Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang mềm chứa nanocurcumin

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 155 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ VIÊN NANG MỀM CHỨA NANOCURCUMIN Nguyễn Tường Vân*, Vĩnh Định** TÓM TẮT Mục tiêu: 1. Phân lập curcumin II, III từ bột nghệ. 2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời curcumin I, curcumin II, curcumin III. 3. Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật cho Viên nang mềm chứa nanocurcumin. Đối tượng và phương pháp: - Viên nang mềm chứa nanocurcumin liposom đang nghiên cứu công thức và tiêu chuẩn kỹ thuật bao gồm: Curcumin toàn phần 15,0 mg v| c{c t{ dược Sáp ong trắng, Dầu cọ, Lecithin, Dầu đậu nành - Curcumin I, h|m lượng 99,26% (ChromaDex, USA). - Phân lập các curcumin từ nguyên liệu bằng sắc ký cột với hệ dung môi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần. - X{c định c{c đặc tính (màu sắc v| độ tan curcumin II, curcumin III phân lập), độ tinh khiết (SKLM với ba hệ dung môi có độ phân cực kh{c nhau; x{c định nhiệt độ nóng chảy v| độ tinh khiết của chất phân lập bằng phương ph{p quét nhiệt vi sai-DSC; đ{nh gi{ độ tinh khiết sắc ký lỏng theo phần trăm diện tích pic) và cấu trúc chất thu được (phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR) Kết quả: Đã ph}n lập được CX2 (x{c định là curcumin II), CX3 (xác định là curcumin III) có nhiệt độ nóng chảy lần lượt là 169,71 oC và 219,08 oC với độ tinh khiết lần lượt là 99,45% và 98,30% bằng kỹ thuật DSC. Đã x}y dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời các curcuminoid và ứng dụng trên chế phẩm chứa nanocurcumin liposom. Sơ bộ thử độ hòa tan viên nang mềm nanocurcumin liposom. X{c định kích thước hạt của dung dịch thuốc trong viên nang mềm chứa nanocurcumin dạng liposom. Kết luận: Việc phân lập curcumin II, curcumin III bằng SK cột đơn giản v| có thể áp dụng trên quy mô điều chế để thiết lập chất đối chiếu. Quy trình định lượng được xây dựng chủ yếu bằng phương ph{p SKLHNC với đầu dò PDA. C{c điều kiện sắc ký được chọn dựa vào 4 tiêu chí là thành phần dung môi đơn giản, an toàn; cột sắc ký phổ biến; thời gian lưu 2. Việc thẩm định quy trình thực hiện theo hướng dẫn thường quy. Từ khóa: nghệ, curcumin, Demethoxycurcumin, Bisdemethoxycurcumin, nanocurcumin. ABSTRACT DEVELOPMENT OF IN-HOUSE SPECIFICATION OF SOFTGEL CONTAINING NANOCURCUMIN Nguyen Tuong Van, Vinh Dinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018:155 - 161 Objectives: 1. Isolate Demethoxy curcumin, Bisdemethoxy curcumin from curcuma longa powder extract. 2. Validate the simutaneous determination of Curcumin, Demethoxy curcumin, Bisdemethoxy curcumin by RP-HPLC method with PDA detector. 