes of Helicobacter pylori from gastric cancer biopsies. Methods: from 88 biopsy samples of 44 pattients with gastric cancer, boiling of biopsy samples in sterile PBS buffer, optimization of multiplex PCR cycling conditions and of Multiplex reaction components, centrifugation followed by PCR assay, sequencing PCR products, and comparing results of PCR with two gold - standard CLOtest and histology. * Bệnh viện Từ Dũ. Liên hệ: Bs Lê Thị Thanh Bình- ĐT: 0909519398 Email: lebinh.genetic@gmail.com ** Đại học Y Dược TPHCM 2 Results: process gains specificity and the sensittivity suiting the results of CLOtest, histology, sequencing, studying of authors in country and in the world. Conclution: This Multiplex PCR assay could apply to determine vacA and cagA of H. pylori from biopsy specimens of gastric cancer, gastritis or peptic ulcer patients to class high risk and low risk groups. From the results, clinicals could establish a strategy for screening and eradicating absolutely H. pylori to prevent gastric cancer. Keywords: Helicobacter pylori, Gastric cancer, multiplex PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày (UTDD) là dạng ung thư phổ biến gây tử vong ñứng hàng thứ II trên thế giới chỉ sau ung thư phổi. Ung thư dạ dày phát triển chậm qua nhiều năm, tỷ lệ sống sót thấp nguyên nhân là do phần lớn bệnh thường ñược chẩn ñoán muộn nên khả năng ñiều trị triệt ñể thấp vì giai ñoạn sớm có ít hoặc không có triệu chứng ñặc hiệu. Theo thống kê dịch tễ học và kết quả của các công trình nghiên cứu cho ñến nay, nhiễm Helicobacter pylori (H. pylori) ñược xem là nguyên nhân quan trọng dẫn ñến UTDD dựa trên hai protein gây ñộc chính của H. pylori là CagA và VacA. Hai vùng gen mã hóa cho hai protein này là hai vùng gen ña hình tạo nên các chủng của H. pylori có ñộc lực khác nhau. Theo Xiang và cs (1995), H. pylori ñược chia thành 2 týp: týp 1 bao gồm các chủng H. pylori có ñộc lực mang kiểu gen s1m1cagA+, s1m2cagA+ ; týp 2 gồm các chủng H. pylori không có ñộc lực mang kiểu gen s2m2cagA- [17]. Từ những tính ñộc lực khác nhau này sẽ dẫn ñến các mức ñộ bệnh khác nhau của dạ dày - tá tràng như viêm dạ dày, loét dạ dày tá tràng và ung thư dạ dày. Như vậy có thể thấy việc tầm soát và ñiều trị triệt ñể H. pylori là biện pháp dự phòng cho ung thư dạ dày. Phương pháp sinh học phân tử là phương pháp duy nhất có thể giúp xác ñịnh chính xác kiểu gen của H. pylori thuộc nhóm nguy cơ cao hay nguy cơ thấp gây UTDD. Chúng tôi xây dựng quy trình Multiplex PCR với mục tiêu xác ñịnh nhanh ñồng thời các týp gene vacA và cagA của H. pylori trong cùng một phản ứng từ mẫu sinh thiết của bệnh nhân bị ung thư dạ dày sao cho chính xác và hiệu quả kinh tế. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Chọn mẫu bệnh phẩm : là các mẫu mô sinh thiết dạ dày ñược lấy bằng kỹ thuật nội soi từ 44 bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở 2 vị trí mô lành và mô bệnh tại hang vị của dạ dày và ñược làm cùng một lúc 3 xét nghiệm chẩn ñoán H. pylori : CLO test (test urease), Chẩn ñoán mô học (giải phẫu bệnh) và chẩn ñoán bằng PCR. Nguồn thu mẫu : bệnh viện Đại học Y Dược TPHCM. Trữ mô ở nhiệt ñộ – 200C. Mồi: sử dụng 3 cặp mồi ñặc hiệu của H. pylori là CAGA, Va1 và VAG từ công trình nghiên cứu của Yamaoka và cs (1999), Cover và cs (1994) và Atherton và cs (1995); 1 cặp mồi chứng nội hGSTP từ công trình của Menegon và cs (1998). Kiểm tra tính không bắt cặp bổ sung và ñộ ñặc hiệu của các cặp mồi trên các phần mềm chuyên dụng. Các cặp mồi này ñược tổng hợp từ công ty IDT (Hoa Kỳ) [1,5,10,18]. Chứng nội tại dương tính sẽ chứng minh ñược khâu tách chiết và khuếch ñại ñộ nhạy không bị ức chế [16]. DNA của mẫu mô : ñược thu nhận từ mẫu mô ñun trong dung dịch ñệm PBS vô trùng. Các vật liệu và hóa chất khác: thang 100 bp Marker (Bio - Rad), Taq DNA polymerase (Bio - Rad) kèm theo dNTPs, PCR buffer, MgCl2, và H2O khử ion của hãng; PBS vô trùng; hóa chất dùng cho ñiện di do công ty Khoa Thương cung cấp. 3 Quy trình Multiplex PCR : khuếch ñại ñồng thời nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng. Nguyên tắc khi chuẩn hóa quy trình: (1) ñầu tiên chọn ra chu trình nhiệt cho PCR mồi ñơn nhưng phù hợp với các cặp mồi ñể làm cơ sở cho việc chuẩn hóa quy trình PCR mồi ña. Chu trình ñược áp dụng trên cùng một loại máy luân nhiệt; (2) sử dụng các cặp mồi cùng một nồng ñộ ở bước ñầu tiên, sau ñó dựa vào kết quả phản ứng sẽ cho biết bước tiếp theo cần phải ñiều chỉnh nồng ñộ mồi và các tham số khác như thế nào; (3) khi tối ưu một thành phần nào ñó trong phản ứng thì những thành phần còn lại sẽ ñược giữ cố ñịnh. Thành phần mix PCR mồi ñơn ban ñầu: Taq DNA polymerase (1U/25µl); 1 cặp mồi (0,2 µM); MgCl2 (1,5 mM); dNTPs (200 µM/mỗi loại); dung dịch ñệm (1X); dH20; DNA khuôn (5µl). Chương trình nhiệt PCR mồi ñơn ban ñầu: (1) Nhiệt ñộ : nhiệt ñộ biến tính là 950C, nhiệt ñộ lai là 520C và nhiệt ñộ kéo dài là 720C; (2) Chu kỳ nhiệt: 1 chu kỳ ñầu tiên là 950C trong 3phút 30 giây; 35 chu kỳ tiếp theo, mỗi chu kỳ gồm : 940C trong 20 giây, 620C trong 40 giây, 720C trong 40 giây; (3) 1 chu kỳ cuối là 720C trong 6 phút. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 3% với 3µl thang DNA 100bp, 5µl dd nạp mẫu 1X, 9µl sản phẩm PCR, 8 µl ethidium bromide (10mg/ml), hiệu ñiện thế U= 100Volt trong 35 - 40 phút. Đánh giá ñộ nhạy của quy trình: dựa trên mẫu sinh thiết ñã biết chắc chắn dương tính, ño nồng ñộ DNA trong dung dịch, pha loãng theo log cơ số 10 với các nồng ñộ 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 và sau ñó xác ñịnh nồng ñộ DNA tối thiểu trong phản ứng PCR có thể phát hiện ñược H. pylori. Đánh giá ñộ ñặc hiệu của sản phẩm PCR [16]: gửi giải trình tự 3 sản phẩm PCR của 3 bệnh nhân ở CTY Macrogen (Hàn Quốc). Kết quả ñược giải theo lần lượt từng cặp mồi xuôi và ngược. Đọc kết quả trình tự bằng công cụ Blast trên