Khóa luận Khai thác dữ liệu ESTs (expressed sequence tags) ở chi cam chanh (citrus) cho việc phát triển marker phân tử SSR (simple sequence repeats)

)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR còn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). 2.3.4 Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân (unequal crossing- over during meiosis) . Hình 2.3 Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 13 Quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp. Sự trƣợt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.4 Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 2.3.5 Vai trò của microsatellite Rất nhiều microsatellite đã đƣợc tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng nhƣ vậy vẫn còn chƣa rõ ràng, mặc dù ngƣời ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite đƣợc dùng nhƣ một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hóa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên có rất nhiều chứng cứ 14 cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa. Microsatellite đƣợc tìm thấy khắp nơi ở phần trƣớc vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã đƣợc tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá. Số lƣợng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trƣờng hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này đƣợc giải phóng thì gen đƣợc khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động nhƣ một yếu tố điều hòa trong quá trình sao mã, ảnh hƣởng đến quá trình sao mã thông qua ảnh hƣởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hƣởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó. Nhƣ một trình tự mang mã, microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite có thể dẫn đến sự khác nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đó có thể ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có sự ảnh hƣởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hóa thích nghi (Kashi và ctv.,1990,1997). Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nó hoạt 15 động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hóa (King và ctv., 1997, 1998). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hóa 2.4 Phƣơng pháp phân lập microsatellite truyền thống Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dòng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống loài trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đó phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nó có hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dòng dƣơng tính có thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành công, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đoán trƣớc và primers đƣợc thu nhận ngẩu nhiên có thể không biểu hiện tính đa hình có ý nghĩa.Vị trí microsatellite đƣợc trải xuyên suốt genome và có thể đƣợc thu nhận từ sự thoái hoá DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đó là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thông qua PCR. Primer microsatellite đặc trƣng cho một loài sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi alleles) đối với từng cá thể trong loài. Điều này có thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn trong quá trình di truyền của loài. Vùng flanking rất quan trọng vì nó giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. Một qui trình phân lập 1 SSR mất khoảng 3 tuần trong đó giai đọan thiết kế mồi và kiểm tra mòi vừa thiết kế cho SSR mất khỏang hơn 2 tuần. Đồng thời phải tốn một chi phí khá lớn để mua các hóa chất và máy móc cần thiết để tiến hành thí nghiệm ( cần khoảng 200 USD tiền hóa chất để xác định đƣợc 1SSR) nhƣng rủi ro thu đƣợc SSR là khá lớn 16 Hình 2.5: Phƣơng pháp phân lập microsatellite truyền thống 2.5 Phƣơng pháp phân lập microsatellite sử dụng SSR đƣợc phân lập theo phƣơng pháp truyền thống từ thƣ viện cDNA hay thƣ viện Genomic rất tốn kém, do phải sàng lọc từ các mẫu dò một cách mò mẫm. 17 Trong khi đó, phƣơng pháp mới dùng để phân lập SSR từ nguồn dữ liệu ESTs có chi phí thấp và tƣơng đối dễ thực hiện, do trình tự ESTs luôn sẵn có. Hiện nay, có rất nhiều phần mềm để phân lập SSR từ ESTs, ví dụ nhƣ: 1.MIcroSAtellite (MISA) [] 2.Sputnik [ /sputnik/index.html] 3.CUGIssr [] 4.SSRSEARCH [ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/software/scripts/ssr.pl] 5.SSRFinder [ SSRFINDER/ssrfinder_1_0.tar.gz] Công cụ đƣợc tìm kiếm trình tự SSR đƣợc tham khảo và tải về từ địa chỉ của tác giả Steven Schroeder viết với mục đích là: tìm kiếm, tách các trình tự SSR và những vùng kế bên trong một trình tự chính để phục vụ cho những nghiên cứu về sau. So sánh hiệu quả của 2 phƣơng pháp phân lập Phƣơng pháp truyền thống Phƣơng pháp sử dụng Chỉ xác định đƣợc 1 hoặc vài SSR trong 1 lần thí nghiệm Tiền hóa chất, nhân công và thiết bị khá nhiều Thời gian để tiến hành 1 qui trình phân lập , thiết kế mồi cho1 SSR khá lâu (khoảng 3 tuần) Không xác định đƣợc chính xác các SSRs có thể có trong gene Độ chính xác không cao do có thể bị nhiễm trong quá trình làm Có thể xác định đƣợc nhiều SSR 1 lúc Chi phí cho quá trình phân lập khá thấp vì không phải tốn tiền hóa chất và máy móc thiết bị nhiều Thời gian tiến hành phân lập và thiết kế mồi nhanh (1 phút) Xác định chính xác các SSRs có thể có trong 1 gen Độ chính xác cao do cơ sở dữ liệu đã đƣợc phân tích và công bố rộng rãi 18 2.6 Ứng dụng Thiết kế bản đồ gen trong di truyền Đa dạng hóa vật liệu di truyền Nghiên cứu quần thể Chẩn đoán và xác định các bệnh ở ngƣời Sử dụng cho việc bảo tồn hệ sinh vật trong thiên nhiên 2.7 Cơ sở dữ liệu sinh học Dữ liệu sinh học đang đƣợc thu nhận với tốc độ rất nhanh. Đến tháng 8 năm 2000, ngân hàng dữ liệu GENEBANK đã có 8.214.000 mục liên quan đến các trình tự sinh học DNA và cơ sở dữ liệu SWISS-PROT có 88.166 mục liên quan đến