3. Establish in-house specifications for soft capsules containing nanocurcumin liposome. Materials and methods: - Soft capsules CLINOVA which is being studied technical specifications *Khoa Dƣợc, Đại học Nguyễn Tất Thành **Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Vĩnh Định ĐT: 0903639586 Email: npvdinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 156 contain: Curcuminoid 15.0 mg in form of nanoliposome and recipients (White bee wax, palm oil, lecithin, soybean oil). - Curcumin 99.26% (ChromaDex, USA). - Isolate demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin from curcuma longa powder extract by traditional column chromatography, mobile phase is composed of CHCl3-MeOH with incerasing polarity. - Determine characteristics of isolated demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin: color and solubility, purity (Thin layer chromatpgraphy with three mobile phases different in polarity, melting points, DSC and HPLC), structures (IR, MS, 1H-NMR and 13C- NMR). Results: Demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin were successfully isolated. DSC method dermines the purity of demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin based on their melting points. The purities of demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin are respectively 99.45% and 98.30%. The process was validated for simutaneous determination of Curcumin, Demethoxy curcumin and Bisdemethoxy curcumin. Then, this process was applied to analyzed soft capsules containing nanocurcumin liposome. Proceed the dissolution test of soft capsules containing nanocurcumin liposome. Determine averaged size and polydipersity index of nanocurcumin liposome contained in soft capsules. Conclusion: The process of isolation demethoxy curcumin, bisdemethoxy curcumin from curcuma longa powder extract by traditional column chromatography is both efective and simple. Therefore, it could be widely applied to set up reference substances. Quantitative process is carried out by HPLC with PDA detector. Chromatographic conditions are chosen based on 4 criteria (1) mobile phase is constituted of simple and safe organic solvents; (2) column chromatography is widely used; (3) retention time of curcuminoid is not more than 30 minutes and (4) resolution is not less than 2,0. The process was validated following procedures of ASEAN guilines. Keywords: Turmeric, curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin, nanocurcumin. ĐẶT VẤN ĐỀ Curcumin là thành phần chính trong củ nghệ Curcuma longa L. Zingiberaceae. Curcuminoid có nhiều công dụng chữa bệnh nhƣng c{c bằng chứng l}m s|ng trên ngƣời khỏe v| ngƣời bệnh đều cho thấy nanocurcumin có sinh khả dụng đƣờng uống cao hơn curcumin. Các chế phẩm chứa nanocurcumin lƣu h|nh ng|y c|ng nhiều trên thị trƣờng. Hiện nay dƣợc điển Việt Nam chƣa có chuyên luận quy định về chế phẩm chứa nanocurcumin. Do đó, đề t|i đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu “Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang mềm chứa nanocurcumin”. NGUYÊN LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu - Bột nghệ nguyên liệu điều chế nanocurcumin dạng liposom (số lô KH/CL/E006/13, 95% curcuminoid) - Viên nang mềm CLINOVA chứa curcumin toàn phần 15,0 mg v| c{c t{ dƣợc Sáp ong trắng, Dầu cọ, Lecithin, Dầu đậu nành Chất chuẩn Curcumin I, SKS: 00003927, HL: 99,26% (ChromaDex, USA). Hóa chất, dung môi Acetonitril, Methanol, Nƣớc cất 2 lần, Acid acetic băng, Kalidihydro phosphat, Natri hydroxyd, Chloroform, Benzen, Dichloromethan, Ethylacetat (tinh khiết phân tích). Trang thiết bị Máy quang phổ Hồng ngoại Thermo scientific iS50, Máy DSC, Máy NMR AVANCE 500, M{y đo khối phổ 910 TQ- FTMS. