Điểm đa hình TLR5+1174 không ảnh hưởng đến nguy cơ ung thư dạ dày hay nhiễm Helicobacter Pylori

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 36 ĐIỂM ĐA HÌNH TLR5+1174 KHÔNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN NGUY CƠ UNG THƯ DẠ DÀY HAY NHIỄM Helicobacter pylori Hà Mai Dung*, Hazel Mitchell** TÓM TẮT Mở đầu: Helicobacter pylori là vi khuẩn có chiên mao quan trọng vì lây nhiễm khoảng nửa dân số thế giới và có thể đưa đến bệnh lý nặng là ung thư dạ dày. Điểm đa hình TLR5+1174 là điểm đa hình có chức năng đáng được nghiên cứu của gen TLR5 trong mối liên hệ với các vi khuẩn có chiên mao. Mục tiêu nghiên cứu: Phân tích TLR5+1174 ở ba nhóm người Trung Quốc, Ấn Độ và Mã Lai cư ngụ ở Malaysia; đánh giá mối liên hệ giữa điểm đa hình này với nhiễm khuẩn H. pylori hay nguy cơ ung thư dạ dày. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai nhóm bao gồm 370 đối tượng tham gia nghiên cứu; nhóm chứng: 123 người Trung Quốc, 108 người Ấn Độ, 84 người Mã Lai và nhóm bệnh gồm 55 người Trung Quốc bị ung thư dạ dày. TLR5+1174 được phân tích bằng phương pháp PCR-RFLP với enzyme giới hạn là DdeI. Nhiễm khuẩn H. pylori được xác định bằng kít ELISA HELICOBACTER PYLORI IgG của Biohit Diagnostics. SPSS phiên bản 17 và GraphPad InStat3 dùng để xác định 2test, Fisher Exact test và OR. Kết quả: Có sự khác biệt có ý nghĩa về điểm đa hình TLR5+1174 giữa nhóm Trung Quốc và nhóm Ấn Độ hay nhóm Mã Lai. Không có mối liên hệ giữa TLR5+1174 và nhiễm H. pylori hay ung thư dạ dày. Kết luận: Đặc điểm điểm đa hình TLR5+1174 ở các dân tộc khác nhau có thể khác nhau. TLR5 có thể không có mối liên hệ với nhiễm khuẩn H. pylori hay nguy cơ ung thư dạ dày. Từ khóa: Điểm đa hình, Toll like receptor 5, nhiễm Helicobacter pylori, ung thư dạ dày. ABSTRACT TLR5 + 1174 SPN NOT ASSOCIATED WITH GASTRIC CANCER RISK OR Helicobacter pylori Infection Ha Mai Dung, Hazel Mitchell * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 36 - 41 Background: Helicobacter pylori was an important flagellated bacterium because it infected a half of the world population and could lead to a severe outcome, gastric cancer. TLR5+1174 polymorphism was a functional polymorphism of the gen TLR5 and was considered to be worth to be studied in the association with H. pylori infection or gastric cancer risk. Aims: Anylyzing TLR5+1174 polymorphism in three control ethnic groups resident in Malaysia including Chinese, Indian and Malay. Evaluating the association between this SNP (Single Nucleotide Polymorphism) with H. pylori infection or gastric cancer risk. Methods: Two groups include 370 subjects participating in the study; a control group including 123 Chinese, 108 Indians and 84 Malays; and a case group of 55 Chinese gastric cancers. TLR5+1174 polymorphism was analyzed by PCR-RFLP with the restriction enzyme DdeI. H. pylori infection was * Trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia Tp.HCM ** Trường Đại Học New South Wales, Sydney, Australia Địa chỉ liên hệ: TS BS Hà Mai Dung ĐT: 0937957058 Email: hmdung@hcmiu.