Biểu hiện tích tụ quá mức Protein P53 trong Carcinôm tuyến đại trực tràng

143 BIỂU HIỆN TÍCH TỤ QUÁ MỨC PROTEIN P53 TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Thành Nam** TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 trong carcinôm tuyến đại trực tràng bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch (HMMD). Phương pháp: Mô tả cắt ngang. Đối tượng nghiên cứu gồm 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng được chẩn đoán và nhuộm HMMD với p53 tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Tp. HCM từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009. Kết quả: Có 49 bệnh nhân nam (chiếm 46,2%) và 57 bệnh nhân nữ (chiếm 53,8%). Giới nữ mắc bệnh nhiều hơn giới nam khoảng 16% (tỷ lệ nam/nữ = 1/1,16). Tuổi mắc bệnh trung bình 58,08, bệnh nhân sau 40 tuổi chiếm 91,5%. Vị trí u: U ở đại tràng phải có 31 trường hợp (29,5%), u ở đại tràng trái có 74 trường hợp (70,5%). Dạng đại thể: Dạng loét thường gặp nhất chiếm 47,2%; thứ hai là dạng chồi sùi chiếm 40,6%; các dạng vòng siết, xâm nhiễm và dạng phối hợp ít gặp hơn, với tỷ lệ lần lượt là 4,7%, 5,7% và 1,9%. Loại mô học: Carcinôm tuyến không chế nhầy chiếm 86,8%, carcinôm tuyến chế nhầy chiếm 13,2%. Tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 bằng HMMD là 50%. Liên quan không có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện tích tụ protein p53 trong UTĐTT với giới (p = 0,33), tuổi (p = 0,29), vị trí u (p = 0,56), dạng đại thể (p = 0,26). Liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện tích tụ protein p53 với loại mô học (p=0,022). Kết luận: p53 biểu hiện quá mức ở 50% carcinôm tuyến đại trực tràng và liên có ý nghĩa thống kê với lọai mô học. Từ khóa: carcinôm tuyến đại trực tràng, protein p53 ABSTRACT OVEREXPRESSION OF PROTEIN P53 IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Thanh Nam * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - No 3 – 2010: 143 - 147 Objective: To determine the rate of protein p53 overexpression in colorectal adenocarcinoma by using immunohistological technique. Methods: A cross- sectional study included 106 cases of colorectal adenocarcinoma. The specimens were examined by H&E and stained immunohistochemiscal stain with antibody anti p53 at Pathological department – Medicine and Pharmacy University at HCMC from October/2008 to April 2009. Results: In our study, female occurred slighly more than male (female/male : 57/49); mean age was 58.08, the majority was over 40yo (91.5%). Left colon cancer was predominant (74 cases, 70.5%). On macroscopic examination, ulcerative adenocarcinoma was the most common finding (47.2%), then, 40.6% exophytic, 4.7% annular, 5.7% infiltrative, and 1.9%mixture. Histological findings included 86.8% non-mucinous , and 13.2% mucinous adenocarcinoma. Protein p53 overexpressed in half of cases. In multiple variate analysis, no correlation was found between the overexpression of protein p53 with age, gender, tumor sites and macroscopic findings. Correlation between overexpression of protein p53 and histological types was statistic significant (p = 0.022). Conclusion: Overexpression of protein p53 in colorectal adenocarcinoma occupied 50% and correlated significantly with histological types. Keywords: colorectal adenocarcinoma, overexpression protein p53. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một bệnh lý phức tạp về mặt di truyền học. Có nhiều đột biến gen xảy ra trong quá trình hình thành và phát triển UTĐTT. Ngày nay với những tiến bộ vượt bậc của công nghệ phân tử đã giải đáp khá rõ ràng cơ chế sinh ung thư. Feason và Vogelstein đã mô tả chuỗi * Bộ môn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh * Trung Tâm Pháp Y Tỉnh Kiên Giang Địa chỉ liên hệ: PGS. TS. Hứa Thị Ngọc Hà, ĐT: 0908152705 Email: 144 đột biến gen trong UTĐTT bắt đầu với sự đột biến gen APC ở nhánh dài NST số 5 gây ra biến đổi từ biểu mô bình thường thành biểu mô tăng sản. Một trong những tế bào tăng sản sẽ phát triển thành u tuyến nhỏ có bộ gen được methyl hóa mức thấp. Đột biến kế tiếp liên quan đến sự tăng hoạt gen sinh ung K-ras ở nhánh ngắn NST số 12 tạo nên u tuyến trung gian. Tiếp theo, gen DCC ở nhánh dài NST số 18 bị bất hoạt dẫn tới sự phát triển u tuyến muộn với nghịch sản. Đột biến gen cuối cùng được tìm thấy trong UTĐTT là đột biến gen đè nén u p53 ở nhánh ngắn NST số 17(6). Gen p53 là gen đè nén u hay bị đột biến nhất trong ung thư ở người. Gen p53 bình thường hoạt động bằng cách làm tạm dừng chu kỳ tế bào để tiến hành việc sửa chữa các sai lệch trong quá trình nhân đôi DNA, hoặc làm cho tế bào tự chết theo chương trình. Vì thế gen này được xem là “người bảo vệ” của bộ gen. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có khoảng 75% UTĐTT thể ngẫu nhiên có biểu hiện bất hoạt gen p53. Sự xác định đột biến gen p53 trong UTĐTT có ý nghĩa tiên lượng. Bệnh nhân có biểu hiện đột biến gen p53 có tiên lượng xấu, thời gian sống thêm ngắn hơn những bệnh nhân không có biểu hiện đột biến gen p53(6). Trong nước mới có một công trình nghiên cứu ở phía Bắc về biểu hiện của các kháng nguyên p53 trong UTĐTT bằng hóa mô miễn dịch (HMMD)(17). Ở phía Nam cũng có một công trình nghiên cứu biểu hiện p53 trong ung thư vú bằng HMMD(13) và một công trình nghiên cứu đột biến gen p53 trên ung thư miệng bằng phương pháp PCR(14), chưa có công trình nào nghiên cứu về p53 trên UTĐTT. Vì thế chúng tôi thực hiện đề tài này với mục tiêu là xác định tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 trong carcinôm tuyến đại trực tràng bằng phương pháp nhuộm HMMD nhằm làm phong phú thêm các nghiên cứu sâu về ung thư đại – trực tràng. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Dối tượng nghiên cứu 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng được chẩn đoán và điều trị tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y dược Tp. HCM từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009. Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang. Các bước tiến hành Ghi nhận các đặc điểm lâm sàng từ phiếu trả lời kết quả giải phẫu bệnh, gồm: Tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể (dạng loét, chồi sùi, vòng siết, xâm nhiễm và dạng phối hợp). Đọc lại tiêu bản dưới kính hiển vi quang học, khảo sát các đặc điểm giải phẫu bệnh theo các tiêu chí: + Loại mô học: Carcinôm tuyến loại không chế nhầy, carcinôm tuyến loại chế nhầy (gồm carcinôm nhầy và carcinôm tế bào nhẫn) theo tiêu chuẩn phân loại của WHO, 2000. + Độ mô học: Gồm biệt hóa rõ, vừa, kém và không biệt hóa (theo phân độ của WHO, 2000). Sau đó tiến hành nhuộm HMMD trên các block paraffin để khảo sát đặc điểm tích tụ quá mức protein p53. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch được thực hiện Sửa soạn tiêu bản - Cắt mỏng mẫu mô 3 - 5µm, đặt vào lam sạch có tráng silan; - Ủ tiêu bản ở nhiệt độ 56oC trong 1-2 giờ trước khi nhuộm; - Khử nến trong xylen và sau đó cho qua cồn tuyệt đối. - Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H2O2 0,5% trong methanol trong 10 phút; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước đang chảy, sau đó ngâm vào dung dịch TBS (Tris buffer solution). Kháng thể được sử dụng Bộc lộ kháng nguyên trong lò vi sóng, sử dụng kháng thể kháng p53, clone DO-7 của nhà sản xuất DakoCytomation, với độ pha loãng 1/25. Kỹ thuật phức hợp Avidin-biotin với kháng thể đơn dòng - Cho tiêu bản vào TBS, sau đó rửa sạch lượng TBS dư; - Ủ với kháng thể đơn dòng đã pha loãng trong 30-40 phút, rồi rửa tiêu bản bằng TBS; - Ủ với kháng thể thứ hai có gắn biotin trong 30 phút, rửa tiêu bản bằng TBS; - Ủ với phức hợp Avidin-biotin 20 phút, rửa tiêu bản bằng TBS; - Ủ với dung dịch DAB trong 5-10 phút; - Rửa tiêu bản dưới vòi nước đang chảy, nhuộm màu tương phản với hematoxylin, khử nước và dán lamen bằng canada balsam. 