Giải trình tự chuỗi DNA phát hiện đột biến gen P53 trong ung thư niêm mạc miệng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 119 GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG Trần Thị Kim Cúc*, Nguyễn Thị Hồng* TÓM TẮT Mở đầu: Đột biến p53 được nhận biết trong nhiều loại bướu, thể hiện tính bất ổn bằng cách cho phép tích lũy những thay đổi về di truyền do quá trình sinh ung tạo ra. Mục tiêu: Nghiên cứu này tìm hiểu tỉ lệ và kiểu đột biến của gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam. Đối tượng và phương pháp: Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp để phân tích vùng bảo tồn của gen p53 từ exon 5 đến exon 8 trong ung thư tế bào gai nguyên phát ở hốc miệng của 109 bệnh nhân, và tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen p53 với những thói quen nguy cơ ung thư như hút thuốc, uống rượu, nhai trầu. Kết quả: Tỉ lệ đột biến gen 53 là 47,7%. Về kiểu đột biến, 62,2% là đột biến sai nghĩa; 18,9% đột biến vô nghĩa; 9,4% đột biến mất đoạn gen; 5,7% đột biến ghép nối sai; 1,9% đột biến thêm đoạn gen và 1,9% đột biến trong khung. Đa số là đột biến chuyển vị G:C>A:T (40,0%) và đột biến chuyển dạng G:C>T:A (25,5%). Tỉ lệ đột biến gen p53 ở những người có thói quen hút thuốc lá cao hơn có ý nghĩa so với ở những người không có thói quen này (p<0,05). Kết luận: Nghiên cứu cho thấy vai trò của thuốc lá trong sự sinh ung thư và ảnh hưởng của thuốc lá đến kiểu đột biến và phổ đột biến đặc hiệu của gen p53 ở bệnh nhân ung thư niêm mạc miệng. Từ khóa: Đột biến gen p53, giải trình tự DNA, ung thư niêm mạc miệng. ABSTRACT DETECTION OF P53 GENE MUTATIONS IN ORAL CANCER BY DNA SEQUENCING Tran Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 119 - 127 Background: p53 gene mutation observed in many tumors, expresses instability by allowing the accumulation of genetic alterations occurring in this multistep process. Objectives: The present study was conducted to investigate the incidence and patterns of p53 mutation in patients with oral cancer. Materials and methods: DNA sequencing was used to explore the conserved region of the p53 gene (exon 5-8) in primary oral squamous cell carcinoma (OSCC) specimens from 109 patients. Then, the correlation between p53 mutations and risk habits of oral cancer such as tobacco smoking, alcohol drinking and betel chewing was analyzed. Results: The result showed that 47.7% had p53 gene mutations at exon 5-8. Of which, 62.2% were missense mutations, 18.9% were nonsense encoding translational stop codons, 9.4% were deletions, 5.7% were splice-site mutations, 1.9% was insertion, and 1.9% was inframe mutation. G:T>A:T transitions and G:C>T:A transversions were the predominant mutations (65,5%). p53 gene mutation significantly related to tobacco smoking habit (p< 0.05). *: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Trần Thị Kim Cúc ĐT: 0908348850, Email: kimcuc0804@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 120 Conclusion: This study suggested an important contributing role of tobacco to p53 gene mutation and that tobacco might induce specific patterns and spectrums of mutations in oral cancer patients. Key words: p53 gene mutations, DNA sequencing, oral cancer. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là bệnh lý do những thay đổi về mặt tế bào qua một loạt đột biến ở các gen đặc hiệu, làm tăng sinh tế bào không kiểm soát được. Nguyên nhân của những thay đổi này do tiếp xúc với một hay nhiều các tác nhân hóa học hay vật lý, gây ra các lỗi trong quá trình sao chép hay các lỗi trong quá trình sửa chữa DNA. Đột biến ở các gen kiểm soát chu kỳ tế bào và đường dẫn truyền tín hiệu sửa chữa DNA là những sự kiện bắt đầu và cần thiết của quá trình sinh ung thư(5). Những nghiên cứu gần đây cho thấy bất hoạt các gen đè nén bướu là yếu tố quan trọng trong quá trình sinh ung thư nhiều bước. Có nhiều gen đè nén bướu liên quan đến các bướu ác tính khác nhau, cũng như liên quan đến ung thư niêm mạc miệng (UTNMM). Sự thay đổi gen đè nén bướu p53 là yếu tố di truyền được nói đến nhiều nhất trong các loại ung thư ở người. Các nghiên cứu cho thấy tỉ lệ đột biến gen này thay đổi từ 30-70% trong ung thư đầu cổ(2,4). Gen p53, nằm trên nhiễm sắc thể 17, có 11 exon mã hóa cho protein ở nhân tế bào có trọng lượng phân tử 53 kDa, được biết đến với chức năng điều hòa sự tăng sinh tế bào. Khi tế bào bị tổn thương DNA, protein p53 làm dừng chu kỳ tế bào ở pha G1 nhằm khởi động quá trình sửa chữa DNA, hoặc quá trình chết tế bào theo lập trình. Do có vai trò quan trọng trong điều hòa chu kỳ tế bào, gen p53 ảnh hưởng nhiều đến quá trình điều trị ung thư như hóa trị hay xạ trị(1). Phân tích các kiểu đột biến gen p53 giúp nhận biết vị trí đột biến và làm rõ hơn chức năng của protein p53 đột biến, chức năng này thường bị bất hoạt trong tế bào ung thư. Ngoài ra, các kiểu đột biến có thể thay đổi tùy thuộc vào bản chất của các yếu tố bệnh căn, và cho thấy phổ đột biến của gen p53 có thể là dấu ấn sinh học liên quan đến các tác nhân môi trường. Đa số đột biến xảy ra từ exon từ 5 đến exon 8 của gen p53, nằm ở vị trí đặc hiệu của gen- chính là khu vực kết nối với DNA(9). Nghiên cứu này khảo sát sự thay đổi của gen p53 trong UTNMM ở người Việt Nam, với các mục tiêu sau: - Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 trong UTNMM. - Xác định tỉ lệ các kiểu đột biến gen p53 trong UTNMM. - Phân tích mối liên quan giữa đột biến gen p53 với các thói quen nguy cơ UTNMM (hút thuốc, uống rượu, nhai trầu). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu về lâm sàng, giải phẫu bệnh và sinh học phân tử gồm 109 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là UTNMM và được điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Tp.HCM trong năm 2009 và 2010. Tiêu chuẩn chọn bệnh - Có tổn thương ung thư nguyên phát ở hốc miệng. - Có chẩn đoán giải phẫu bệnh là carcinôm tế bào gai. - Có trả lời phỏng vấn trực tiếp về các thói quen ăn trầu, hút thuốc, uống rượu. - Có hồ sơ bệnh án đầy đủ. - Chưa được điều trị ung thư đặc hiệu. Thiết kế nghiên cứu Cắt ngang, mô tả và phân tích. Qui trình nghiên cứu - Ghi nhận qua phỏng vấn trực tiếp các dữ liệu của bệnh nhân và thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai trầu. - Khám và đánh giá lâm sàng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 121 - Đánh giá cận lâm sàng: giải phẫu bệnh, chụp phim tia X, siêu âm, nội soi tai mũi họng, xét nghiệm máu, nước tiểu, v.v - Chẩn đoán và điều trị ung thư (theo hồ sơ bệnh án của bệnh viện). - Mẫu mô lấy từ bệnh phẩm sinh thiết hay phẫu thuật bướu nguyên phát được cố định, vùi nến và nhuộm Hematoxylin- Eosin thường qui tại Bệnh viện ung bướu để khảo sát giải phẫu bệnh. - Tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử gồm ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết ở tổn thương hốc miệng và giải trình tự chuỗi DNA tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử- Đại học Y Dược