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phân lập các curcumin từ bột nghệ nguyên liệu bằng sắc ký cột với hệ dung môi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 157 - X{c định c{c đặc tính (màu sắc v| độ tan curcumin II, curcumin III phân lập), độ tinh khiết (SKLM với ba hệ dung môi có độ phân cực kh{c nhau; x{c định nhiệt độ nóng chảy và độ tinh khiết của chất phân lập bằng phƣơng pháp quét nhiệt vi sai-DSC; đ{nh gi{ độ tinh khiết sắc ký lỏng theo phần trăm diện tích pic) và cấu trúc chất thu đƣợc (phổ hồng ngoại, phổ khối, phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR). - Quy trình định lƣợng dựa trên TLTK(3) và chọn điều kiện phù hợp để thẩm định. KẾT QUẢ Xác định đặc tính cảm quan, độ tinh khiết và cấu trúc chất thu đƣợc Phân lập curcumin II và curcumin III theo quy trình nhƣ sau: Sơ đồ 1: Quy trình phân lập CX2, CX3 từ bột nghệ Sản phẩm phân lập đƣợc là 30 mg CX2 (hiệu suất 2,0%) và 25 mg CX3 (hiệu suất 1,67%). Lặp lại quy trình phân lập 2 lần. Gộp và trộn đều sản phẩm phân lập thu đƣợc tổng cộng 60 mg CX2, 50 mg CX3. Mỗi lần phân lập chỉ tiến hành sắc ký trên cột một lần. Hàm lƣợng curcumin thu đƣợc không giống với tỉ lệ các curcumin trong nguyên liệu vì phần lớn curcumin II bị lẫn với curcumin I. Đặc điểm cảm quan: CX2 là tinh thể dạng bột, m|u đỏ cam, ít tan trong cloroform, tan trong methanol và dimetylsulfoxid. CX3 là tinh thể dạng bột, màu vàng nhạt, ít tan trong cloroform, tan trong methanol và dimetylsulfoxid. Độ tinh khiết SKLM Sắc ký đồ của CX2 và CX3 khi sắc ký với 3 hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Phát hiện bằng mắt thƣờng. CX2 và CX3 cho một vết trên bản mỏng khi khai triển với ba hệ dung môi có độ phân cực khác nhau. Vậy chất phân lập đƣợc đạt độ tinh khiết sắc ký lớp mỏng. Độ tinh khiết xác định bằng kỹ thuật quét nhiệt vi sai (DSC) Curcumin II và Curcumin III tinh khiết có nhiệt độ nóng chảy lần lƣợt là 172 oC và 222 oC. Dựa v|o đó, bằng kỹ thuật DSC x{c định nhiệt độ nóng chảy của CX2 và CX3 lần lƣợt là 169,71 oC và 219,08 oC, với độ tinh khiết lần lƣợt là 99,45% và 98,30%. Hình 1: Phổ DSC của CX2 (trái) và CX3 (phải) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 158 Độ tinh khiết sắc ký lỏng CX2 v| CX3 đạt độ tinh khiết sắc ký lỏng trên 98% tính theo% diện tích pic. Mặt khác, độ tinh khiết săc ký trên đầu dò PDA (λmax = 420 nm) cho thấy không lẫn pic của tạp chất khác. Xác định cấu trúc bằng phƣơng pháp phổ Phổ hồng ngoại Phổ IR của hai chất CX2 và CX3 có các dao động đặc trƣng tƣơng tự nhau vì có các nhóm chức giống nhau của nhóm O-H (3331,0 cm-1), C=O (1625 cm-1), C=C anken (1602 cm-1), C=C aren (1573 cm-1), C-H aren thế para (826 cm1).Riêng CX3 không cho đỉnh hấp thu của liên kết C-H alkan (2943 cm-1). Hình 2: Phổ IR của CX3 Phổ khối Khối lƣợng phân tử của CX2 và CX3 lần lƣợt l| 338,9 đ.v.C v| 308,9 đ.v.C Hình 3: Phổ khối ESI MS+ của CX2 (trái, M = 338,9), của CX3 (phải, M = 308,9) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 159 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bảng 1: Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) của CX2, CX3 so với TLTK (200 MHz, DMSO) Vị trí CX2 (ppm; j Hz) Curcumin II (1) CX3 (ppm; j Hz) Curcumin III (1) OCH3 3,836 (s) 3,82 1 6,048 (s) 6,02 6,047 (s) 5.99 (s) 3 6,682 (d; 16 Hz) 6,67 (d; 15 Hz) 6,682 (d; 16 Hz) 6.67 (d; 15,8 Hz) 3’ 6,749 (d; 16 Hz) 6,67 (d; 15 Hz) 9’; 9’ 6,815 (d; 7,5 Hz) 6.81 (d; 8 Hz) 6,818 5 (d; 8,5 Hz) 6.91 (d; 8,5 Hz) 7 6,828 (d; 1,5 Hz) N/A 7’ 10 7,140 (dd; 8; 2 Hz) 6.91 (d; 8 Hz) 7,558 (d;, 8,5 Hz) 7.57 (d; 8,5 Hz) 10’ 7,315 (dd;, 8; 2 Hz) 7,13 (dd; 8 Hz) 6, 6’ 7,561 (dd; 8; 4 Hz) 7.31 (d, 2 Hz) 4 7,537 (d; 16 Hz) 7.53 5 (d, 15 Hz) 7,539 (d; 16 Hz) 7.61 (d; 15,8 Hz) 4’ 7,545 5(d, 16 Hz) 7.53 5 (d, 15 Hz) 8, 8’ 10,066 Bảng 2: Phổ 13C-NMR (DMSO, 125 MHz) của CX2, CX3 so với TLTK (200 MHz, DMSO) Vị trí CX2 Curcumin II (1) Vị trí CX3 Curcumi n III (1) 55,69 55,7 1 100,85 100,9 1 100,90 100,9 6 111,27 111,2 7; 7’; 9; 9’ 115,93 115,9 9 115,68 115,7 3; 3’ 120,83 121,1 9’; 7 115,90 115,7 / 115,9 5; 5’ 125,86 126,8 3 120,83 120,8 6; 6’; 10; 10’ 130,31 130,0 3’ 121,04 121,1 4; 4’ 140,36 140,1 10,10’ 123,15 123,2 / 123,1 8; 8’ 159,78 159,7 5 125,81 125,8 2; 2’ 183,21 183,2 5’ 126,34 126,4 6’ 130,30 130.4 4 140,34 140,4 4’ 140,67 140,7 7’ 147,99 148.0 8 149,34 149,8 8’ 159,78 159,8 2 183,11* 183,1 2’ 183,25* 183,2 Dữ liệu phổ UV (λmax = 420 nm), IR và NMR chứng tỏ CX2 tƣơng ứng với Curcumin II có công thức phân tử C20H18O5. Phổ 13C- NMR của CX3 cho thấy mất tín hiệu cộng hƣởng ở δ = 55,69 ppm của C Methoxy. Dữ liệu phổ UV, IR và NMR chứng tỏ CX3 tƣơng ứng với curcumin III có công thức phân tử C19H16O4. Cấu tạo của curcumin II v| III nhƣ sau: Demethoxy curcumin Bisdemethoxy curcumi Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời curcumin I, curcumin II, curcumin III Chế phẩm Viên nang mềm CLINOVA chứa hoạt chất là các curcuminoid dạng nanoliposom. Mỗi viên nang mềm có chứa 250 mg nanocurcumin 6% (kl/kl) (tƣơng ứng 15 mg curcuminoid dạng nano) và một số t{ dƣợc: sáp ong trắng, dầu cọ, lecithin, dầu đậu nành. Điều kiện sắc ký lỏng Đầu dò: PDA2998, λ = 420 nm Cột: Luna® 5 µm C18, 100 Ao Pha động: Acid acetic 2% - Acetonitril (55:45) Thể tích tiêm: 10 µL Tốc độ dòng:1 mL/phút Nhiệt độ cột: 25 oC Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 160 Tính tương thích hệ thống Tiêm 6 lần mỗi dung dịch chuẩn curcumin I 20 µg/ml, curcumin II 20 µg/ml, curcumin III 20 µg/ml v|o hệ thống sắc ký lỏng. Ghi nhận các thông số thời gian lƣu (tR), diện tích đỉnh (S), hệ số bất đối (As), hệ số dung lƣợng (k’), số đĩa lý thuyết (N) của 6 lần tiêm để tính