các trình tự protein. Trung bình những sơ sở dữ liệu đang tăng gấp đôi kích thƣớc sau mỗi chu kỳ 15 tháng. Ngoài ra sự ra đời của vô số dự án nghiên cứu gen, xác định cấu trúc protein đƣợc mã hóa trong bộ gen... đã tạo ra một lƣợng lớn thông tin sinh học và thông tin này ngày càng đa dạng và phong phú. Do dữ liệu sinh học tăng trƣởng mạnh mẽ nên công cụ tin học đã trở thành một phƣơng tiện không thể thiếu trong phân tích xử lý dữ liệu sinh học. Công nghệ thông tin có thể quản lý nguồn dữ liệu khổng lồ, phân tích các dữ liệu đa dạng và luôn biến đổi trong thế giới tự nhiên. Ngành Sinh Tin học đƣợc xem là lĩnh vực nghiên cứu liên ngành nhằm kết hợp các kỹ thuật xử lý, tính toán và tổ chức thông tin bằng thiết bị tin học với các kỹ thuật, công cụ phổ biến trong ngành sinh học phân tử. Sinh tin học hiện đang là ngành nghiên cứu khoa học khá mới tại Việt Nam , ra đời với mục tiêu xây dựng các công cụ để tính toán , mô phỏng và đƣa ra những chƣơng trình máy tính phục vụ nghiên cứu sinh học . Có thể tiến hành phân lập SSR từ bất cứ đọan gen mong muốn nào trên NCBI và các cơ sở dữ liệu sinh học lớn khác Nếu không có cơ sở dữ liệu EST thì không thể tiến hành phân lập SSR 19 Một số cơ sở dữ liệu lớn, trực tuyến đã đƣợc xây dựng để cung cấp thông tin cho các nhà nghiên cứu sinh học nhƣ NCBI, EBI, SIB, DDBJ,… 2.7.1 NCBI 2.7.1.1 Vài nét về NCBI Hình 2.6 Tƣơng quan giữa NCBI (National Library of Medicine và NIH) NCBI là chữ viết tắt của “Center for Bioinformatic Information”. Đây là trung tâm quốc gia về Công nghệ sinh học, thuộc viện sức khỏe quốc gia của Hoa kỳ (NIH – National Insitute of Health). NCBI chính thức đƣợc thành lập vào ngày 4/10/1988. Đến năm 1991, NCBI đảm nhiệm việc quản lý cơ sở dữ liệu trình tự DNA và từ đó NCBI còn đƣợc gọi là GenBank. NCBI là nơi cung cấp, trao đổi thông tin về sinh học phân tử của Mỹ, thông qua những cơ sở dữ liệu trực tuyến. Ngoài ra, NCBI còn tham gia những nghiên cứu về “sinh học tính toán” (computation biology), phát triển những công cụ phân tích dữ liệu bộ gene, protein,… 3.1.1.2 Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI Nucleotide (GenBank): là cơ sở dữ liệu về trình tự nucleotide. Protein: là cơ sở dữ liệu về trình tự amino acid. Genome: trình tự toàn bộ genome của một số sinh vật. Structure: hay còn có tên gọi là MMDB (Molecular Modeling Database) chứa cấu trúc ba chiều của những đại phân tử bao gồm cả protein lẫn những chuỗi nucleotide.. DDBJ của Nhật Bản, EMBL của Châu Âu, NCBI của Hoa Kỳ là ba cơ sở dữ liệu về trình tự nucleotide lớn, mang tính toàn cầu và ba cơ sở dữ liệu này có hợp tác, trao đổi qua lại dữ liệu lẫn nhau. Từ đó, càng làm cho cơ sở dữ liệu về các trình tự nucleotide ngày càng trở nên phong phú NLM NCBI NIH 20 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Các chƣơng trình và ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng 3.1.1 Hệ điều hành Microsoft Windows XP Server Pack 2. Xây dựng CSDL trình tự SSRs của chi cam chanh (Citrus) trên hệ điều hành này. 3.1.2 Các chƣơng trình phân tích trình tự 3.1.2.1 Chƣơng trình Perl ssrfinder_1_0 Đây là một chƣơng trình của tác giả Steven Schroeder thuộc trƣờng Đại học Missouri – Michigan. Chƣơng trình gồm 6 Perl scripts có chức năng xác định SSR và thiết kế primer thích hợp cho mỗi SSR tìm đƣợc - 1_ssr_repeat_finder.pl: tìm SSR, lấy ra trình tự SSR và vùng flanking cho những phân tích sau. - 2_ssr_primer_designer.pl: thiết kế primer mà mục tiêu là khuếch đại vùng trình tự chứa SSR. - 3_ssr_primer_rep_check.pl: sàng lọc lại các primer đã thiết kế để loại bỏ những primer có chứa trình tự lặp lại - 4_ssr_primer_blast.pl: so sánh các primer đã thiết kế với cơ sở dữ liệu primer - 5_ssr_order_filter.pl: tạo 1 file chỉ chứa SSR mà có primer duy nhất - 6_ssr_primer_formatter.pl: tạo 1 file chỉ chứa SSR có primer duy nhất – file này đƣợc tạo đơn giản chỉ chứa những thông tin cần thiết cho việc chọn lựa primer. 21 Yêu cầu: vì chƣơng trình này đƣợc viết cho hệ điều hành Unix hay Linux nên cần phải thực hiện sửa đổi một số lệnh lập trình cơ bản để có thể chạy trên môi trƣờng Window. Chƣơng trình cần sự kết hợp với 3 phần mềm khác là Primer3, blastall và formatdb để thực thi. Ba phần mềm này có thể tải hoàn toàn miễn phí (có phiên bản dành cho Window) từ trang Primer3 và trang Blast của NCBI Các thông số của chƣơng trình thiết kế primer đều đƣợc mặc định nhƣ sau TARGET= m, n với m là vị trí bắt đầu có microsatllite và n là chiều dài microsatellite (mục tiêu) PRIMER_PRODUCT_SIZE_RANGE=80-160 80-240 80-300 (kích thƣớc sản phẩm) PRIMER_OPT_SIZE=24 (kích thƣớc tối ƣu của primer) PRIMER_MIN_SIZE=20 (kích thƣớc tối thiểu của primer) PRIMER_MAX_SIZE=28 (kích thƣớc tối đa của primer) PRIMER_OPT_TM=63 (nhiệt độ nóng chảy tối ƣu của primer) PRIMER_MIN_TM=60 (nhiệt độ nóng chảy tối thiểu của primer) PRIMER_MAX_TM=65 (nhiệt độ nóng chảy tối đa của primer) PRIMER_MAX_DIFF_TM=1 (độ chênh lệch nhiệt độ nóng chảy tối đa) Với các thông số mặc định trên chƣơng trình hoàn toàn có thể sử dụng cho mục tiêu của đề tài. Hiện nay, có rất nhiều phần mềm để phân lập SSR từ ESTs, ví dụ nhƣ: 1.MIcroSAtellite (MISA) [], 2.Sputnik [ /sputnik/index.html], 3.CUGIssr [] 4.SSRSEARCH [ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/software/scripts/ssr.pl] 22 5.SSRFinder [ SSRFINDER/ssrfinder_1_0.tar.gz] Các công cụ này hầu nhƣ dựa trên cùng một thuật toán tìm SSR, tuy nhiên mỗi phần mềm đƣợc viết bằng các ngôn ngữ lập trình khác nhau. Một điểm nổi bật của công cụ SSRFinder (đƣợc viết bằng Perl, có tích hợp Primer3 và ncbi-BLAST) là có tích hợp thêm những Perlscript giúp hỗ trợ việc thiết kế primer cũng nhƣ kiểm tra lại primer, tuy nhiên các Perlscript này đƣợc lập trình dƣới hệ điều hành UNIX nên cần đƣợc chỉnh sữa để có thể sử dụng trên hệ điều hành Windows. Ngoài