TP. HCM. Bước 1: Ly trích DNA Ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết một phần ở tổn thương ung thư bằng bộ ly trích Roche theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Bước 2: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) - Do đa số đột biến gen p53 xảy ra ở exon 5 đến exon 8, nên nghiên cứu này chỉ khảo sát đột biến từ exon 5 đến exon 8 của gen p53. - Dùng 4 cặp mồi để khuếch đại các exon 5, 6, 7 và 8 của gen p53 (các đoạn mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen p53 có mã số NG.017013 trong GenBank). Trình tự các nucleotid của các đoạn mồi như sau: Tên mồi Trình tự mồi (5’3’) Exon được khuếch đại Kích thước sản phẩm PCR (bp) P53g5F2 GGTTGCAGGAGGTGCTTACA 5-6 542 P53, 5-6R CACTGACAACCACCCTTAAC P53seq7F GGCCTCCCCTGCTTGCCACA 7-8 755 P53seq7F GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG - Chuẩn bị 20μl hỗn hợp cho PCR gồm có: 2μl dung dịch đệm 1X, 2μl các deoxyribo nucleotid triphosphat (dNTP), 0,15μl Takara HS Taq DNA polymerase (5 unit/μl), 1μl đoạn mồi cùng chiều, 1μl đoạn mồi ngược chiều, 12,85μl nước cất và 1μl DNA đã ly trích. Chương trình PCR 980C x 2 phút 980C x 10 giây 600C x 30 giây 720C x 2 phút 45 chu kỳ nhiệt 720C x 5 phút - Một đợt thí nghiệm PCR luôn có một chứng dương đã biết cho kết quả PCR (+) và một chứng âm thay thế mẫu DNA ly trích bằng nước cất. - Kết quả PCR được đánh giá bằng cách điện di trên gel agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide trong khoảng 20 phút và đọc kết quả. Nếu vạch của DNA khảo sát ở cùng mức với vạch của chứng dương và có số base đọc ở thang kích thước DNA phù hợp thì kết quả PCR (+), cho biết đã khuếch đại được exon mong muốn. Bước 3: Giải trình tự các nucleotid trên chuỗi DNA và đọc kết quả Đầu tiên tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng bộ xét nghiệm của QIA gen (QIAquick Gel Extraction kit). Thực hiện PCR qua 25 chu kỳ nhiệt để khuếch đại đoạn trên DNA cần xác định trình tự. Thành phần phản ứng Thể tích Big Dye terminator V.3.1 4 l Primer (10µM) 0,3 l 1X seq buffer 12,7 µl Sản phẩm PCR đã tinh sạch 3 l Tổng cộng 20 l Chương trình PCR 960C x 2 phút 960C x 10 giây 500C x 5 giây 600C x 4 phút 25 chu kỳ nhiệt Giữ ở 40C Kết tủa DNA bằng ethanol - 20μl sản phẩm DNA trên được thêm 75μl ethanol 100% và 15μl5M NH4OAC. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút. Thêm 300μl ethanol 70%, quay ly tâm 14.000 vòng/phút Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 122 trong 10 phút. Đổ dịch nổi, lấy cặn lắng và để khô tự nhiên. - Hòa tan tủa trong 20μl dung dịch đệm Formamide. - Biến tính DNA ở 95C trong 2 phút và làm lạnh đột ngột để tách thành các chuỗi đơn. Lấy 10μl dung dịch đệm chứa DNA đưa vào giếng đặt vào máy giải trình tự. Giải trình tự và đọc kết quả. - Đoạn DNA chứa 4 exon được chia thành 2 đoạn nhỏ, đoạn chứa exon 5 và 6; đoạn chứa exon 7 và 8. - Mỗi đoạn DNA này được giải trình tự hai chiều với đoạn mồi cùng chiều và đoạn mồi ngược chiều. - Trình tự các nucleotid trên chuỗi DNA được phân tích qua máy giải trình tự DNA tự động (ABI 3100 Genetic Analyser). Nếu có đột biến thì sẽ phát hiện tạị một vị trí có hai nucleotid thay vì chỉ có một nucleotid như bình thường, do mẫu DNA được định chuỗi có chứa những chuỗi bình thường và chuỗi đột biến. Kết quả cũng được đối chiếu với trình tự các nucleotid trên DNA bình thường (mã số NG.017013) để xác định chính xác các nucleotid bị đột biến. - Dữ liệu đột biến được tra cứu theo dữ liệu của IARC (R15- năm 2010). Thống kê và xử lý dữ liệu Các dữ liệu được nhập bằng phần mềm Excel và được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0. Mối liên quan giữa các thói quen với đột biến gen p53 được xác định qua phép kiểm χ2, liên quan có ý nghĩa khi giá trị p<0,05. KẾT QUẢ Đặc điểm mẫu khảo sát 109 bệnh nhân có tuổi từ 29 đến 78 tuổi, với độ tuổi trung bình 59 ±12 tuổi, trong đó 95 bệnh nhân (87,2%) trên 45 tuổi. Có 75 bệnh nhân nam (68,8%) và 34 nữ (31,2%), tỉ lệ nam:nữ là 2,2:1. Các vị trí bướu theo thứ tự giảm dần là lưỡi (43,1%), sàn miệng (23,9%), nướu răng (18,3%), niêm mạc má (7,4%), khẩu cái (4,5%) và môi (2,8%). Bướu ở giai đoạn trễ (III và IV) chiếm tỉ lệ 80,73%. Có 78 bệnh nhân (73 nam và 5 nữ), chiếm tỉ lệ 71,5% có thói quen hút thuốc, 64 bệnh nhân nam có thói quen hút thuốc kèm theo uống rượu (58,7 %). 16 bệnh nhân nữ (14,7%) có thói quen nhai trầu. Đột biến gen p53 trong UTNMM Kết quả ở bảng 1 cho thấy trong 109 bệnh nhân UTNMM, có 52 bệnh nhân có đột biến gen p53, chiếm tỉ lệ 52/109 (47,7%). Trong đó, một bệnh nhân có hai đột biến khác nhau trên cùng một exon. Như vậy, tổng cộng có 53 đột biến được phát hiện trên các exon 5-8 của gen p53. Trong số 53 đột biến, đột biến gen p53 xuất hiện nhiều nhất trên exon 5, gồm 24 trường hợp (45,3%). Có 33 vị trí codon bị đột biến, trong đó hai vị trí axít amin bị đột biến nhiều nhất là Arg175 và Tyr 205, cùng có tỉ lệ 7,6%. Đột biến ở Tryp146, Val157 và Arg196 cùng chiếm tỉ lệ 5,7%. Các vị trí đột biến Ala159, Val 216, Gly 245, Gly 266 và Arg 282 xuất hiện với tỉ lệ 3,8%. Các vị trí codon khác chỉ xuất hiện một lần, tỉ lệ xuất hiện là 1,9%. Bảng 1: Đột biến gen p53 trong UTNMM Mã số BN Tuổi Exon Codon Đột biến nucleotid Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin Kiểu đột biến * 18 47 5 126 TTAAGGGTGGTTGTCAGTGAG Thêm 21N Cắt cụt F 106 81 5 127 TCC  TTC C  T Ser  Phe M Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 123 Mã số BN Tuổi Exon Codon Đột biến nucleotid Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin Kiểu đột biến * 23 73 5 135 TGC  TTC G  T Cys  Phe M 31 32 5 143 GTG  ATG G  A Val  Met M 9 77 5 146 TGG  TGA G A Trp  dừng N 10 52 5 146 TGG  TGA G  A Trp  dừng N 75 75 5 146 TGG TGA G  A Trp  dừng N 113 66 5 149 TCCACA Mất 1N Cắt cụt F 74 54 5 152 CCG  CAG C  A Pro  Gln M 70 66 5 155 ACC  ATC C  T Thr  Ile M 33 76 5 157 GTC  TTC G  T Val  Phe M 35 35 5 157 GTC  TTC G  T Val  Phe M 78 58 5 157 GTC  TTC G  T Val  Phe M 7 51 5 159 GCC  CCC G  C Ala  Pro M 11 62 5 159 GCC  CCC G  C Ala  Pro M 90 52 5 160 GCCATG Mất 1N Cắt cụt F 28 35 5 171 GAG  GGG A  G Glu  Gly M 56 52 5 173 GTG  TTG G  T Val  Leu M 69 62 5 175 CGC  CAC G  A Arg  His M 104 47 5 175 CGC  CAC G -A Arg  His M 16 64 5 175 CGC  CTC G  T Arg  Leu M 49 60 5 175 GCTGCCCCCAC Mất 11N Cắt cụt F 52 52 5 176 TGC  TTC G  T Cys Phe M 100 88 5 181 CGC  CCC G  C Arg  Pro M 64 70 6 192 CAG  TAG C  T Gln dừng N 1 60 6 193 CAT  CGT A  G His  Arg M 19 66 6 196 CGA  TGA C  T Arg dừng N 38 67 6 196 CGA  TGA C  T Arg dừng N 111 42 6 196 CGA  TGA C  T Arg dừng N 40 62 6 205 TAT  TGT A  G Tyr  Cys M 65 67 6 205 TAT  TGT A  G Tyr  Cys M 77 55 6 205 TAT  TGT A  G Tyr  Cys M 76 76 6 205 TAT  GGT TAGG Tyr  Gly M 19 66 6 213 CGA  TGA C  T Argdừng N 71 57 6 216 GTG  TTG G T Val  Leu M 61 51 6 216 GTG  ATG G  A Val Met M 29 58 7 225 GTT  ATT G  A Val  Ile M 39 80 7 238 TGT  TAT G  A Cys  Tyr M 45 50 7 241 TCCT TCT Mất 1N Cắt cụt F 102 46 7 245 GGC  TGC G  T Gly Cys