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 37 determined by ELISA HELICOBACTER PYLORI IgG from Biohit Diagnostics. SPSS version 17 and GraphPad InStat3 was used to calculate 2test, Fisher Exact test and OR. Results: Significant differences in TLR5+1174 were found between the Chinese and the Indians or the Malays. No association was found between TLR5+1174 and H. pylori infection or gastric cancer. Conclusion: Characteristics of TLR5+1174 polymorphism in different ethnic groups may be different. TLR5 may not associate with H. pylori infection or gastric cancer risk. Keywords: Single Nucleotide Polymorphism, Toll like receptor 5, Helicobacter pylori infection, gastric cancer. MỞ ĐẦU Helicobacter pylori được xem là một tác nhân nhiễm khuẩn quan trọng vì có hơn phân nửa dân số thế giới nhiễm phải loại vi khuẩn này; tình trạng nhiễm khuẩn kéo dài cả đời nếu không được điều trị thỏa đáng và bệnh cảnh nhiễm khuẩn đa dạng từ viêm dạ dày mãn tính, viêm loét dạ dày tá tràng đến ung thư dạ dày(11). Tuy nhiên có thể thấy một điều là tại sao H. pylori có thể gây ra một bệnh cảnh nhiễm khuẩn kéo dài cả đời ở người như vậy vẫn là một câu hỏi chưa có những trả lời thích đáng. Ung thư dạ dày là bệnh cảnh trầm trọng nhất của nhiễm H. pylori. Mối liên hệ giữa nhiễm H. pylori và ung thư dạ dày đã được xác định qua nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới(6,9,10,14,15,16). Tuy nhiên việc chỉ có một tỉ lệ nhỏ (<3%) người nhiễm H. pylori phát triển ung thư dạ dày (18) đưa ra một vấn đề là ngoài yếu tố nhiễm khuẩn còn có những yếu tố khác tham gia vào cơ chế bệnh sinh của ung thư dạ dày. Gần đây yếu tố di truyền của người bệnh đã được nghiên cứu nhiều và cho thấy có góp phần vào việc phát sinh ung thư dạ dày(19,3,4,2,12). Việc H. pylori là vi khuẩn có một chùm chiên mao ở một cực đưa đến một câu hỏi là liệu các chiên mao này có vai trò gì trong bệnh cảnh nhiễm khuẩn mãn tính của H. pylori hay việc phát triển bệnh lý ung thư dạ dày hay không. Trong hệ thống miễn dịch không đặc hiệu chống lại bệnh nhiễm khuẩn, TLR5 (Toll Like Receptor 5) là các thụ thể nhận biết protein flagellin của các chiên mao của vi khuẩn. Một số nghiên cứu khởi đầu vào năm 2003 và 2005 cho thấy là có thể quá trình nhiễm khuẩn H. pylori có liên quan đến các thụ thể TLR5(13,17). Xem xét các điểm đa hình của gen TLR5 có chức năng là TLR5+1174C>T (Arg392Stop), TLR5+2081A>G (Asp694Gly) và TLR5+2464C>T (Leu822Phe) thì hai điểm đa hình TLR5+2081A>G và TLR5+2464C>T chiếm tỉ lệ rất thấp trong cộng đồng (<5%) nên không được xem xét; điểm đa hình TLR5+1174C>T cho thấy là đáng được nghiên cứu vì chiếm tỉ lệ tương đối khá (11,85%) trong một số nghiên cứu và cũng được chứng minh là có liên quan đến bệnh nhiễm vi khuẩn có chiên mao như là Legionella pneumophila(5,8). MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Phân tích điểm đa hình TLR5+1174C>T ở ba nhóm người Trung Quốc, Ấn Độ và Mã Lai cư ngụ ở Malaysia để xem có sự khác biệt; đồng thời đánh giá mối liên hệ giữa điểm đa hình này với tình trạng nhiễm khuẩn H. pylori hay ung thư dạ dày. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu được thu thập từ phòng nội soi đường tiêu hoá trên tại Bệnh viện của khoa Y, trường đại học Malaysia từ tháng 01/2004 đến tháng 7/2007. Có 55 trường hợp người Trung Quốc bị ung thư dạ dày không phải ở tâm vị, được chẩn đoán dựa vào kết quả giải phẩu bệnh là ICD-9 151 tham gia nghiên cứu; và 315 người không có tổn thương dạ dày bao gồm 123 người Trung Quốc, 108 người Ấn Độ và 84 người Mã Lai Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 38 tham gia nghiên cứu với vai trò làm nhóm chứng. Tất cả các trường hợp này đều không được sử dụng kháng sinh, kháng viêm hay kháng acid hai tháng trước khi tham gia nghiên cứu. Các trường hợp nhiễm HIV cũng bị loại trừ. Các đối tượng tham gia nghiên cứu ký giấy đồng ý tham gia nghiên cứu, cho 5ml máu toàn phần với chất chống đông EDTA để phân tích đa hình gen và 5ml máu đông dùng ly trích huyết thanh để chẩn đoán nhiễm Helicoabcter pylori. Tóm tắt về tuổi và giới của các đối tượng tham gia nghiên cứu được mô tả trong bảng 1. Bảng 1: Số lượng, tuổi trung bình và giới của các nhóm tham gia nghiên cứu Nhóm dân tộc Số lượng Tuổi trung bình (khoảng tuổi) Giới (% nam) Người Trung Quốc bình thường 123 55(22-84) 46 Người Ấn Độ bình thường 108 50(19-78) 41 Người Mã Lai bình thường 84 44(20-75) 37 Người Trung Quốc ung thư dạ dày dạng non-cardia 55 68(26-87) 60 Phương pháp nghiên cứu Ly trích DNA: DNA được ly trích từ máu toàn phần bằng cách sử dụng bộ kít Qiagen Blood minikit và thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Xác định các đa hình của TLR5+1174: Bằng kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism) bao gồm hai bước. Bước 1 thực hiện phản ứng PCR với PCR kit của công ty Qiagen và cặp mồi TLR5+1174F: GGT AGC CTA CAT TGA TTT GC và TLR5+1174R: GAT TCT CTG AAG GGG TTT G. Cặp mồi này được tác giả thiết kế có một số thay đổi so với cặp mồi của tác giả Hawn trước đó (8). Điều kiện phản ứng PCR như sau: Biến tính chuỗi DNA ở 940C trong 4 phút; sau đó thực hiện 35 chu kỳ nhiệt với 940C 30 giây, 560C 30 giây, 720C 45 giây; sau cùng là 720C trong 5 phút. Bước 2 là dùng dùng enzym giới hạn DdeI (công ty New England Biolabs) cắt sản phẩm PCR và xác định kiểu mẫu cắt bằng cách chạy điện di với agarose 2% có kèm FN1 DNA ladder để so sánh. Sau đó bản thạch được nhuộm với Ethidium bromide và đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc. Các genotype của điểm đa hình TLR5+1174 được xác định như trong hình 1. Đánh giá tình trạng nhiễm H. pylori: bằng kít ELISA HELICOBACTER PYLORI IgG của công ty Biohit Diagnostics. Quản lý và phân tích dữ liệu bằng Phần mềm SPSS phiên bản 17. Phần mềm GraphPad InStat 3 dùng để xác định Chisquare test, Fisher Exact test và OR (Odd Ratio) nhằm xác định mối liên quan giữa điểm đa hình TLR5+1174 và nhiễm H. pylori hay ung thư dạ dày. KẾT QUẢ Tất cả các nhóm nghiên cứu đều thoả mãn tiêu chuẩn Hardy-Weinberg equilibrium Khi phân tích điểm đa hình TLR5+1174, các nhóm nghiên cứu đều thoả mãn tiêu chuẩn Hardy-Weinberg equilibrium với các giá trị p>0,05. Cụ thể giá trị p bằng 1 (nhóm Trung Quốc); 0,6 (nhóm Ấn Độ) và 0,6 (nhóm Mã Lai). Có sự khác biệt có ý nghĩa về kiểu gen của điểm đa hình TLR5+1174 giữa nhóm Trung Quốc và nhóm Ấn độ hay nhóm Mã Lai Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 39 So sánh tần suất các genotype và T allele của TLR5+1174 giữa ba nhóm dân tộc sống ở Malaysia cho thấy tần suất genotype C/T ở người Trung Quốc (2,4%) thấp rõ rệt so với