kết quả phân tích tính tƣơng thích hệ thống. Tính tƣơng thích hệ thống HPLC khi phân tích ba curcumin đạt yêu cầu để thẩm định quy trình phân tích với các giá trị % RSD, hệ số đối xứng, số đĩa lý thuyết, hệ số dung lƣợng đạt theo tiêu chuẩn chấp nhận. Tính đặc hiệu Tiêm các dung dịch mẫu Trắng, BI (curcumin I 20 µg/ml), BII (curcumin II 20 µg/ml), BIII (curcumin III 20 µg/ml), D (20 µg/ml của mỗi curcumin), mẫu Thử và mẫu Thử thêm chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử, pic curcumin I, curcumin II, curcumin III có thời gian lƣu lần lƣợt khoảng 22,601 phút, 20,97 phút, 18,75 phút, trùng với thời gian lƣu pic của curcumi I, curcumin II, curcumin III trong dung dịch chuẩn. Mẫu trắng không có pic ở vị trí này. Độ chính xác Phân tích 6 dung dịch mẫu thử khác nhau nhƣng có nồng độ giống nhau. Dựa vào kết quả phân tích, ghi nhận các thông số cho mỗi curcumin: thời gian lƣu (tR), diện tích pic (S). H|m lƣợng viên trong 6 lần định lƣợng có kết quả lặp lại, vậy quy trình có tính chính xác. Tính tuyến tính Tiêm các dung dịch chuẩn chung của curcumin I, curcumin II, curcumin III ở 6 mức nồng độ 5, 10, 20, 25, 100, 200 µg/ml. Ghi nhận diện tích pic. Vẽ đƣờng biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic theo nồng độ. Đƣờng tuyến tính của ba curcumin có hệ số tƣơng quan R2 ≥ 0,995. Độ đúng Thêm vào các dung dịch chuẩn curcumin ở 3 mức nồng độ 100%, 120%, 150% lƣợng curcumin trong mẫu thử. Tính độ phục hồi, tỉ lệ phần trăm lƣợng chuẩn phát hiện đƣợc so với lƣợng thực tế cho vào. Độ phục hồi của curcumin I, curcumin II, curcumin III từ 94 – 105%. Quy trình có độ phục hồi tốt. Định tính và định lƣợng Định tính Theo sắc ký đồ mẫu thử, có 3 pic ứng với thời gian lƣu của 3 curcumin trong mẫu chuẩn. Vậy mẫu thử có chứa curcumin I, curcumin II, curcumin III. Định lượng H|m lƣợng curcumin toàn phần là 121,39% so với h|m lƣợng ghi trên nhãn. Độ hòa tan So s{nh độ hoà tan ở 30 phút, 45 phút, 60 phút. Ở thời điểm 30 phút, viên giải phóng trên 70% hoạt chất, tiến h|nh đo độ hòa tan của 6 viên. Tất cả đều giải phóng trên 70% hoạt chất. Kích thƣớc hạt Chế phẩm có kích thƣớc hạt trung bình là 14,54 nm và PDI < 0,2. Yêu cầu chất lƣợng - Hình thức: viên nang mềm màu vàng, bề mặt viên lành lặn, không mùi không vị. - Độ đồng đều khối lƣợng: ± 7,5% khối lƣợng trung bình viên. - Độ hòa tan: ít nhất 70% lƣợng curcumin toàn phần so với lƣợng ghi trên nhãn đƣợc hòa tan trong thời gian không quá 30 phút. - Định tính: sắc ký đồ dung dịch chế phẩm có 3 píc với thời gian lƣu tƣơng ứng thời gian lƣu của curcumin I, II, III chuẩn. - Định lƣợng: h|m lƣợng curcumin toàn phần không thấp hơn lƣợng ghi trên nhãn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 161 BÀN LUẬN Xác định cấu trúc Phổ IR của hai chất CX2 v| CX3 tƣơng tự nhau chứng tỏ chúng có khung cấu trúc và các nhóm chức giống nhau nhƣ: có nh}n thơm thế ở vị trí para (CX2 ở 826,7 cm-1, CX3 ở 830,9 cm-1) có nhóm chức alcol, ceton, có C sp2 của liên kết đôi. Riêng CX3 không cho đỉnh hấp thu của liên