M 92 58 7 245 GGC  AGC G  A Gly  Ser M 37 64 7 246 ATG Mất 3N Mất Met I 50 42 7 248 CCGGA  CCGA Mất 1N Cắt cụt F 87 63 7 249 AGG  AAT GGAT Arg Asn M 82 54 8 266 GGA  TGA G  T Glydừng N Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 124 Mã số BN Tuổi Exon Codon Đột biến nucleotid Thay đổi nucleotid Thay đổi acid amin Kiểu đột biến * 85 85 8 266 GGA  TGA G  T Glydừng N 51 60 8 271 GAG  AAG G  A Glu  Lys M 88 44 8 272 GTG  ATG G  A Val Met M 32 45 8 282 CGG  TGG C  T Arg  Trp M 44 90 8 282 CGG  TGG C  T Arg Trp M 84 52 Intron 4 cagTAC  cggTAC A G IVS4-2A>G S 15 76 Intron 6 GAGgtc  GAGttc G  T IVS6+1G>T S 34 58 Intron 6 tagGTT  ttgGTT A  T IVS6-2A>T S ٭: M: đột biến sai nghĩa, N: đột biến vô nghĩa, F: đột biến dịch khung, I: đột biến trong khung, S: đột biến ghép nối sai Các kiểu đột biến gen p53 Các đột biến chủ yếu là dạng đột biến điểm, chiếm tỉ lệ 81,1%, bao gồm đột biến sai nghĩa (62,2%) và đột biến vô nghĩa (18,9%). Đột biến dịch khung chiếm tỉ lệ 11,3%, bao gồm đột biến mất hay đột biến thêm đoạn gen. Các đột biến ghép nối sai tại vị trí ghép nối intron và exon chiếm tỉ lệ 5,7%. Đột biến chuyển vị chiếm 52,7%, chủ yếu là dạng G:C>A:T. Đột biến chuyển dạng với tỉ lệ 34,6%, chủ yếu là dạng G:C>T:A. Bảng 2: Các kiểu đột biến ở Exon 5-8 và phổ đột biến của gen p53 trong 109 bệnh nhân UTNMM Đột biến gen p53 Số ca (%) Exon 5 24 (45,3) Exon 6 12 (22,6) Exon 7 08 (15,1) Exon 8 06 (11,3) Intron 4 01 (1,9) Intron 6 02 (3,8) Kiểu đột biến 43 (81,1) Đột biến điểm 33 (62,2) Đột biến sai nghĩa 10 (18,9) Đột biến vô nghĩa 06 (11,3) Đột biến dịch khung 05 (9,4) Đột biến mất 01 (1,9) Đột biến thêm 01 (1,9) Đột biến trong khung 03 (5,7) Đột biến ghép nối sai 29 (52,7) Phổ đột biến 14 (25,4) Chuyển vị 08 (14,6) Đột biến gen p53 Số ca (%) G:C>A:T 07 (12,7) G:C>A:T tại vị trí CpG 19 (34,6) A:T>G:C 03 (5,5) Chuyển dạng 04 (25,5) G:C>C:G 01 (1,8) G:C>T:A 01 (1,8) A:T>T:A 06 (10,9) A:T>C:G 01 (1,8) Khuyết đoạn gen Thêm đoạn gen Liên quan giữa đột biến gen p53 với các thói quen nguy cơ của UTNMM Tỉ lệ đột biến gen p53 ở người hút thuốc là 53,8% (42/78 ca), trong đó ở người hút thuốc và uống rượu là 50% (32/64 ca). Tỉ lệ đột biến gen p53 ở người nhai trầu là 43,8% (7/16 ca), trong đó 2 người nhai trầu và hút thuốc đều có đột biến gen p53 (100%). Nhóm bệnh nhân có thói quen hút thuốc có tỉ lệ đột biến gen p53 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với nhóm 31 bệnh nhân không có thói quen này (p<0,05). Tỉ lệ đột biến gen p53 ở bệnh nhân có thói quen nhai trầu (43,8%), cao hơn nhóm 15 bệnh nhân không có thói quen này (33,3%), nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Bảng 3: Liên quan giữa đột biến gen p53 với các thói quen nguy cơ của UTNMM Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 125 Thói quen Tổng Số ca Đột biến gen p53 (+) Đột biến gen p53 (+) Giá trị p Số ca % Số ca % Hút thuốc 78 42 53,8 36 46,2 0,042 Không thói quen 31 10 32,3 21 67,7 Nhai trầu (nữ) 16 7 43,8 9 56,2 0,552 Không thói quen (nữ) 15 05 33,3 10 66,7 BÀN LUẬN Tỉ lệ đột biến gen p53 Theo số liệu mới nhất về đột biến gen p53 của tổ chức quốc tế nghiên cứu về ung thư (IARC) năm 2010 (dữ liệu R15), tỉ lệ đột biến gen p53 trong ung thư đầu cổ nói chung là 43%(14). Trong UTNMM, tỉ lệ này thay đổi từ 5,4% đến 67% tùy từng nghiên cứu(8). Sự khác biệt nhiều có thể do sự khác biệt về vị trí ung thư và thói quen nguy cơ(2,4). Đột biến gen p53 khá phổ biến ở Nhật Bản, Pháp, Mỹ (53,3%), nơi mà hút thuốc và uống