người Ấn Độ (18,5%) hay người Mã Lai (21,4%) (p<0,001). Tương tự tần suất T allele là rất thấp ở người Trung Quốc (1%) so với người Ấn Độ (9%) hay người Mã Lai (11%) (p<0,001) (bảng 2). Bảng 2: Tần suất các đa hình của TLR5+1174 ở ba nhóm dân tộc cư ngụ ở Malaysia Kiểu đa hình Trung Quốc n=123 n(%) Ấn độ n=108 n(%) Mã Lai n=84 n(%) Giá trị P (Two- sided 2 test) TLR5+1174 <0.001 T/T 0(0,0) 0(0,0) 0(0,0) C/T 3(2,4) 20(18,5) 18(21,4) Kiểu đa hình Trung Quốc n=123 n(%) Ấn độ n=108 n(%) Mã Lai n=84 n(%) Giá trị P (Two- sided 2 test) C/C 120(97,6) 88(81,5) 66(78,6) Tần suất T allele 1% 9% 11% Không có mối liên hệ giữa các đa hình của TLR5+1174 và nhiễm H. pylori Ở mỗi nhóm dân tộc được chia ra hai nhóm nhỏ là H. pylori (+) và H. pylori (-). So sánh kiểu đa hình của TLR5+1174 giữa hai nhóm H. pylori (+) và H. pylori (-) không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa với tất cả giá trị p>0,05. Tuy nhiên ở nhóm người Trung Quốc, những người mang genotype C/T hay allele T ở nhóm H. pylori (+) nhiều hơn 5,2 hay 5,1 lần so với nhóm H. pylori (-) (bảng 3). Bảng 3: So sánh các điểm đa hình của TLR5+1174 giữa hai nhóm H. pylori (-) và H. pylori (+) ở các nhóm chứng tham gia nghiên cứu Kiểu đa hình TLR5+1174 H. pylori (-) n(%) H. pylori (+) n(%) OR(95%CI) Giá trị P (Two-sided Fisher’s Exact test) Người Trung Quốc n=51 n=72 C/C 51(100,0) 69(95,8) 1 C/T 0(0,0) 3(4,2) 5,2(0,3-102,7) 0,3 T/T 0(0,0) 0(0,0) C allele 102(100,0) 141(97,9) 1 T allele 0(0,0) 3(2,1) 5,1(0,3-99,3) 0,3 Người Ấn Độ n=34 n=74 C/C 29(85,3) 59(79,7) 1 C/T 5(14,7) 15(20,3) 1,5(0,5-4,5) 0,6 T/T 0(0,0) 0(0,0) C allele 63(92,7) 133(92,4) 1 T allele 5(7,3) 15(7,6) 1,4(0,5-4,1) 0,6 Người mã Lai n=58 n=26 C/C 46(79,3) 20(76,9) 1 C/T 12(20,7) 6(23,1) 1,2(0,4-3,5) 0,8 T/T 0(0,0) 0(0,0) C allele 104(89,7) 46(88,5) 1 T allele 12(10,3) 6(11,5) 1,1(0,4-3,2) 0,8 Không có mối liên hệ giữa các đa hình của TLR5+1174 và ung thư dạ dày ở nhóm người Trung Quốc Phân tích mối liên hệ giữa kiểu đa hình của TLR5+1174 với ung thư dạ dày dạng không nằm ở tâm vị (non-cardia gastric cancer) ở nhóm người Trung Quốc cho thấy không có sự liên hệ có ý nghĩa với giá trị p=0,4. Tuy nhiên cũng có thể quan sát thấy genotype C/T và allele T phổ biến nhiều hơn ở nhóm người bệnh với OR=2,3 (bảng 4). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 40 Bảng 4: So sánh các kiểu đa hình của TLR5+1174 giữa nhóm người Trung Quốc chứng và nhóm người Trung Quốc bị ung thư dạ dày Kiểu đa hình TLR5+11 74 Nhóm Trung Quốc chứng n(%) Nhóm Trung Quốc ung thư dạ dày n(%) OR(95%CI) Giá trị P (Two- sided Fisher’s Exact test) Total 123 55 C/C 120(97,6) 52(94,5) 1(ref) 0,4 C/T 3(2,4) 3(5,5) 2,3(0,5- 11,8) C allele 243(98,8) 107(97,3) 1(ref) 0,4 T allele 3(1,2) 3(2,7) 2,3(0,5- 11,4) BÀN LUẬN Có thể quan sát thấy sự khác biệt rõ rệt về tần suất genotype C/T hay allele T của điểm đa hình TLR5+1174 giữa người Trung Quốc và người Ấn hay người Mã Lai (p<0,001). Điều này cho thấy khi thực hiện các nghiên cứu về di truyền ngay trong một quốc gia, sự chọn lọc nhóm tham gia nghiên cứu có nguồn gốc dân tộc giống nhau cần được quan tâm. Điểm đa hình TLR5+1174 là một điểm đa hình có chức năng với sự thay đồi nucleotide từ C sang T