ra, còn có rất nhiều trang web hỗ trợ việc tìm SSR trên trình tự nhƣ: 1.SSR Server [] 2. SSR Primer Discovery [ binpub/ssrprimer/indexssr.pl] 3. SSRIT [] 3.1.2.2 Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST BLAST là một chƣơng trình tìm kiếm và so sánh trình tự tƣơng đồng đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay. Thuật giải của BLAST xuất phát từ ý tƣởng “liệu trong ngân hàng dữ liệu (bao gồm cả CSDL cục bộ và những CSDL lớn trên thế giới nhƣ GenBank, EMBL,…) có trình tự nào giống hoặc gần giống với trình tự đang quan tâm”. BLAST thực hiện so sánh trình tự nhập vào (có thể DNA hay protein) với những trình tự trong CSDL. Kết quả của BLAST là những số liệu thống kê chính xác về tỉ lệ tƣơng đồng và nguồn gốc các trình tự. Chiến lƣợc tìm kiếm trình tự tƣơng đồng trong BLAST đƣợc thực hiện qua ba bƣớc chính: Đầu tiên BLAST tìm kiếm những đoạn tƣơng đồng HSPs (High Scoring Pair) giữa một trình tự đƣa vào và mỗi trình tự trong CSDL. Công việc tiếp theo là thực hiện đánh giá ý nghĩa thống kê dựa trên bất cứ sự tƣơng đồng nào đƣợc tìm thấy. Sau cùng BLAST đƣa ra một báo cáo kết quả giống nhau thỏa mãn ngƣỡng giá trị mà ngƣời dùng mong muốn. 23 Stand-alone BLAST sử dụng trong khóa luận này có thể tải về từ địa chỉ của trang CSDL NCBI: blast-2.2.14-ia32-win32.exe (ftp://ftp.ncbi.nih.gov.blast/executables/). 3.1.2.3 Hệ quả trị CSDL quan hệ Microsoft ACEESS Microsoft Access là một phần mềm ứng dụng thuộc bộ phần mềm Microsoft Office, đƣợc sử dụng để quản lý dữ liệu (quản lý nhân sự, khách hàng, vật tƣ, kế toán…).Phần mềm này đƣợc bảo vệ và phân phân phối bởi hãng Microsoft Phiên bản Access tùy thuộc vào phiên bản của bộ phần mềm Microsoft Office Để sử dụng phần mềm này chúng ta phải mua bản quyền của Microsoft Mỗi tập tin ACCESS gọi là một cơ sở dữ liệu. Một cơ sở dữ liệu chứa đựng nhiều dữ liệu nằm trong một thành phần chính của một tập tin ACCESS gọi là bảng (TABLE). Các bảng này có mối quan hệ với nhau theo một quy luật nào đó do ngƣời thiết kế tạo nên. 3.1.2.4 Egassembler Là 1 công cụ trực tuyến cung cấp những công cụ sinh học tự động mà ngƣời dùng có thề sử dụng để phân tích làm sạch trình tự, dấu những vùng lập lại, dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors, dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan, sắp gióng cột và assembly các đọan ESTs và đọan genomic. Hệ thống máy chủ chấp nhận nhiều dạng trình tự DNA ở dạng FASTA nhƣ EST, , cDNA, gDNA, GSS Hệ thống gồm 5 công cụ chính:  Làm sạch trình tự  Dấu những vùng lặp lại  Dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors  Dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan  Assembling: sắp gióng cột vá chồng các trình tự lại với nhau tạo thành các Contigs và Singletons 24 Egassembler web có 3 tùy chọn chính, mỗi tùy chọn dành cho những ngƣời dùng khác nhau One-Click Assembly : cho ngƣời dùng mới bắt đầu với sinh tin học, các bƣớc sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt theo mặc định đã cài sẵn, ngƣời dùng có thể lựa chọn thƣ viện dữ liệu để dấu những vùng lặp lại, dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors, dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan.Các quá trình xử lý đƣợc thực hiện lần lƣợt. Step-by-Step Assembly: Ngƣời dùng có thể sử dụng mọi công cụ trong web, và có thể chạy từng mục một với các tùy chọn nâng cao. Kết quả đầu ra ở bƣớc trƣớc sẽ đƣợc sử dụng làm dữ liệu đầu vào cho bƣớc tiếp theo một cách tự động. Ngƣời dùng có thể đi đến bất kỳ bƣớc nào vào bất cứ thời điểm nào với kết quả đã đƣợc lƣu lại từ trƣớc Stand-Alone Processing : Tùy chọn này giống với Step-by-Step Assembly chỉ khác ở chỗ ngƣời dùng không thể sử dụng kết quả đầu ra ở bƣớc trƣớc để làm dữ liệu đầu vào cho các quá trình sử lý khác 3.1.3 Apache web Server . Apache web Server là một trình chủ web đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay trên Internet. Apache có đƣợc một vị trí đáng nể nhƣ thế là nhờ vào việc nó là một chƣơng trình mã nguồn mở và hoàn toàn miễn phí. Hai ƣu điểm này đã giúp Apache đƣợc yêu thích đối với những công việc vừa và lớn của nhiều công ty trên thế giới. Một trong những điểm mạnh của Apache là khả năng nâng cấp trình chủ web thông qua các module. Khi một yêu cầu từ trình tự khách đƣợc gởi đến Apache phải trải qua một loạt nhiều giai đoạn sử lý để cuối cùng trả về kết quả cho ngƣời dùng. Apache có thể đƣợc tải về từ địa chỉ : ( 25 3.4 CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH 1 Thu nhập trình tự 2 Lọai các dữ liệu nhiễu và dƣ 3. Aseembling 4 Tìm SSR 4.1Blastn 4 Tìm SSR 5 Thiết kế và kiểm tra Primer 6. tBLASTx trên cơ sở dữ liệu UniGene 7. 7.Đƣa vào Sơ đồ qui trình phân lập và xác định 8 Tích hợp chức năng SSR của cây cam quýt CSDL dbEST và CoreNucleotide của NCBI ESTs - Citrus ESTs Citrus không thừa, không nhiễu Contigs Singletons ESTs, SSR Citrus CSDL EST-SSr Primer Citrus Cơ sở dữ liệu quan hệ WebSite Cơ sở dữ liệu EST-SSR- Primer Citrus liên quan đến gene kháng bệnh EST-SSR none primer citrus 26 Bƣớc 1. Thu thập trình tự ESTs Citrus từ CSDL dbEST Quá trình thu nhận trình tự nucleotide đƣợc tóm tắt thành sơ đồ sau Bảng 3.