rượu được xem là những yếu tố nguy cơ chính trong UTNMM. Kết quả tỉ lệ đột biến gen p53 trong nghiên cứu này là 47,7%, cao hơn so với nhiều nước phổ biến thói quen nhai trầu như Ấn độ (17%-24%)(2,7), nhưng tương tự kết quả nghiên cứu tại Đài Loan (48,86%). Nghiên cứu đầu tiên về đột biến gen p53 ở Việt nam trên 18 bệnh nhân UTNMM phát hiện tỉ lệ đột biến gen p53 là 44,4%(8). Điều này cho thấy gen p53 dễ bị đột biến ờ người Việt Nam trong quá trình sinh ung thư ở hốc miệng. Vị trí exon và codon đột biến PCR và định trình tự chuỗi DNA được sử dụng để phát hiện trực tiếp kiểu đột biến gen. Các đột biến điểm làm thay đổi chỉ một nucleotid trong tổng số 23.000 nucleotid trong gen. Đột biến gen p53 thường được tìm thấy trong 280 trên 393 codon cần thiết cho sự tổng hợp protein. Điều này làm cho chẩn đoán đột biến trở nên khó khăn hơn, vì vùng phân tích hầu như trải dài trên toàn bộ gen. Nhiều nhóm nghiên cứu chỉ tập trung trên exon 5-8, vì 80- 90% đột biến xảy ra tại các vị trí exon này. Kỹ thuật phân tử khá phức tạp nhưng đây là phương tiện chẩn đoán duy nhất để xác định chính xác loại đột biến(1,11). Trong nghiên cứu này, tỉ lệ đột biến gen p53 ở các exon 5, 6, 7, 8 lần lượt là 45,2%, 22,6%, 15,1% và 11,3%. Nhiều nghiên cứu ghi nhận exon 5 dễ bị đột biến nhất(7,13), trong khi một số nghiên cứu cho thấy exon 8 lại là vùng đích dễ bị đột biến(8). Nghiên cứu về cấu trúc đã cho thấy các codon mã hóa các axít amin trong các vùng đột biến nóng chủ yếu ở vùng trung tâm (vị trí từ a.a.102-292), chỉ một số ít các đột biến nằm ở vùng điều hòa (đầu cùng N từ a.a. 1-99 và đầu cùng C từ a.a. 301-393). Một số codon cho thấy có tần suất đột biến cao, với 28% đột biến ảnh hưởng đến chỉ 6 vị trí của gen p53, như Arg175, Gly245, Arg248, Arg249, Arg273 và Arg282. Các vị trí axít amin đột biến thường gặp (điểm nóng) là vùng DNA dễ bị tổn thương hoặc là bộ mã di truyền mã hóa cho một acid amin chủ chốt trong vùng thực hiện chức năng sinh học của protein, hoặc cả hai(1,6). Nghiên cứu này cũng tìm thấy 3 điểm nóng thường gặp nhất là Arg175, Gly245 và Arg282, chiếm tỉ lệ 15,2%. Kiểu đột biến gen p53 Đặc điểm của kiểu hình đột biến gen p53 thường gặp là đột biến sai nghĩa. Kết quả nghiên cứu từ exon 5 đến exon 8 cho thấy đa số (62,3%) là đột biến sai nghĩa. Theo Stojnev(12), hơn 75% đột biến gen p53 gây ra sự thay đổi một axít amin riêng lẻ, dẫn đến sự tổng hợp protein có chiều dài đầy đủ và ổn định, nhưng mất chức năng gắn DNA đặc hiệu và tích lũy trong nhân tế bào bướu. Kết quả bất hoạt protein p53 do đột biến gây ra sự thay thế axít amin làm cho nhiều tế bào buớu có biểu hiện protein p53 đột biến. Những protein này thường ổn định hơn protein nguyên thủy, và hiện diện ở mức cao hơn trong tế bào bướu(1). Trong các đột biến, 20-25% ảnh hưởng trên sự tổng hợp protein không toàn vẹn. Thông thường các loại đột biến này là đột biến vô nghĩa, tạo thành sự dừng codon, hoặc là dạng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 126 khuyết/thêm gen một đoạn nhỏ, dẫn đến những đột biến dịch khung(12). Chúng tôi tìm thấy tỉ lệ 30,2% các đột biến vô nghĩa và đột biến dịch khung. Các đột biến dịch khung xảy ra thường xuyên trong ung thư đầu cổ hơn các vị trí ung thư khác(2). Đột biến ghép nối sai tại các vị trí intron– exon chiếm 5,7% các loại đột biến, phù hợp với quan điểm của các tác giả cho rằng đột biến ghép nối sai trên gen p53 có thể gặp trong ung thư miệng hầu(14). Liên quan giữa tỉ lệ đột biến gen p53 với các thói