dẫn đến sự thay đổi từ axít amin Arginin ở vị trí 392 của gen thành stop codon; sự thay đổi này làm đình chỉ hoạt động của gen. Gen TLR5 được xem là gen liên quan đến phản ứng của cơ thể với với cấu trúc chiên mao (flagellar) của vi khuẩn có chiên mao như Salmonella sp, Helicobacter sp hay Legionella sp; Sự khác biệt về mặt di truyền của gen này của nhóm người Trung Quốc, Ấn và Mã Lai có thể góp phần dẫn đến sự nhạy cảm với các bệnh nhiễm khuẩn này ở các dân tộc này là khác nhau. Vấn đề nghiên cứu mối liên hệ giữa gen TLR5 và nhiễm khuẩn H. pylori lúc đầu được đặt ra vì như trong phần mở đầu đã đề cập, do có một số báo cáo trước đó cho thấy có mối liên hệ giữa nhiễm H. pylori và TLR5 (13, 17). Tuy nhiên kết quả của nghiên cứu này cho thấy không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa điểm đa hình TLR5+1174 và nhiễm H. pylori (tất cả giá trị p>0,05). Nhìn lại những kết quả nghiên cứu gần đây về mối liên quan giữa TLR5 và nhiễm H. pylori cho thấy những kết quả trái ngược nhau. Nếu như tác giả Smith và cộng sự cho rằng TLR2 và TLR5 là các thụ thể quan trọng của miễn dịch không đặc hiệu trong việc nhận dạng H. pylori (13), thì một số tác giả khác lại cho rằng TLR5 không đóng vai trò nhận biết nhiễm khuẩn H. pylori (1, 7). Cụ thể tác giả gewirtz và cộng sự chứng minh rằng so với các vi khuẩn có chiên mao khác, H. pylori không tiết flagellin; flagellin tái tổ hợp của H. pylori cho thấy hoạt động 1000 lần kém hơn so với flagellin của Salmonella typhimurium trong tác dụng kích hoạt TLR5; thử nghiệm huỷ gen H. pylori FlaA cũng cho thấy không ảnh hưởng đến quá trình tiết IL-8 do nhiễm H. pylori (7). Mối liên hệ giữa giữa điểm đa hình TLR5+1174 và ung thư dạ dày cũng được đánh giá ở nhóm người Trung Quốc (do số lượng bệnh ung thư dạ dày tham gia nghiên cứu tương đối lớn ở nhóm này) cho thấy không có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê giữa điểm đa hình này và ung thư dạ dày (bảng 4). KẾT LUẬN Đặc điểm điểm đa hình TLR5+1174 ở các dân tộc khác nhau có thể khác nhau, điều này đòi hỏi sự giống nhau về dân tộc của các đối tượng tham gia nghiên cứu trong các nghiên cứu về đặc điểm di truyền. Nghiên cứu này cho thấy điểm đa hình TLR5+1174 không có mối liên hệ với nhiễm khuẩn H. pylori hay ung thư dạ dày. Điều này cho thấy rằng có thể là TLR5 không đóng vai trò gì trong nhiễm khuẩn H. pylori hay ung thư dạ dày. CÁM ƠN Nghiên cứu này được thực hiện với sự giúp đỡ kinh phí từ hiệp hội ung thư New South Wales, Australia (REF 66/04). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Andersen-Nissen E, Smith KD, Strobe KL, Barrett SL, Cookson BT, Logan SM, et al. (2005). Evasion of Toll-like receptor 5 by flagellated bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102(26):9247-52. 2. Ando T, Goto Y, Maeda O (2006). Causal role of Helicobacter pylori infection in gastric cancer. World Journal of Gastroenterology. 12(2):181-6. 3. Correa P, Schneider BG (2005). Etiology of gastric cancer: what is new? Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 14(8):1865-8. 4. Crowe SE (2005). Helicobacter infection, chronic inflammation, and the development of malignancy. Current Opinion in Gastroenterology. 21(1):32-8. 