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận trình tự chính từ NCBI Từ khóa sử dụng cho tung lòai là Bảng 3.2 : Từ khóa sử dụng để thu nhận trình tự trên NCBI Citrus aurantium "txid43166"[Organism] AND gbdiv_EST[PROP] Citrus clementina "txid85681"[Organism]ANDgbdiv_EST[PROP] Citrus jambhiri "txid64884"[Organism]ANDgbdiv_EST[PROP] Citrus macrophylla (colo) "txid307630"[Organism]ANDgbdiv_EST[PROP] Citrus reticulata x Citrus temple “xid322160"[Organism]ANDgbdiv_EST[PROP] Truy cập trang web NCBI Nhập từ khóa Chọn lọc theo giống Chọn cơ sở dữ liệu EST Chọn dạng FASTA Thu nhận tất cả trình tự nucleotide theo từng giống Chọn dạng Summary Thu nhận các thông tin liên quan 27 Citrus reticulata "txid85571"[Organism] AND gbdiv_EST[PROP] Citrus sinensis “xid2711"[Organism] AND gbdiv_EST[PROP] Citrus unshiu “xid55188"[Organism] AND gbdiv_EST[PROP] Citrus x paradisi ( “xid37656"[Organism] AND gbdiv_EST[PROP] Citrus sinensis x Poncirus trifoliata “xid105581"[Organism]AND gbdiv_EST[PROP] Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata “"txid309804"[Organism]ANDgbdiv_EST[PROP] Hình 3.1 : Danh sách các trình tự EST Citrus trên NCBI (www.NCBI.nlm.nih.gov/genomes/plant/plantlist.html#est) 28 Định dạng FASTA: là định dạng theo quy định của NCBI, FASTA là một giải thuật bắt cặp trình tự đƣợc David J. Lipman và William R. Pearson miêu tả lần đầu tiên vào năm 1985 (Rapid and sensitive protein similarity searches), nó có một hàng chú thích bắt đầu bằng ký tự “>” ở cột đầu tiên. Ví dụ một định dạng FASTA: >gi|146351219|gb|EG026743.1|EG026743 KN0AAA2CF05ZM1 AbsAOv1 (Citrus) clementina cDNA 5', mRNA sequence GGCTCAAGTACTTATTTTTTAATATAGTGCACTCGAAGCTAGCAAATATC TTTTCTGACTTGAAGAATATGAAAACTCTTCCTGGCGCAGGTATGAGCG ATCCGTCAGAAGGTTACTTACTCCCCCCTTCCAGTATTGCTGATGATGAT GTTGGGAATGACAATCTTGATCTTATCGTTATTCCTCAATATGGGAGAA ATCCTGATTATTATGGGTAAGTGTCTGCAATCTGGATGATGATATATATA Trong đó: gi là mã số do NCBI quy định. gb là mã số của cơ sở dữ liệu gen (Genbank) của từng loài. Chúng tôi thu nhận đƣợc tổng cộng 189385 trình tự ESTs, thuộc 11 lòai khác nhau. 29 Bƣớc 2.Loại các dữ liệu nhiễu và dƣ bằng công cụ EGassembler bao gồm các bƣớc sau: Hình 3.2 : Các bƣớc thực hiện của EGassembler 30 2.1 Làm sạch trình tự: loại các đuôi PolyA/PolyT, những vùng trình tự phức tạp thấp, những vùng trình tự kém chất lƣợng (N), những trình tự ESTs < 100N. 2.2 Dấu những vùng lặp lại: nhƣ LINEs (long interspersed elements), SINEs (short interspersed elements), LTR (Long Tandem Repeat), DNA transposon, RNA pseudogenes dựa trên CSDL RepBase, TIGR và TREP. 2.3 Dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors: dựa trên CSDL NCBI-UniVec hay EMBL-emvec. 2.4 Dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan: nhƣ Plastids, Plasmids, ti thể và Nucleomorph dựa trên CSDL của NCBI-organelle. Bƣớc 3. Assembling: bằng EGassembler với hai hoặc nhiều trình tự chồng lên nhau có độ tƣơng đồng tối thiểu là 80% và chiều dài của đoạn chồng lên nhau tồi thiểu là 40N. Các trình tự có độ tƣơng đồng cao đƣợc gom lại thành một gọi là Contigs.Các đọan trình tự không có đọan tƣơng đồng với các trình tự khác đƣợc gọi là Singleton. Hình 3.3 phân biệt giữa Contig và Singleton Bƣớc 4.Tìm SSR: bằng SSRFinder v1.0 của Steven Schroeder Thu nhận trình tự SSR Các bƣớc thực hiện: Trình tự nucleotide thu nhận từ NCBI về đƣợc lƣu thành tập tin với tên là “sequence20030101.txt”. 31 Thực thi đoạn mã Perl “SSRRepeatFinder.pl”, khi đó chƣơng trình sẽ tạo ra 3 tập tin khác với tên lần lƣợt là “ssrout20030101.txt”, “labdbout20030101.txt”, “new_ids20030101.txt”. Hình 3.4 nội dung tập tin “ssrout20030101.txt” Trong tập tin này nó sẽ gồm các nội dung theo thứ tự là: Mã của đoạn SSR (SSR Version) (EG026717.1a) dựa vào mã số genbank (EG026717.1) để tạo ra mã quy định cho mỗi đoạn SSR, khi một trình tự có 2 hay nhiều đoạn SSR thì nó sẽ quy định là “a”, “b”, “c”,… (EG026717.1a và EG026717.1b) Trình tự đoạn SSR: TATATATATATA Đoạn SSR (Motif): TA Đoạn SSR trong trình tự chính đƣợc rút gọn, nó đƣợc phân biệt trong dấu “[]” TTGTTACAGTAGCAATTTTGACTCACTCTTAAGTCTTTGCTGTTGTATTG ATATCAACTGTTATTGACGACTTTTAATAGTGCATTTCCATGATTTTGTC TATTAACTTGTCAATAAAAGTAAAGAATTCCTGTATTGCAAAATTACTTT [TATATATATATA]GAGGGGTTATGCGGTCTGGGATCCCAGACTGTAATT AAAGTCCAGGAT Hình 3.5 nội dung tập tin “labdbout20030101.txt” EG026717.1 EG026717.1a TATATATATATA TA 369,12 TTGTTACAGTAGCAATTTTGACTCACTCTTAAGTCTTTGCTGTTGTATTGATAT CAACTGTTATTGACGACTTTTAATAGTGCATTTCCATGATTTTGTCTATTAACTTGTCAA TAAAAGTAAAGAATTCCTGTATTGCAAAATTACTTT[TATATATATATA]GAGGGGTTA TGCGGTCTGGGATCCCAGACTGTAATTAAAGTCCAGGATTGGGACCATGTGTAGCAGA TTAATAAATAAATAAATAAATCCAACGGCCTCAGTCCGGATACTAGTTTGGAT EG026717.1a TATATATATATA TA TTGTTACAGTAGCAATTTTGACTCACTCTTAAGTCTTTGCTGTTGTATTGATATCAACTG TTATTGACGACTTTTAATAGTGCATTTCCATGATTTTGTCTATTAACTTGTCAATAAAAGTAAAGA ATTCCTGTATTGCAAAATTACTTT[TATATATATATA]GAGGGGTTATGCGGTCTGGGATCCCAGA CTGTAATTAAAGTCCAGGATTGGGACCATGTGTAGCAGATTAATAAATAAATAAATAAATCCAACG GCCTCAGTCCGGATACTAGTTTGGAT 32 Nội dung tập tin này gần giống với tập tin “ssrout20030101.txt”, nó chỉ bổ sung thêm phần mã genbank (EG026717.1) và vị trí bắt đầu (369) và chiều dài đoạn SSR (12). Hình 3.6 Nội dung tập tin “new_ids20030101.txt” Tập tin “new_ids06062007.txt” bổ sung thêm phần định nghĩa Nguyên tắc thu nhận trình tự Thu nhận các trình tự SSR bằng cách đếm các trình tự nu lập lại trong gene theo nguyên tắc: dimer 6 repeats, trimer 4 repeats, tetramer 4 repeats. Phải chắc rằng các SSR thu nhận phải có nhiều trình tự hơn giới hạn đã đặt ra ở trên và không thu nhận những trình tự có 1 trình tự lập lại nhiều lần nhƣ AAAAAAAAAAAAAAA, TTTTTTTTTTTTTTT Bƣớc 4.1 BLASTn: Dùng Perl script thực hiện việc tìm kiếm những trình tự EST-SSR không thể thiết kế primer do vùng flanking quá ngắn trên các contigs bảo tồn, với mục đích kéo dài các EST-SSR. Chúng tôi đã thiết kế Perl script “Blast on Contig” để thực hiện qui trình này vì trong phần mềm SSRFinder khong hỗ trợ chức năng này Các trình tự EST-SSR không thể thiết kế primer do vùng flanking quá ngắn đƣớc lƣu vào tập tin none_primer20030101.txt. Chúng tôi thiết kế perl script “blast on contigs” để thực hiện quá trình tBlastx trên các contigs bảo tồn nhằm kéo dài các EST-SSR không thiết kế đƣợc primer. Thực thi đoạn mã Perl “Blast on contigs.pl”, khi đó chƣơng trình sẽ tạo ra 3 tập tin khác với tên lần lƣợt là “blastout120030101.txt”, “fullblastout120030101.txt” và “contigs20030101.txt”. Các Ests mới thu nhận đƣợc