145 Đánh giá sự biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 Dựa vào tỉ lệ % nhân tế bào bắt màu(18): Âm tính: < 5% bắt màu; Dương tính: > 5% bắt màu 1(+): bắt màu yếu. 2(+): bắt màu trung bình 3(+): > bắt màu mạnh Xử lý số liệu Số liệu trong các bảng thu thập được tổng hợp, phân tích và xử lý bằng phần mềm SPSS 17.0 với phép kiểm chi bình phương. Tiêu chuẩn chọn mẫu Tất cả các trường hợp ung thư đại trực tràng được chẩn đoán giải phẫu bệnh là carcinôm tuyến. Tiêu chuẩn loại trừ Các trường hợp thiếu thông tin trên phiếu trả lời kết quả giải phẫu bệnh hoặc thất lạc block. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong 106 trường hợp được khảo sát, có 49 nam và 57 nữ, tỷ lệ nam/nữ = 1:1,16. Độ tuổi thường gặp từ 40 đến 79 tuổi. Thấp nhất là 20 tuổi, cao nhất là 80 tuổi, trung bình 58,08 (± 13,6). Bệnh nhân có độ tuổi sau 40 chiếm 91,5%. U ở đại tràng phải (gồm manh tràng, đại tràng lên, đại tràng góc gan và đại tràng ngang) có 31 trường hợp, chiếm 29,5%. U ở đại tràng trái (gồm đại tràng góc lách, đại tràng xuống, đại tràng sigma và trực tràng) có 74 trường hợp, chiếm 70,5%. Có 1 trường hợp không xác định vị trí u. Về đại thể, dạng loét thường gặp nhất chiếm 47,2%, kế đến là dạng chồi sùi chiếm 40,6%. Các dạng vòng siết, xâm nhiễm và dạng phối hợp ít gặp hơn, với tỷ lệ lần lượt là 4,7%, 5,7% và 1,9%. Loại mô học là carcinôm tuyến không chế nhầy có 92 trường hợp, chiếm 86,8%. Loại chế nhầy (gồm carcinôm nhầy và carcinôm tế bào nhẫn) có 14 trường hợp, chiếm 13,2%. Biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 Biểu đồ 1. Sự biểu hiện tích tụ quá mức protein p53. Tỷ lệ p53 dương tính là 50%. Trong đó dương tính 3(+) chiếm tỷ lệ cao nhất với 26 trường hợp (chiếm 24,5%), kế đó là 2(+) với 14 trường hợp (chiếm 13,2%), sau cùng là 1(+) với 13 trường hợp (chiếm 12,3%). Liên quan giữa biểu hiện p53 với giới, tuổi, vị trí u, hình ảnh đại thể và loại mô học Đặc ñiểm p53 (+) p53 (-) P Nam 22 (44,89%) 27 (55,11%) Giới Nữ 31 (54,38%) 26 (45,62%) 0,33 </= 40 6 (66,7%) 3 (33,3%) Tuổi > 40 47 (48,5%) 50 (51,5%) 0,29 Đại tràng phải 14 (45,16%) 17 (54,84%) Vị trí Đại tràng trái 38 (51,35%) 36 (48,65%) 0,56 Loét 28 (56%) 22 (44%) Chồi sùi 21 (49%) 22 (51%) Vòng siết 2 (40%) 3 (60%) Xâm nhiễm 2 (33,3%) 4 (66,7%) Dạng ñại thể Phối hợp 0 (0%) 2 (100%) 0,26 Không chế nhầy 50 (54,3%) 42 (45,7%) Loại mô học Chế nhầy 3 (21,4%) 11 (78,6%) 0,022 Bảng trên cho thấy biểu hiện tích tụ protein p53 không khác biệt theo giới, tuổi, vị trí u và dạng đại thể. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện tích tụ protein p53 và loại mô học. Carcinôm tuyến chế nhầy có tỷ lệ p53 dương tính rất thấp (21,4%) so với nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy. BÀN LUẬN Nghiên cứu này cho thấy tỷ lệ p53 dương tính là 50%. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây, tỷ lệ p53 dương tính bằng phương pháp nhuộm HMMD trong khoảng từ 30 đến 76%(4,5,8,12,13,15,17) . Theo kết quả của nghiên cứu này, bệnh nhân nữ có tỷ lệ p53 dương tính cao hơn bệnh nhân nam (54,38% so với 44,89%). Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,33). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước(3,9,11,18). Nghiên cứu này cũng cho thấy, nhóm bệnh nhân dưới hay bằng 40 tuổi có tỷ lệ p53(+) cao hơn nhóm bệnh nhân trên 40 tuổi (66,7% so với 48,5%), tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,29). Kết quả này cũng tương tự với nhiều báo cáo khác Tỷ lệ % 24.5% 13.2% 12.3% 50% 0 20 40 60 Âm tính 1(+) 2(+) 3(+) 146 rằng không có liên quan giữa biểu hiện p53 với tuổi(3,11,18). So sánh sự biểu hiện tích tụ protein p53 với vị trí u, nghiên cứu này cho thấy p53 dương tính ở đại tràng trái nhiều hơn đại tràng phải (51,35% so với 45,16%) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,56). Một số nghiên cứu trước đây cũng cho rằng không có liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện p53 và vị trí u(9,11). Nhưng một số tác giả khác báo cáo rằng ung thư ở đại tràng trái biểu hiện tích tụ protein p53 nhiều hơn đại tràng phải(4,16). Như vậy biểu hiện tích tụ protein p53 ở ung thư đại tràng trái có khuynh hướng cao hơn đại tràng phải, gợi ý ung thư đại tràng trái liên quan đến con đường đột biến gen p53 và củng cố quan điểm cho rằng có sự khác biệt về lâm sàng và giải phẫu bệnh giữa đại tràng trái và đại tràng phải. Theo nghiên cứu của chúng tôi, nhóm có hình ảnh đại thể dạng loét cho tỷ lệ p53 dương tính cao nhất, kế đó là nhóm dạng chồi sùi và thấp nhất là nhóm khác, với tỷ lệ lần lượt là 56%, 49% và 31%. Sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p = 0,26). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Trịnh Tuấn Dũng(17), p53(+) ở u dạng loét nhiều hơn dạng chồi sùi (73,07% so với 40,91%, p < 0,05). Nghiên cứu này cũng cho thấy, nhóm carcinôm tuyến chế nhầy cho tỷ lệ p53 dương tính rất thấp (21,4%) so với nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy (54,3%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Tác giả Georgescu(5) nghiên cứu 41 trường hợp UTĐTT thấy rằng tỷ lệ p53 dương tính bằng HMMD là 58,53%. Trong đó nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy có 65,71% p53(+), còn nhóm carcinôm tuyến chế nhầy chỉ có 16,66% p53(+), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05. Theo báo cáo của Ince(8), đột biến gen p53, phát hiện bằng giải trình tự gen, trong nhóm carcinôm tuyến chế nhầy ít thấy hơn nhóm carcinôm tuyến không chế nhầy, p < 0,02. Diéz(2) nghiên cứu 174 trường hợp UTĐTT thấy tỷ lệ p53(+) bằng HMMD là 47%, liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện tích tụ protein p53 và loại mô học. Ngược lại, một số nghiên cứu khác cho thấy không có liên quan ý nghĩa giữa tích tụ protein p53 và loại mô học(3,11). Đột biến gen p53 tạo ra protein có thời gian bán hủy dài cho phép phát hiện bằng HMMD(10). Tuy nhiên HMMD cho thấy có tới 30-35% kết quả trái ngược với các phương pháp phân tích gen. Vì thế xác định tích tụ quá mức protein p53 không đo lường chính xác chức năng của gen p53(9). Sự phù hợp giữa xác định tích tụ quá mức protein p53 bằng HMMD và phân tích gen từ 60-85%(5,7,10). Kết quả nhuộm HMMD p53 âm tính không phải luôn luôn chứng tỏ là không có đột biến gen p53. Các đột biến tạo ra các protein bị mất đoạn, cắt cụt hoặc không tạo ra protein thì không thể phát hiện bằng HMMD mà chỉ có thể biết được bằng các phương pháp phân tử(15). Theo Crapez(1), độ tương hợp giữa p53 (+) và có đột biến gen p53 là 71,8%, nhuộm p53 bằng HMMD có độ nhạy 75% và giá trị tiên đoán dương cho đột biến gen p53 là 63%. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ biểu hiện tích tụ quá mức protein p53 bằng HMMD là 50%. Liên quan không có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện tích tụ protein p53 trong UTĐTT với giới, tuổi, vị trí u, hình ảnh đại thể. Liên quan có ý nghĩa thống kê giữa biểu hiện tích tụ protein p53 với loại mô học. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Crapez EL, Bibeau F, The1zenas S, et al (2005), “p53 status and response to radiotherapy in rectal cancer: a prospective multilevel analysis”, British Journal of Cancer, 92, 2114-2121. 2. Diéz M, Pollán M, Mguerza JM, et al (2000), Time-dependency of the prognostic effect of carcinoembryonic antigen and p53 protein in colorectal adenocarcinoma”, Cancer, 88, 35-41. 3. Galizia G, Lieto E, Ferraraccio F, et al (2004), “Determination of molecular marker expression can predict clinical outcome in colon carcinomas”, Clinical Cancer Research, 10, 3490- 3499. 4. Garrity MM, Burgart LJ, et al (2004), “Prognostic value of proliferation, apoptosis, defective DNA mismatch repair, and p53 overexpression in patients with resected Dukes’ B2 or C colon cancer: A North central cancer treatment group study”, J Clin Oncol, 22(9), 1572-1582. 5. Georgescu CV, Săftoiu A, Georgescu CC, et al (2007), “Correlations of proliferation markers, p53 expression and histological findings in colorectal carcinoma”, J. Gastrointestin Liver Dis, 16(2), 133-139. 6. Gordon PH (2007), “Malignant neoplasms of the colon”, Neoplasms of the colon, rectum and anus, Informa Healthcare USA Inc, 51-206. 147 7. Graziano F, Cascinu S (2003), “Prognostic molecular markers for planning adjuvant chemotherapy trials in Dukes’ B colorectal cancer patients: how much evidence is enough?”, Annals of Oncology, 14, 1026-1038. 8. Ince WL, Jubb AM, Holden SN, et al (2005), “Association of k-ras, b-raf, and p53 status with the treatment effect of Bevacizumab”, Journal of the National Cancer Institute, 97(13), 981-989. 9. Kahlenberg MS, Stoler DL, Bigas MA, et al (2000), “p53 tumor suppressor gene mutations predict decreased survival of patients with sporadic colorectal carcinoma”, Cancer, 88, 1814- 1819. 10. McLeod HL, Murray GI (1999), “Tumour markers of prognosis in colorectal cancer”, British Journal of Cancer, 79(2), 191-203. 11. Morrin M, Kelly M, et al (1994) “Mutations of Ki- ras and p53 genes in colorectal cancer and their prognostic significance”, Gut, 35, 1627-1631. 12. Nasif WA, El-Emshaty HM, Tabll A, et al (2004), “Immunoreactivity evaluation of mutant p53 gene product with DNA ploidy pattern in colorectal carcinoma”, Hepatogastroenterology, 51 (58), 1001-1006. 13. Nguyễn Sào Trung, Đoàn Thị Phương Thảo, Lê Quốc Sử (2004), “Nghiên cứu sự biểu hiện của gen đè nén u p53 trong ung thư vú bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch”, Y học Tp. Hồ Chí Minh, tập 8 (1), tr.1-7. 14. Nguyễn Thị Hồng, Phạm Hùng Vân, Sakamoto K (2002), “Đột biến gen p53 trong ung thư miệng: phát hiện qua kỹ thuật PCR-SSCP”, Y học Tp. Hồ Chí Minh, chuyên đề ung bướu, tập 6, phụ bản số 4, tr.52-57. 15. Rambau PF, Odida M, Wabinga H (2008), “p53 expression in colorectal carcinoma in relation to histopathological features in Ugandan patients”, African Health Sciences, 8(4), 234-238. 16. Sinicrope FA, Hart J, Michelassi F, Lee JJ (1995), “Prognostic value of bcl-2 oncoprotein expression in stage II colon carcinoma”, Clinical Cancer Research, 1, 1103-1110. 17. Trịnh Tuấn Dũng (2007), “Nghiên cứu sự biểu hiện của các kháng nguyên p53, Ki-67 và Her- 2/Neu trong ung thư đại trực tràng bằng hóa mô miễn dịch”, Y học Tp. Hồ Chí Minh, chuyên đề Giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học. Tập 11, phụ bản số 3, tr.89-94. 18. Zhao D, Ding X, Peng J, Zheng Y, and Zhang S (2005): Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma. J Zhejiang Univ Sci B. December; 6(12): 1163–1169. 148