NCBI. So sánh hiệu quả chẩn ñoán của quy trình với kết quả của hai tiêu chuẩn vàng CLO test và Chẩn ñoán mô bệnh học. [13] KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát vị trí mô Kết quả khảo sát sơ bộ sự hiện diện của H. pylori trong 32 mẫu bệnh phẩm từ 8 bệnh nhân có kết quả CLOtest dương tính cho thấy tỷ lệ H. pylori dương tính ở mô lành cao hơn mô bệnh (mô lành là 87,5 % và mô bệnh là 75,0 %). Kết quả trên cũng phù hợp với nguyên lý của Mobley và cs (2001) [15] về tính bám dính và xâm thực của H. pylori cũng như sự nhận ñịnh của El - Zimaity (2000) [6], Tang YL và cs (2005) [14], Chey WD, Wong BCY. (2007) [4] và Nguyễn Ngọc Huyền (2009) [12] về cách chẩn ñoán sự hiện diện của H. pylori trên mẫu mô sinh thiết. Vì vậy chúng tôi quyết ñịnh chọn mẫu ở vị trí mô lành ñể tiếp tục cho quy trình nghiên cứu tiếp theo. Hình 1: Kết quả khảo sát sự hiện diện của H.pylori ở các vị trí mô lành và mô bệnh có kết quả CLO test dương tính. Sử dụng cặp mồi CAGA ñể khảo sát. Ký hiệu mẫu: 1,2: mô bệnh; 3,4 : mô lành; . 4 Khảo sát nồng ñộ mồi và chương trình nhiệt (mẩu DNA ñược dùng tối ưu là những mẫu ñã ñược giải trình tự có kết quả hoàn toàn ñặc hiệu với H. pylori) Tiêu chí ñể chúng tôi khảo sát nhiệt ñộ lai là nhiệt ñộ này phải phù hợp với các cặp mồi của H. pylori và cặp mồi chứng nội hGSTP sao cho các cặp mồi này ñạt hiệu quả khuếch ñại cao nhất trong cùng một phản ứng PCR. Đầu tiên chúng tôi khảo sát chương trình nhiệt PCR một cặp mồi trước, sau ñó lấy kết quả vừa khảo sát làm cơ sở ñể chuẩn hóa chương trình nhiệt cho quy trình Multiplex PCR 4 cặp mồi. Chúng tôi ñưa ra nhiều chương trình (khác nhau về nhiệt ñộ lai, số chu kỳ luân nhiệt, thời gian biến tính, thời gian lai và thời gian kéo dài). Chúng tôi ñiều chỉnh nhiệt nồng ñộ mồi theo nhiệt ñộ lai. Cuối cùng chúng tôi ñã tìm ñược một chương trình nhiệt chuẩn cho quy trình Multiplex PCR ((hình 2,3) với nhiệt ñộ lai là 620C, nồng ñộ 4 cặp mồi lần lượt là : VAG 0,2 µM; CAGA 0,2 µM; VA1 0,5 µM; hGSTP 0,4 µM. Hình 2 : Kết quả khảo sát nồng ñộ mồi cùng với các nhiệt ñộ lai 610C, 620C, 630C, 650C cho 4 cặp mồi VAG, VA1, CAGA và hGSTP trên 3 bệnh nhân trong hệ thống Multiplex PCR 4 cặp mồi.; Nồng ñộ hai cặp mồi VAG và CAGA là 0,2 µM/ 1 cặp mồi; Nồng ñộ hai cặp mồi VA1(s1/s2) và hGSTP là 0,4 µM / 1 cặp mồi; Mũi tên : là những vạch band không ñặc hiệu. Hình 3 : Kết quả khảo sát nồng ñộ mồi cùng với các nhiệt ñộ lai 610C, 620C cho 4 cặp mồi VAG, VA1, CAGA và hGSTP trên 3 bệnh nhân trong hệ thống Multiplex PCR. Nồng ñộ hai cặp mồi VAG và CAGA là 0,2 µM/ 1 cặp mồi; Nồng ñộ cặp mồi VA1 là 0,5 µM và hGSTP là 0,4 µM. Tối ưu các thành phần phản ứng Khảo sát nồng ñộ Taq DNA polymerase Hình 4 : Khảo sát nồng ñộ Taq DNA polymerase trên 3 bệnh nhân với các nồng ñộ 1U, 2U, 2,5U và 3U Kết quả cho thấy Taq DNA polymerase với nồng ñộ 2U cho phản ứng tối ưu phù hợp với nồng cagA 349 bp 5 ñộ Taq DNA polymerase trong