sẽ đƣợc lƣu trong thƣ mục contigs20030101.txt EG026743.1 EG026743 KN0AAA2CF05ZM1 AbsAOv1 Citrus clementina cDNA 5', mRNA sequence EG026742.1 EG026742 KN0AAA2CD10ZM1 AbsAOv1 Citrus clementina cDNA 5', mRNA sequence 33 Bƣớc 5.Thiết kế và kiểm tra primer: Thiết kế primer: trong vùng bảo tồn hai bên vùng SSR vừa tìm đƣợc ở trên bằng phần mềm Primer3 với nhiệt độ bắt cặp trong khoảng từ 63 đến 650C và sự chênh lệch giữa primer xuôi và primer ngƣợc không quá 10C, sản phẩm PCR có độ dài trong khoảng từ 80-300bp. Kiểm tra primer: bằng SSRFinder. Trƣớc tiên, kiểm tra các base lặp lại trong primer, nếu có 1 loại base lặp lại lớn hơn 3 lần thì loại bỏ primer đó. Sau đó, tiếp tục kiểm tra tính bắt cặp đặc hiệu của các primer đó bằng công cụ BLAST, nếu có ít hay nhiều hơn một primer xuôi và một primer ngƣợc bắt cặp lên một trình tự EST thì loại cặp primer đó. Bƣớc 6 tBLASTx: trên CSDL gen kháng virus tristeza của Poncitrus Trifoliata: nhằm mục đích xác định các EST-SSR có liên quan đến khả năng kháng bệnh dựa trên tìm kiếm tƣơng đồng ở các loài lân cận: chức năng của gene chứa các SSR và vai trò của các SSR trong chức năng của gene ở thực vật chƣa đƣợc biết rõ và ghi nhận nhiều. Một ví dụ khá hiếm và điển hình về loại chức năng này là ở gene waxy, khi đầu 5‟-UTR của gene này có số lần lặp lại của GA/CT thay đổi sẽ ảnh hƣởng đến hàm lƣợng amylose chứa trong gạo (Ayers et al., 1997). Ngoài ra, còn một số ví dụ khác về các gene có chứa SSR liên quan đến bệnh di truyền thần kinh ở ngƣời. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đặc biệt quan tâm đến SSR trong các gene kháng ở thực vật, vì những thay đổi về số lần lặp lại của SSR có ảnh hƣởng rất lớn về khả năng kháng lại tác nhân gây bệnh ở thực vật Cơ sở dữ liệu gene kháng virus tristeza đƣợc lấy từ cỏ sở dữ liệu NCBI với từ khóa là ”tristeza virus resistance gene” Bƣớc 7. Đƣa tất cả các dữ liệu này vào CSDL quan hệ Microsoft ACCESS để dễ dàng truy xuất thông tin. Tạo bảng chứa dữ liệu Theo các mô tả trong mô hình đối tƣợng, ta chuyển từ mô hình đối tƣợng sang mô hình quan hệ nhƣ sau: 34 Mỗi đối tƣợng trong mô hình đối tƣợng là một quan hệ trong mô hình quan hệ. Mỗi thuộc tính trong mô hình đối tƣợng là thuộc tính trên quan hệ tƣơng ứng. Khóa của đối tƣợng là khóa của quan hệ tƣơng ứng. Tạo các quan hệ 1: Bảng tblStrain Bảng 3.3 Nội dung tblStrain Tên trƣờng Kiểu dữ liệu Chú thích StrainID Text Mã số quy định giống. StrainName Text Tên của giống. Bảng tblMotifLengthGroup:chứa nội dung quy định mã các đoạn SSR Bảng 3. 4 Nội dung tblMotifLengthGroup Tên trƣờng Kiểu dữ liệu Chú thích MotifLengthGroupID Text Mã số quy định chiều dài đoạn SSR MotifLengthGroup Text Chiều dài đoạn SSR. MotifDescription Text Chú thích. Bảng tblSSR: chứa thông tin về đoạn Microsatellite Bảng 3.5 Nội dung tblSSR Tên trƣờng Kiểu dữ liệu Chú thích SSRID Text Mã số của đoạn SSR. GenbankACC Text Chứa số truy cập trên NCBI. 35 StrainID Text Mã số quy định giống. SSRVersion Text Phiên bản của đoạn SSR dựa vào. MotifLengthGroupID Text Mã số quy định chiều dài đoạn SSR Motif Text Đoạn SSR. SSRSequence Text Trình tự đoạn SSR SSRStart Number Vị trí bắt đầu. Length Number Chiều dài đọan SSR ShortSequence Text Đoạn trình tự ngắn dựa vào đoạn trình tự chính để ngƣời xem có thể dễ nhận ra vị trí đoạn SSR. Xây dựng mối quan hệ (khóa chính và khóa ngoại)  tblStrain Khóa chính: StrainID  tblMotifLengthGroup Khóa chính: MotifLengthGroupID  tblSSR Khóa chính: SSRID Khóa ngoại: StrainID, MotifLengthGroupID Nhập dữ liệu vào bảng Do các quan hệ ràng buộc giữa khóa chính và khóa ngoại nên việc nhập cơ sở dữ liệu vào các bảng phải đƣợc thực hiện một cách tuần tự, nếu không sẽ phát sinh lỗi và không thể nhập đƣợc. Nhập dữ liệu vào các bảng chỉ có khóa chính (không có khóa ngoại) để nó có thể quản lý các thông tin một cách chính xác và không trùng lắp. Bƣớc 8. Tích hợp CSDL vừa xây dựng vào web thông qua Apache Server để chia sẽ thông tin qua mạng. 36 Nhằm tạo giao diện thân mật, dễ sử dụng cho ngƣời dùng cuối, trang web đã đƣợc tạo ra để đƣa cơ sở dữ liệu đến ngƣời dùng. Sau đó dựa vào cơ sở dữ liệu Microsatelite, ngƣời dùng có thể phục vụ cho việc nghiên cứu riêng của mình. Việc thiết kế trang web CSDL microsatellites của chi cam chanh (Citrus) đƣợc tham khảo với trang web mẫu về phƣơng pháp micorsatellite khác đã phổ biến trên intermet trƣớc đó. Hình 3.7 Trang web mẫu về trình tự microsatellite(Nguồn: Các bƣớc thực hiện thiết kế Website Xác định những nội dung cần thực hiện: ngoài phần chính là cơ sở dữ liệu Microsatelite, còn có những phần thông tin thêm vào để ngƣời sử dụng có thể hiểu rõ hơn về Chi cam chanh (Citrus) và phƣơng pháp Microsatelite. Thiết kế mối liên kết tố các cơ sở dữ liệu sinh học lớn khác nhƣ NCBI, Egassembler, DDBJ .... Thiết kế giao diện để ngƣời dùng có thể sử dụng một cách dễ dàng nhất. Tích hợp cơ sở dữ liệu vào trang web. 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thu thập trình tự ESTs Citrus từ CSDL dbEST của NCBI Bảng 4.1 số lƣợng ESTs của từng loài thu nhận đƣợc từ NCBI Citrus aurantium (Seville orange) 5060 ESTs Citrus clementina 62250 ESTs Citrus jambhiri (jambhiri orange) 989 ESTs Citrus macrophylla (colo) 1076 ESTs Citrus reticulata x Citrus temple 1823 ESTs Citrus reticulata (tangerine) 3640 ESTs Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 94738 ESTs Citrus unshiu (Satsuma orange) 4489 ESTs Citrus x paradisi (grapefruit) 8039 ESTs Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 1052 ESTs Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 7954 ESTs Hình 4.1: Sơ đồ so sánh lƣợng ESTs của từng loài 38 Chúng tôi thu nhận đƣợc 11 lòai khác nhau thuôc chi cam chanh, trong đó Citrus Clementina và Citrus Sinensis có số trình tự ESTs đƣợc giải mã và công bố nhiều nhất, Citrus jambhiri có