quen nguy cơ của UTNMM Đột biến gen xảy ra ở 53,8% bệnh nhân hút thuốc có kèm uống rượu, khác biệt có ý nghĩa so với bệnh nhân không có thói quen này (p<0,05). Brennan phát hiện 42% UTNMM có đột biến gen p53 xảy ra ở 58% bệnh nhân hút thuốc và uống rượu, 33% bệnh nhân hút thuốc, 17% bệnh nhân không thói quen, cho thấy hút thuốc và uống rượu có liên quan với tỉ lệ cao đột biến gen trong ung thư đầu cổ(3). Tỉ lệ người nhai trầu có đột biến gen p53 cao hơn so với nhóm bệnh nhân không có thói quen này, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa. Điều này đặc biệt thấy rõ ở các nước châu Á phổ biến thói quen nhai trầu thường có tỉ lệ đột biến gen p53 khá thấp(2,4). Liên quan giữa phổ đột biến với tác nhân gây ung thư Nghiên cứu tìm thấy 52,7% là đột biến chuyển vị, với 40% là dạng chuyển vị G:C>A:T (trong đó hơn 1/3 trường hợp chuyển vị này xảy ra tại vị trí CpG). Soussi phân tích tất cả các đột biến điểm cho thấy 51% đột biến là dạng chuyển vị G:C >A:T, 59% trong số các dạng đột biến này xuất hiện tại vị trí CpG- vùng DNA nơi nucleotid cytosin theo sau bởi nucleotid guanin dọc theo chuỗi DNA(11). Sự chuyển vị G:C>A:T tại vị trí CpG được biết là do sự khử amin của 5- methylcytosin thành thymin dẫn đến sự bắt cặp T/G bị lỗi, nếu không sửa chữa được, sẽ gây ra tỉ lệ cao đột biến p53 chuyển vị. Các chất sinh ung ngoại sinh như bức xạ tia cực tím, benzopyren trong thuốc lá có ảnh hưởng mạnh hơn đến quá trình methyl hóa dinucleotid CpG. Các chất sinh ung nội sinh, do sự trao đổi chất trong tế bào bị thay đổi, cũng có thể nhắm đích các dinucleotid methyl hóa, gây tỉ lệ chuyển vị cao hơn(10,11). Với sự chuyển vị G:C>A:T không phải tại vị trí CpG, nghiên cứu labo cho thấy đây là dạng đột biến thường gặp nhất do các tác nhân alkylate gây ra, dẫn đến sự bắt cặp sai O6- methylguanin với thymin. N-nitrosamin trong thuốc lá hút là nguyên nhân gây ra dạng đột biến chuyển vị này(2,10), đồng thời N-nitrosamin trong thực phẩm ở Trung quốc và Ấn độ cũng góp phần gây nên dạng đột biến chuyển vị G:C>A:T(13). 15 trên tổng số 22 (68%) trường hợp đột biến chuyển vị kiểu này liên quan đến thói quen hút thuốc trong nghiên cứu này. Tỉ lệ cao chuyển dạng G:C>T:A thường thấy trong ung thư phổi, ung thư thực quản và ung thư đầu cổ. Chuyển dạng GT tại codon 157, 158, 248, 273 xảy ra trong 30% trường hợp ung thư phổi, ít hơn 10% trong các ung thư khác và được xem là hậu quả tiếp xúc với thuốc lá, như ảnh hưởng sinh ung của benzopyren(6,11). Trong nghiên cứu này xuất hiện 10/14 trường hợp đột biến chuyển dạng GT ở người có thói quen hút thuốc, uống rượu, và 3 (21,4%) trường hợp đột biến tại codon 157 đều gặp ở người hút thuốc lá nhiều. Ở bệnh nhân UTNMM có thói quen nhai trầu, các N-nitrosamin có trong thuốc lá nhai kèm theo có chứa một lượng lớn N- nitronornicotine (NNN), và hợp chất (4 methylnitrosoamino-1-3 pyridyl 1-1-butanone) (NKK) có thể gây đột biến chuyển vị G:C>A:T. NKK cũng gây đột biến chuyển dạng G:C>T:A trong thực nghiệm trên chuột, thỏ. Chúng tôi tìm thấy 3/7 bệnh nhân nhai trầu có đột biến chuyển vị G:C>A:T và 3/7 có đột biến chuyển dạng G:C>T:A. Điều này cho thấy khả năng gây đột biến p53 của N-nitrosamin trong thuốc lá nhai hay xỉa trên lâm sàng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 127 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử đã cho thấy mối liên quan giữa sự phơi nhiễm với các tác nhân sinh ung và đặc điểm của đột biến gen p53(2,4). Các kết quả phân tích dạng