thành phần mix multi PCR của chúng tôi ñưa ra và phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước ñây [2,8,9]. Như vậy, nồng ñộ Taq DNA polymerase chuẩn là 2U. Khảo sát chỉ số MgCl2 /dNTPs Đây là chỉ số quan trọng nhất của quy trình, quyết ñịnh hoạt tính của Taq DNA polymerase. Ion Mg2+ là cofactor của Taq DNA polymerase. Mg2+ tự do gắn vào Taq DNA polymerase giúp Taq pol. có thể gắn vào DNA khuôn, vào mồi, vừa gắn vào dNTPs ñể thực hiện sự tổng hợp. Điều này giải thích tại sao tăng nồng ñộ dNTP lên cao, sẽ ức chế nhanh phản ứng PCR trong khi tăng nồng ñộ MgCl2 lên cao thường tạo ra hiệu quả dương tính. Tuy nhiên nếu nồng ñộ MgCl2 quá cao sẽ ức chế hoạt tính của Taq polymerase, làm giảm số lượng sản phẩm mong muốn. Giữ nguyên nồng ñộ của các thành phần khác trong mix PCR, chúng tôi lần lượt thay ñổi nồng ñộ MgCl2 và dNTPs. Kết quả (hình 5 và 6) cho thấy, MgCl2 ở nồng ñộ 3,5 mM và dNTPs ở nồng ñộ 400 µM cho kết quả sản phẩm PCR ñặc hiệu, rõ, ñẹp và ổn ñịnh hơn so với các nồng ñộ khác. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả Newton CR và cs (1997), và Grunenwald H (2003) [7,11]; Henegariu O (1997) [9]; Zangenberg G và cs (1999) [19]. Hình 5 : Kết quả khảo sát nồng ñộ MgCl2 với các nồng ñộ 1,5mM, 2mM, 2,5mM, 3mM, 3,5mM, 10,8mM, 20mM Hình 6 : Kết quả khảo sát nồng ñộ dNTPs với các nồng ñộ 200 µM, 400 µM và 800 µM; Mũi tên ñen: các băng không ñặc hiệu. Khảo sát nồng ñộ dung dịch ñệm và chất hỗ trợ phản ứng DMSO 5% Nồng ñộ dung dịch ñệm chuẩn cho một phản ứng PCR mồi ñơn phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng. Đối với Taq polymerase, nồng ñộ ñệm thường là 1X (50 mM KCl; 10 mM Tris - HCl pH 8,3 và 50 mM KCl; 0,001% gelatin) (Cetus buffer). Trong hệ thống multiplex PCR, nồng ñộ ñệm có thể ñược tăng lên 1,6X (Chamberlain và cs, 1988) hoặc lên ñến 2X (Henegarin và cs, 1997) ñể làm tăng hiệu quả hoạt ñộng của Taq polymerase. Hình 7 : Kết quả khảo sát nồng ñộ dung dịch ñệm với các giá trị 1X; 1,6X; 2X và DMSO 5% 6 Nồng ñộ ñệm sẽ hiệu quả hơn rất nhiều khi sử dụng các chất hỗ trợ phản ứng như DMSO, glycerol, BSA,[3,8]. Kết quả (hình 7) cho thấy, ở nồng ñộ 1X cho kết quả tốt nhất trong quy trình của chúng tôi. Điều này cho thấy nồng ñộ muối trong dung dịch ñệm ñã ñủ cho phản ứng khuếch ñại hiệu quả. Vai trò DMSO trong khảo sát không làm thay ñổi kết quả phản ứng. Khảo sát ñộ nhạy Theo kết quả (hình 8): (1) Ngưỡng DNA khuôn cho chứng nội và H. pylori thấp nhất mà quy trình có thể phát hiện là 10-3 tương ñương lượng DNA khuôn là 3,21 ng. Đây là một ñộ nhạy rất cao. Theo Grunenwald (2003), DNA khuôn cần cho phản ứng Multiplex PCR là từ 2 - 2500 ng [7]. Theo Zangenberg G và cs (1999) lượng DNA bộ gen người làm khuôn cần cho một phản ứng Multiplex PCR tối ưu là từ 10 - 100 ng [19]. Hình 8: Khảo sát ñộ nhạy của phản ứng với các nồng ñộ pha loãng 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của sản phẩm PCR Kết quả