lƣợng ESTs ít nhất. 4.2 Loại các dữ liệu nhiễu và dƣ bằng công cụ EGassembler 4.2.1 Làm sạch trình tự Bảng 4.2 Số trình tự bị lọai bỏ ở bƣớc 2.1 Citrus aurantium (Seville orange) by 'short': 2 by 'shortq': 8 Citrus clementina by 'dust': 1 by 'shortq': 18 Citrus jambhiri (jambhiri orange) 0 Citrus macrophylla (colo) by 'short': 22 by 'shortq': 4 Citrus reticulata x Citrus temple 0 Citrus reticulata (tangerine) by 'dust': 1 by 'shortq': 18 Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) by 'dust': 10 by 'short': 71 by 'shortq': 330 by 'low_qual': 78 Citrus unshiu (Satsuma orange) by 'dust': 1 by 'short': 5 by 'shortq': 28 by 'low_qual': 5 Citrus x paradisi (grapefruit) by 'dust': 1 by 'short': 18 by 'shortq': 13 by 'low_qual': 25 Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) by 'shortq': 14 by 'low_qual': 1 Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata by 'short': 20 by 'shortq': 4 Chú thích: By „dust‟: những vùng trình tự phức tạp thấp by 'shortq': loại các đuôi PolyA/PolyT by 'short': những trình tự ESTs < 100N. by 'low_qual': những vùng trình tự kém chất lƣợng (N) 39 4.2.2 Dấu những vùng trình tự nhiễu của vector và adaptors Bảng 4.3 số trình tự bị lọai bỏ ở bƣớc 2.3 Citrus aurantium (Seville orange) 0 Citrus clementina 37 Citrus jambhiri (jambhiri orange) 1 Citrus macrophylla (colo) 0 Citrus reticulata x Citrus temple 0 Citrus reticulata (tangerine) 0 Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 72 Citrus unshiu (Satsuma orange) 11 Citrus x paradisi (grapefruit) 10 Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 6 Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 1 4.2.3 Dấu những vùng trình tự nhiễu của các bào quan Bảng 4.4 số trình tự bị lọai bỏ ở bƣớc 2.4 Citrus aurantium (Seville orange) 1 Citrus clementina 50 Citrus jambhiri (jambhiri orange) 5 Citrus macrophylla (colo) 0 Citrus reticulata x Citrus temple 1 Citrus reticulata (tangerine) 7 Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 679 Citrus unshiu (Satsuma orange) 15 Citrus x paradisi (grapefruit) 128 Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 3 Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 0 40 Hình 4.2: Bảng so sánh dữ liệu ESTs trƣớc và sau khi lọai nhiễu Sau quá trình lọai nhiễu chúng tôi đã bớt đi một lƣợng khá lớn ESTs không đủ tiêu chuẩn (1725 ESTs). Điều này giúp việc tìm kiếm SSRs và thiết kế Primers tiến hành dễ dàng và chính xác hơn. 41 4.3 Assembling Bảng 4.5 số lƣợng Contigs thu đƣợc ở mỗi lòai sau khi assembling Citrus aurantium (Seville orange) 875 Contigs Citrus clementina 7667 Contigs Citrus jambhiri (jambhiri orange) 75 Contigs Citrus macrophylla (colo) 77 Contigs Citrus reticulata x Citrus temple 257 Contigs Citrus reticulata (tangerine) 750 Contigs Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 10804 Contigs Citrus unshiu (Satsuma orange) 479 Contigs Citrus x paradisi (grapefruit) 1176 Contigs Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 125 Contigs Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 1993 Contigs Hình 4.3: Bảng so sánh lƣợng Contigs và ESTs 42 Từ cơ sở dữ liệu ESTs ban đầu chúng tôi xác định đƣợc một số lƣợng lớn các Contigs có độ tƣơng đồng cao so với các trình tự EST này, từ đó chúng tôi tiến hành phân lập và thiết kế primer cho các contigs nhằm xác định thêm các trình tự SSR có thể có trong các contigs đó 4.4 Tìm SSR: bằng SSRFinder v1.0 của Steven Schroeder Bảng 4.6 Tổng số lƣợng SSRs thu nhận đƣợc Citrus aurantium (Seville orange) 511 SSRs Citrus clementina 10937 SSRs Citrus jambhiri (jambhiri orange) 81 SSRs Citrus macrophylla (colo) 72 SSRs Citrus reticulata x Citrus temple 116 SSRs Citrus reticulata (tangerine) 432 SSRs Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 10145 SSRs Citrus unshiu (Satsuma orange) 225 SSRs Citrus x paradisi (grapefruit) 2685 SSRs Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 109 SSRs Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 2928 SSRs 43 Hình 4.4: Biểu đồ so sánh lƣợng SSRs phân lập và lƣợng ESTs ban đầu Khả năng phân lập SSR từ EST khá cao. 28241 SSR đã đƣợc phân lập từ cơ sở dữ liệu EST ban đầu. 4.4.1 BLASTn: Bảng 4.7 Lƣợng trình tự ESTs và số primer mới đƣợc tạo thành None Primers ESTs mới Primer tạo thành Citrus aurantium 191 41 20 Citrus clementina 4876 3510 456 Citrus jambhiri 25 0 0 Citrus macrophylla 2 0 0 Citrus reticulata x Citrus temple 45 9 3 Citrus reticulata 297 50 14 Citrus sinensis 5004 3532 489 Citrus unshiu 70 30 8 Citrus x paradisi 752 199 35 Citrus sinensis x Poncirus trifoliata 59 13 2 Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 419 251 44 44 Hình 4.5: Biểu đồ so sánh lƣợng noneprimers và ESTs, Primers mới 45 Chúng tôi phân lập thêm đƣợc một lƣợng lớn các trình tự EST từ các trình tự EST không thể thiết kế mồi ban đầu từ đó phân lập và thiết kế thêm đƣợc 1071 primer SSR mới. 4.5.Thiết kế và kiểm tra primer Thiết kế primer Bảng 4.8 Tổng số primer thiết kế đƣợc Citrus aurantium (Seville orange) 413 Primers Citrus clementina 9608 Primers Citrus jambhiri (jambhiri orange) 69 Primers Citrus macrophylla (colo) 70 Primers Citrus reticulata x Citrus temple 97 Primers Citrus reticulata (tangerine) 352 Primers Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 8463 Primers Citrus unshiu (Satsuma orange) 171 Primers Citrus x paradisi (grapefruit) 1420 Primers Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 94 Primers Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 834 Primers Kiểm tra primer Bảng 4.9 Tổng số Primer còn lại sau khi kiểm tra Citrus aurantium (Seville orange) 391 Primers Citrus clementina 9181 Primers Citrus jambhiri (jambhiri orange) 67 Primers Citrus macrophylla (colo) 70 Primers Citrus reticulata x Citrus temple 94 Primers Citrus reticulata (tangerine) 348 Primers Citrus sinensis (apfelsine/navel orange) 8242 Primers Citrus unshiu (Satsuma orange) 168 Primers Citrus x paradisi (grapefruit) 1396 Primers Citrus sinensis x Poncirus trifoliata (Carrizo citrange) 86 Primers Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata 783 Primers Sau khi thiết kế và kiểm tra primer chúng tôi đã xác định đƣợc 19,755 cặp mồi đạt yêu cầu đặt ra.So với tỉ lệ các SSR ban đầu thì tỉ lệ các trình tự có thể thiết kế mồi khá là cao 46 Hình 4.6: Bảng so sánh lƣợng Primers trƣớc và sau khi kiểm tra 47 Hình 4.7: Bảng so sánh tổng trình tự SSRs và Primers thiết kế đƣợc 48 Chúng tôi xác định đƣợc 1 lƣợng lớn các cặp mồi đủ điều kiện đã đặt ra. Đa số các SSR tìm đƣợc đều có thể thiết kế mồi. 4.6 tBLASTx Chúng tôi xác định đƣợc 33 EST-SSRs tƣơng đồng gene kháng virus Tristeza bằng công cụ BLAST với ngƣỡng e-value = 10-10. Bảng 4.10 Các trình tự tƣơng đồng với gene kháng virus tristeza Mã số Lòai SSR Motif CX052406.1a CN182797.1a Citrus sinensis Citrus sinensis ACACACACACAC AC DN799259.1a CV718404.1a Contig1678a CX290096.1a Citrus reticulata x Citrus sinensis Citrus sinensis Citrus clementina AGAGAGAGAGAG AG DR908292.1a DN620117.1a Citrus sinensis Citrus sinensis AGAAGAAGAAGA AGA CX053145.1a Citrus sinensis AGCAGCAGCAGC AGC V715355.1a Citrus sinensis ATAATAATAATA ATA DY302690.1a DY293832.1a DY284674.1 DY269563.1a Contig1685a Citrus clementina ACCACCACCACC ACC DY304067.1a DY301664.1a DY294592.1a DY267783.1a DY265810.1a DY263066.1a Citrus clementina ATCATCATCATCATC ATC CX078270.1a Citrus sinensis TATATATATATA TA CX052405.1a Citrus sinensis TGTGTGTGTGTG TG CX070771.1a CN182794.1a Citrus sinensis TCATCATCATCA TCA CV719546.1a Citrus sinensis TGGTGGTGGTGG TGG DY276141.1b Citrus clementina TCGTCGTCGTCG TCG CV719898.1a DN958924.1a Citrus sinensis Citrus x paradisi CCTCCTCCTCCT CCT CV714983.1 Citrus sinensis CCACCACCACCA CCA BQ624932.1a Citrus sinensis CGACGACGACGA CGA DY279874.1 Citrus clementina CGACGACGACGA CGA 49 CX296075.1a Citrus sinensis x Poncirus trifoliata TCTCTCTCTCTCTCTC TCTC Các ESTs-SSRs tƣơng đồng gene kháng virus Tristeza chủ yếu đƣợc phát hiện ở hai loài Citrus Clementina và Citrus Sinensis do lƣợng trình tự EST-SSRs khá lớn (hình 4.1). Ở những lòai khác do số lƣợng các ESTs đƣợc giải mã không nhiều nên chƣa tìm đƣợc các ESTs-SSRs tƣơng đồng gene kháng virus Tristeza. 4.7. Đƣa tất cả các dữ liệu này vào CSDL quan hệ Microsoft ACCESS để dễ dàng truy xuất thông tin. Hình 4.8 : Mối quan hệ giữa các bảng 4.8 Tích hợp CSDL vừa xây dựng vào web 4.8.1 Trang chủ (HOME PAGE) Hình 4.9: Tổng quan về Website 50 Nội dung trang web: Gồm các lựa chọn để liên kết đến các trang web chứa thông tin và cơ sở dữ liệu khác. 4.8.2 Trang cơ sở dữ liệu SSRs (SSRs PAGE) Nội dung của trang web: Chứa cơ sở dữ liệu trình tự microsatellite của chi cam chanh (citrus) gồm có: Thể hiện tất cả cơ sở dữ liệu SSRs (All): các loại SSRs sẽ đƣợc thể hiện, không đƣợc phân loại. Hình thức thể hiện: Hình 4.10 Trang cơ sở dữ liệu SSRs (All) Tìm kiếm các trình tự cần thiết: Tìm kiếm theo “StrainId” và “MotifLengthGroup”: Khi ngƣời dùng quan tâm đến từng nhóm microsatellite. Bảng 4.11: Các nhóm Strain id có trong cơ sở dữ liệu StrainID Name ST01 Citrus clementina ST02 Citrus sinensis ST03 Citrus jambhiri ST04 Citrus aurantium ST05 Citrus macrophylla ST06 Citrus reticulata 51 ST07 Citrus sinensis x Poncirus trifoliata ST08 Citrus unshiu ST09 Citrus x paradisi ST10 Citrus reticulata x Citrus temple ST11 Citrus x paradisi x Pondcirus trifoliata Bảng 4.12 Các nhóm Motif trong cơ sở dữ liệu Motif Length Group ID Motif Length Group Description 2 Dimer Dinucleotide SSR 3 Trimer Trinucleotide SSR 4 Tetramer Tetranucleotide SSR 5 Pentamer Pentanucleotide SSR 6 Hexamer Hexanucleotide SSR 7 Heptamer Heptanucleotide SSR 8 Octamer Octanucleotide SSR 9 Nonamer Nonanucleotide SSR 10 Decamer Decanucleotide SSR 72 Dodecamer Dodecamer SSR Hình thức thể hiện: Hình 4.11 Trang cơ sở dữ liệu SSRs chọn lọc theo Strain Id “ST01” và “Motif Length Group ID” là 3 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đề tài gồm 7 bƣớc đƣợc thực hiện lần lƣợt nhằm mục đích xác định 1 cách chính xác các SSRs và thiết kế mồi cho SSR đó Chúng tôi đã tải đƣợc 191,110 trình tự ESTs của chi Citrus bao gồm 11 loài khác nhau, tiến hành loại nhiễu bằng Egassembler lọai bỏ đƣợc 1725 trình tự ESTs không phù hợp yêu cầu. Tiến hành Assembly Các trình tự ESTs vừa thu nhận đƣợc bằng Egassembler chúng tôi thu nhận đƣợc 24278 Contigs. Blast các trình tự ESTs không thể thiết kế mồi trên các Contigs phân lập đƣợc thêm 7635 ESTs mới 28241 trình tự SSRs đƣợc phân lập nhờ Perl script từ cơ sở dữ liệu ESTs ban đầu Kiểm tra thiết kế mồi cho các SSRs mới tìm đƣợc, chúng tôi xác định đƣợc 19,755 cặp mồi Tiến hành Blast trên cơ sở dữ liệu gen kháng virus tristeza xác định đƣợc 33 ESTs-SSRs có các motif tƣơng đồng với motif của gen kháng virus Tích hợp tất cả các cơ sở dữ liệu thu nhận đƣợc vào website SSRs Database of Citrus Trang Web cơ sở dữ liệu gồm có 7 trang chính, đó là HOME, Citrus, ABOUT SSRs, SSRs, TOOLS, ABOUT US, Other Links. Ngoài ra, từ những trang web chính này còn có thể kết nối đến những trang phụ khác để cung cấp những tiện ích cho ngƣời dùng. Từ các trang web này, ngƣời sử dụng có thể truy xuất thông tin. 53 Về cơ bản chúng tôi đã tìm, thu nhập và phân lập hầu hết các ESTs-SSRs của chi cam chanh đã đƣợc công bố trên NCBI 5.2. Đề nghị Nên cập nhật cơ sở dữ liệu theo định kỳ vì lƣợng trình tự đƣợc giải mã và công bố ngày càng nhiều để đảm bào tính cấp bách và phong phú của Website Mở rộng cơ sở dữ liệu sang các chi, các lòai khác nhằm phục vụ cho nhu cầu nghiên cứu và tìm hiểu Cần thiết lập thêm các bẫy lỗi đƣợc trình bày ở bƣớc 7 để đảm bảo hơn việc hạn chế trùng lắp dữ liệu không