5. Dunstan SJ, Hawn TR, Nguyen TH, Parry CP, Ho VA, Ha V, et al. (2005). Host susceptibility and clinical outcomes in toll-like receptor 5-deficient patients with typhoid fever in Vietnam. Journal of Infectious Diseases. 191(7):1068-71. 6. Forman D, Newell DG, Fullerton F, Yarnell JW, Stacey AR, Wald N, et al. (1991). Association between infection with Helicobacter pylori and risk of gastric cancer: evidence from a prospective investigation. British Medical Journal. 302(6788):1302-5. 7. Gewirtz AT, Yu Y, Krishna US, Israel DA, Lyons SL, Peek RM, Jr. (2004). Helicobacter pylori flagellin evades toll-like receptor 5-mediated innate immunity. Journal of Infectious Diseases. 189(10):1914-20. 8. Hawn TR, Verbon A, Lettinga KD, Zhao LP, Li SS, Laws RJ, et al. (2003). A common dominant TLR5 stop codon polymorphism abolishes flagellin signaling and is associated with susceptibility to legionnaires' disease. Journal of Experimental Medicine. 198(10):1563-72. 9. IARC (1994). Schistosomes, Liver Flukes and Helicobacter pylori. Lyon, IARCPress. 10. Kikuchi S, Wada O, Nakajima T, Nishi T, Kobayashi O, Konishi T, et al. (1995). Serum anti-Helicobacter pylori antibody and gastric carcinoma among young adults. Research Group on Prevention of Gastric Carcinoma among Young Adults. Cancer. 75(12):2789-93. 11. Lee A, Dixon MF, Danon SJ, Kuipers E, Megraud F, Larsson H, et al. (1995). Local acid production and Helicobacter pylori: a unifying hypothesis of gastroduodenal disease. European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 7(5):461-5. 12. Megraud F, Lehours P (2004). Helicobacter pylori and gastric cancer prevention is possible. Cancer Detection & Prevention. 28(6):392-8. 13. Michael F, Smith Jr, Mitchell A, Li G, Ding S, Fitzmaurice AM, Ryan K, et al. (2003). Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR5, but not TLR4, are required for Helicobacter pylori- induced NF-kappa B activation and chemokine expression by epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 278(35):32552-60. 14. Nomura A, Stemmermann GN, Chyou PH, Kato I, Perez- Perez GI, Blaser MJ (1991). Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese Americans in Hawaii. New England Journal of Medicine. 325(16):1132-6. 15. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, Chang Y, Vogelman JH, Orentreich N, et al. (1991). Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. New England Journal of Medicine. 325(16):1127-31. 16. The Eurogast Study Group (1993). An international association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer. Lancet. 341:1359-62. 17. Torok AM, Bouton AH, Goldberg JB (2005). Helicobacter pylori induces interleukin-8 secretion by Toll-like receptor 2- and Toll-like receptor 5-dependent and -independent pathways. Infection & Immunity. 73(3):1523-31. 18. Uemura N, Okamoto S, Yamamoto S, Matsumura N, Yamaguchi S, Yamakido M, et al. (2001). Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer. New England Journal of Medicine. 345(11):784-9. 19. Van Amsterdam K, van Vliet AH, Kusters JG, van der Ende A (2006). Of microbe and man: determinants of Helicobacter pylori-related diseases. FEMS Microbiology Reviews. 30(1):131-56.