giải trình tự, sau khi phân tích bằng công cụ BLAST trên Ngân hàng dữ liệu gen quốc gia Mỹ NCBI cho thấy sản phẩm hoàn toàn ñặc hiệu với vi khuẩn Helicobacter pylori. Áp dụng quy trình trên 44 bệnh nhân - Hiệu quả chẩn ñoán của quy trình: Ung thư (n = 44) Tình trạng CLO test CĐMBH PCR + 33 18 28 H. pylori - 11 26 16 Sự hợp lý khi kết hợp ñộ nhạy cao của CLO test và ñộ ñặc hiệu cao của Chẩn ñoán mô học ñược thể hiện ở kết quả phương pháp PCR của chúng tôi như sau: kết quả PCR dương tính tất cả các mẫu ñó ñều có kết quả CLO test dương tính; PCR âm tính tất cả các mẫu ñó ñều có kết quả chẩn ñoán mô bệnh học âm tính; khi mẫu có kết quả CLO test âm tính thì mẫu ñó cũng có kết quả PCR và Chẩn ñoán mô học âm tính. Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi thiết nghĩ có thể dùng kết quả chẩn ñoán mô bệnh học ñể kiểm tra âm tính giả của PCR, và ñộ nhạy của CLO test ñể kiểm tra kết quả dương tính giả của PCR. CLO test và Chẩn ñoán mô học vẫn là "tiêu chuẩn vàng" ñể kiểm tra tính hiệu quả của một phương pháp chẩn ñoán mới. KẾT LUẬN Chúng tôi ñã xây dựng thành công quy trình Multiplex PCR 4 cặp mồi bao gồm: (1) CAGA F/R nhân bản phân ñoạn gen cagA (349bp) ; (2) VA1 F/R nhân bản phân ñoạn gen vacA s1 (259 bp), vacA s2 (286 bp); (3) VAG F/R nhân bản phân ñoạn gen 7 vacA m1 (567 bp), vacA m2 (642 bp); 1 cặp mồi chứng nội hGSTP nhân bản phân ñoạn gen hGSTP (192 bp) từ mẫu mô sinh thiết ở vị trí mô lành ñược xử lý ñun mô trong PBS. Đây là quy trình ñược nghiên cứu ñầu tiên ở Việt Nam trên mẫu mô sinh thiết ñể phát hiện trực tiếp kiểu gen vacA và cagA của Helicobacter pylori với ñộ nhạy của quy trình là 10-3 tương ứng với 3,21ng DNA khuôn. Chưong trình nhiệt của quy trình : (1) Nhiệt ñộ : nhiệt ñộ biến tính là 950C, nhiệt ñộ lai là 620C và nhiệt ñộ kéo dài là 720C; (2) Chu kỳ nhiệt: 1 chu kỳ ñầu tiên là 950C trong 3phút 30 giây; 35 chu kỳ tiếp theo, mỗi chu kỳ gồm : 940C trong 20 giây, 620C trong 40 giây, 720C trong 40 giây; 1 chu kỳ cuối là 720C trong 6 phút. Thành phần mix PCR: Taq DNA polymerase (2U/25µl); VA1 F/R là 0,5 µM; VAG F/R : 0,2 µM; CAGA F/R : 0,2 µM; hGSTP : 0,4 µM; MgCl2 : 3,5 mM; dNTPs : 400 µM/mỗi loại; dung dịch ñệm : 1X; dH20; DNA khuôn : 5µl. Quy trình không sử dụng các hóa chất làm tan mô và tách chiết DNA ñã giảm chi phí và thời gian xử lý mẫu rất nhiều so với phương pháp tách chiết truyền thống. Có thể ứng dụng quy trình này vào việc tầm soát các kiểu gen nguy cơ cao của Helicobacter pylori gây UTDD, giúp phát hiện sớm UTDD, làm giảm tỷ lệ tử vong cho bệnh này gây ra cho người bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Atherton JC, Cao P, Peek RM, et al. (1995). Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. Association of specific vacA types with cytotoxin production and peptic ulceration. J. Biol. Chem. 270: 17771 - 17777. 2. Chamberlain J. S, Chamberlain J. R. 1994. The Polymerase Chain Reaction (Mullis K, Ferré F, Gibbs R. A, Eds.). Chapter 3 Optimization of Mutiplex PCR. Birkhauser, Boston. 3. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyên PN, Caskey CT. 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Ac Res. 16 : 11141 - 11156. 4. Chey WD, Wong BCY. (2007). American College of Gastroenterology Guideline on the Management of Helicobacter pylori Infection. Am. J Gastroenterol. 102:1808-1825. 5. Cover TL, Tummuru MKR, Cao P, Tompson SA, and Blaser MJ. (1994). Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains. J. Biol. Chem. 269:10566-10573. 6. El-Zimaity HM. (2000). Accurate diagnosis of Helicobacter pylori with biopsy. Gastroenterol Clin N Am. 29: 863-869. 7. Grunenwald H. (2003). Chapter 20 Optimization of Polymerase Chain Reactions. Methods in Molecular Biology, PCR Protocol, Second Edition (Bartlett JMS, Stirling D). Vol. 226 : 89 - 99. Humana Press, USA. 8. Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH, Vogt PH. (1997). Multiplex PCR : Critical Parameters and Step - by - step Protocol. BioTechniques. 23 : 504 - 511. 9. Henegariu O. (1997). PCR and Multiplex PCR guide. Yale University, USA. 10. Menegon A, Board PG, Blackburn AC., et al. (1998). Parkinson's disease, pesticides, and glutathione transferasep polymorphisms. Lancet. 352 (9137): 1344-1346. 11. Newton CR, Graham A. (1997). PCR. Second edition. BIOS Scientific. UK. 12. Nguyễn Ngọc Huyền (2009). Tình hình nhiễm Helicobacter pylori trên bệnh nhân ung thư dạ dày. Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Tuổi Trẻ Các Trường Đại Học Y Dược Việt Nam lần thứ XIII. 13. Ogata SK, Kawakami E, Reis FPS. 2002. Evaluation of invasive methods to diagnosis Helicobacter pylori infection in children and adolescents with dyspepsia invasive methods to diagnosis Helicobacter pylori infection. Medicina, Ribeirao Petro. 35: 24 - 29. 8 14. Tang YL, Gan RL, Dong BH, Jiang RC, Tang RJ. (2005). Detection and locaiton of Helicobacter pylori in human gastric carcinomas. World J Gastrenterol. 11(9): 1387 - 1391. 15. Testerman TL, McGee DJ, and Mobley HLT. (2001). Chapter 34 Adherence and Colonization. Part VI Bacterial Virulence and Pathogenic Mechanisms. Helicobacter pylori : Physiology and Genetics (Harry L.T. Mobley, George L. Mendz, and Stuart L. Hazell). 16. The World Organisation for Animal Health (OIE) Terrestrial Manual 2008. 17. Xiang Z, Censini S, Bayeli PF, et al. (1995). Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect. Immun. 63: 94 - 98. 18. Yamaoka Y, Kodama T, et al. (1999). Relationship between Helicobacter pylori iceA, cagA, and vacA status and clinical outcome: studies in Four different countries. J Clin Microbiol. 37: 2274 - 2279. 19. Zangenberg G., Saiki R. K., Reynolds R. (1999). Chapter 6 Multiplex PCR : Optimization guidelines. PCR applications : protocols for functional genomics (Innis M. A., Sninsky J. J., Gelfand D. H.). Academic Press, USA.