cần thiết khi nhập. Xây dựng nhiều trang web chứa các thông tin tìm kiếm và công cụ (assembly, thiết kế primer, enzyme cắt giới hạn, xây dựng mô hình cấu trúc,…) phục vụ cho việc khai thác thông tin và các ứng dụng khác. Tiến hành thiết kế mồi chung phục vụ cho phản ứng PCR phân biệt các loài trong họ và giữa các họ thông qua các trang web thiết kế primer trực tuyến trên Internet nhƣ GeneFisher, Primer3,… hay xây dựng trang web chứa công cụ phục vụ cho thiết kế primer nhƣ GPRIME, Primer3,…kết hợp với ngôn ngữ lập trình Perl. 54 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Trần Nguyễn Minh Đăng, 2005. XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU SSRS (SIMPLE SEQUENCE REPEATS) TỪ ESTS (EXPRESSED SEQUENCE TAGS) CỦA CÂY DỨA (Ananas comosus). Khóa luận tốt ngiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Minh Đạo, 2002. MS-Access 2000. Trƣờng đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật, khoa Công Nghệ Thông Tin. 3. Nguyễn Thị Lang – Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử. Giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản nông nghiệp TP. HCM. 4. Bùi Huy Quỳnh, 2002. Front Page 2000. Trƣờng đại học Sƣ Phạm Kỹ Thuật, khoa Công Nghệ Thông Tin. 5. Nguyễn Trƣờng Sinh – Lê Minh Hoàng – Hoàng Đức Hải, 2003. Thực hành JavaScript (cho web). Nhà xuất bản Thống Kê. 6. Nguyễn Văn Thái, 2005. Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene Hsp-70 và Reverse Transcripte-Rnaseh ở một số loài virus thực vật. Khóa luận tốt ngiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh. 7. Nguyễn Kỳ Trung – Lê Thành Trung, 2005. Thu thập và tổ chức dữ liệu gene phục vụ nghiên cứu cây trồng biến đổi di truyền. Khóa luận tốt ngiệp Ngành Công nghệ sinh học, Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 8.Acquadro A., Lee D., Donini P., Portis E., Comino C., Saba E., Lanteri S., 2003. Microsatellite Amplified Library (MAL): an alternative approach for STMS isolation. Bologna – Italy. 9.Ali Masoudi-Nejad, Ruy Jauregui, Shuichi Kawashima, Susumu Goto, Minoru Kanehisa, Takashi R. Endo, 1999.The kingdom of Plantae EST Indices: a resource for plant genomics community 10.Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. 55 11.Andrew J. Robinson , Christopher G. Love , Jacqueline Batley ,Gary Barker and David Edwards, 2004. Simple sequence repeat marker loci discovery using SSR primer. 12.Andrew Salywon, Matthew Barber, Nathan Herling, and William Stewart. 2005. Data mining for microsatellites in expressed sequence tags (ESTs) from arabidopsis thaliana and brassica species (brassicaceae). 13.A Story Book Future for Lesquerella? Agricultural Research Magazine. (1999) November. Benson, G, 1999. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences. Nucleic Acids Res. 27, 573–580. 14.Castelo, A.T. et al., 2002. Troll – Tandem Repeat Occurrence Locator. Bioinformatics 18, 634–636. Huang, X. and Madan, A., 1999. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Research, 6: 829–845. 15.Edward F. Gilman, 1999. Ananas comosus. University of Florida. Jorge A. Da Silva , Nora Solis-Gracia, 2003.Tagging resistance genes with sugarcane est- derived microsatellites. 16.Huang, X. and Madan, A., 1999. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome Research, 6: 829–845. 17.Kantety, R.V., M.L. Rota, D.E. Mathews, and M.E. Sorrells, 2002. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat. Plant. Mol. Biol. Rep. 48:501-510. 18.K.D. Scott, Microsatellites Derived from ESTs and their Comparison with those Derived by Other Methods. Centre for Plant Conservation Genetics, Southern Cross University, Lismore, Australia. 19.Morgante M., Hanafey M., and Powell W, 2002. Microsatellites are preferentially associated with non repetitive DNA in plant genomes. Nature Genetics . 30:194-200. 20.Morgante, M. and Olivieri, A.M., 1993. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J. 3, 175–182. 21.Morgante, M. et al., 2002 Microsatellites are preferentially present with non- repetitive DNA in plant genomes. Nat. Genet. 30, 194–200. 22.P. K. Gupta, H. S. Balyan, P. C. Sharma and B. Ramesh, 2000.Microsatellites in plants: A new class of molecular markers. 56 23.Rozen, S., Skaletsky, H. "Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers." In S. Krawetz and S. Misener, eds. Bioinformatics Methods and Protocols in the series Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, 2000, pages 365-386. Code available at 24.Ramesh V. Kantety, Mauricio La Rota, David E. Matthews and Mark E. Sorrells, 2002. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat. Kluwer Academic Publishers. 25.Win Hide, Rob Miller, Andrey Ptitsyn, Janet Kelso, Chellapa Gopallakrishnan and Alan Christoffels, 1999. EST Clustering Tutorial. TÀI LIỆU TỪ CÁC TRANG WEB: 26. 27. < 28. 29. 30.< 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 57 Phụ Lục Trang thông tin về Citrus (Citrus PAGE) Nội dung của trang web: Giới thiệu một cách tổng quát về chi cam chanh citrus . Tổng quan về Citrus Trang thông tin về microsatellite (ABOUT SSRs PAGE) Nội dung của trang web: Giới thiệu chung về phƣơng pháp microsatellite Trang Microsatellites Trang tích hợp công cụ để tìm kiếm SSR 58 Dùng để tìm trình tự microsatellite trong cơ sở dữ liệu của website, kết quả sẽ hiển thị kết quả đoạn SSR tìm đƣợc Trang web tìm kiếm trình tự microsatellite bằng mã số truy cập Trang web tìm kiếm trình tự microsatellite bằng Motif 59 Trang công cụ Trang tích hợp công cụ để tìm kiếm SSR Dùng để tìm trình tự microsatellite từ một trình tự bất kỳ hay upload file ở định dạng FASTA, kết quả sẽ hiển thị kết quả đoạn SSR tìm đƣợc. Trang web tìm kiếm trình tự microsatellite Tuy nhiên, Website đang dần đƣợc hoàn thiện để có thể chính thức đƣa vào sử dụng trực tuyến.