kết C-H alkan trong vùng 3000-2800 cm-1 Phổ khối ESI+ của CX2 và CX3 cho các pic cơ bản lần lƣợt là 338,9 và 308,9 gần với số khối của curcumin II và curcumin III. Phổ 1H-NMR của CX2: ba proton methoxy, một proton alken, bốn proton của bốn C lai hoá sp2 cấu hình trans, bảy proton nh}n thơm. Phổ 13C-NMR của CX2 có 18 tín hiệu cộng hƣởng của 20 carbon, một carbon methoxy, một Cβ của nhóm diketon, bốn C lai hoá sp2, hai nhóm carbonyl, các C lai hoá sp2 nằm trong vùng dịch chuyển hoá học của nh}n thơm. Kết quả dữ liệu phổ IR, MS và NMR của CX2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của curcumin II(1). Phổ 1H-NMR của CX3: không có tín hiệu của proton methoxy, một proton alken, bốn proton của bốn C lai hoá sp2 cấu hình trans, bốn proton nh}n thơm, bốn proton nh}n thơm, hai proton nhóm hydroxyl. Phổ 13C-NMR của CX3: có 8 tín hiệu cộng hƣởng của 19 carbon, một Cβ của nhóm Diketon, hai C nhóm carbonyl, các C lai hoá sp2 nằm trong vùng dịch chuyển hoá học của nh}n thơm v| alken có cùng môi trƣờng hoá học (hay có sự đối xứng trong phân tử) nên tín hiệu tăng gấp đôi hay gấp bốn so với tín hiệu của C của nhóm diketon ở δ = 100,90 ppm. Kết quả dữ liệu phổ IR, MS và NMR của CX3 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của curcumin II(1). Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời ba curcumin Quy trình định lƣợng sử dụng chuẩn curcumin I (USP) và curcumin II, curcumin III phân lập đƣợc. Kết quả cho thấy quy trình đạt tính phù hợp hệ thống, đặc hiệu, độ chính xác, tính tuyến tính v| độ đúng. Có thể áp dụng quy trình để định lƣợng đã thẩm định trên chế phẩm chứa curcumin liposom (M. Hasan và cộng sự, 2013). Kích thƣớc hạt nanocurcumin liposom Một sản phẩm tốt phải có kích thƣớc hạt nhỏ kích thƣớc nanomét, đồng đều và bền trong quá trình bào chế. Kết quả đo kích thƣớc hạt trên chế phẩm cho thấy, hạt nanocurcumin có kích thƣớc trung bình là 14,54 nm, PDI < 0,2. KẾT LUẬN Việc phân lập curcumin II, curcumin III bằng SK cột đơn giản, {p dụng đƣợc trên quy mô điều chế để thiết lập chất đối chiếu. Quy trình định lƣợng đƣợc xây dựng chủ yếu bằng phƣơng ph{p SKLHNC với đầu dò PDA. C{c điều kiện sắc ký đƣợc chọn dựa vào 4 tiêu chí là thành phần dung môi đơn giản, an toàn; cột sắc ký phổ biến; thời gian lƣu < 30 phút v| độ phân giải giữa các pic curcumin > 2. Việc thẩm định quy trình thực hiện theo hƣớng dẫn thƣờng quy. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Péret-Almeida L, Cherubino APF (2005), “Separation and determination of the physico-chemical characteristics of curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin”, Food Research International, 38, 1039–1044. 2. Trần Thị Ngần, Nguyễn Ngọc Vinh (2013), Phân lập chất đối chiếu curcuminoid từ nghệ đỏ Rhizoma Curcumae xanthiorrhizae. 3. Yadav VR, Sarasija S (2009), “A Sensitive Reversed Phase HPLC Method for the Determination of Curcumin”, Pharmacognosy margazine, Al-Ameen college of Pharmacy, 5(17), pp.71-74 Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018