đột biến gen p53 trong nghiên cứu này cũng tìm thấy mối liên quan giữa phổ đột biến và tác nhân sinh ung thuốc lá. KẾT LUẬN Gen đè nén bướu p53 với nhiều chức năng quan trọng trong tế bào như dừng chu kỳ tế bào, chết tế bào theo lập trình, biệt hóa tế bào và sửa chữa DNA. Đột biến gen p53 ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình sinh ung thư vì protein p53 bị đột biến làm gia tăng tính bất ổn trong hệ gen của tế bào bướu và thúc đẩy sự tiến triển cuả bướu. Nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ khá cao đột biến gen p53 (47,7%) trong UTNMM với 81% là đột biến điểm, chủ yếu là đột biến sai nghĩa làm gia tăng biểu hiện protein p53 trong tế bào bướu. Tỉ lệ đột biến và phổ đột biến gen p53 ở nhóm bệnh nhân UTNMM này có liên quan rõ với thói quen hút thuốc lá, cho thấy thuốc lá giữ vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ung thư ở người Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bai L., Zhu W.G. (2006), “p53: structure, function and therapeutic application”, Journal of Cancer Molecules 2(4), pp. 141-153. 2. Blons H., Laurent-Puig P. (2003), “TP53 and Head and Neck Neoplasms”, Hum Mutat 21, pp. 252-253. 3. Brennan J., Boyle J.O., Koch W.M., Goodman S.N., Hruban R.H., Eby Y.J. (1995), “Associaton between cigarette smoking and mutation of the p53 gene in squamous cell carcinoma of the head and neck”, New Eng J Med 332, pp.712-717. 4. Chitra G., Chandramouli A., Chanchal C. (2010), “p53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma “, Int J Pharm Biomed Res 1(3), pp.117-121. 5. Feller L., Wood N.H., Khammissa R.A.G., Lemmer J. (2010), “Human papilloma virus- mediated carcinogenesis and HPV- associated oral and orophageal squamous cell carcinoma. Part 1: Human papilloma virus- mediated carcinogenesis”, Head and Face Medicine, 6:14. 6. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. (1994), “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clue to cancer etiology and molecular pathogenesis”, Cancer Research 54, pp.4855-4878. 7. Hsieh L.L., Wang P.F., Chen I.H., Liao C.T, Chen C.M., Chang C.J.T. (2001), “Characteristics of mutations in the p53 gene in oral squamous cell carcinoma associated with betal quid chewing and cigarette smoking in Taiwanese”, Carcinogenesis 22(9), pp.1497-1503. 8. Nguyễn Thị Hồng (2006), “Đột biến gen p53 và biểu hiện protein p53, MDM2, KI67, MMP9 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam”, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh. 9. Peltonen J.K., Helppi H.M., Paakko P., Hujanen T.T., Vahakangas K.H. (2010), “p53 in head and neck cancer: Functional consequences and environmental implications of TP53 mutation”, Head and Neck Oncology, 2:36. 10. Pfeifer G.P., Denissenko M.F., Olivier M., Tretyakova ., Hecht S.S., Hainaut P. (2002), “Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutation in smoking-associated cancer”, Oncogene 21, pp.7435-7451. 11. Soussi T. (2005), “The p53 tumor suppressor gene: From molecular biology to clinical investigation”, Annals New York Academy of Sciences, pp.121 12. Stojnev S., Golubovic M., Babovic P. (2009), “TP53 gene mutations-From guardian of the genome to oncogene”, Acta Medica Medianae 48(4), pp.59-63. 13. Thongsukai P., Boonyaphiphat P., Puttawibul W., SudhikaranW. (2010), “Specific intronic p53 mutation in esophageal squamous cell carcinoma in Southern Thailand”, World J Gastroenterol 16 (42), pp.5359-5366. 14. http:// www- p53. IARC