Kết quả nuôi cấy cụm nguyên bào sợi từ khối tế bào gốc tách từ tủy xương của bệnh nhân khớp giả thân xương dài và hoại tử chỏm xương đùi

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 465 KẾT QUẢ NUÔI CẤY CỤM NGUYÊN BÀO SỢI TỪ KHỐI TẾ BÀO GỐC TÁCH TỪ TỦY XƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN KHỚP GIẢ THÂN XƯƠNG DÀI VÀ HOẠI TỬ CHỎM XƯƠNG ĐÙI Nguyễn Thanh Bình*, Nguyễn Thị Thu Hà*, Lý Tuấn Khải* TÓM TẮT Nuôi cấy cụm nguyên bào sợi (CFU-F) là một kỹ thuật chính để đánh giá số lượng tế bào gốc (TBG) trung mô của tủy xương. Mục tiêu: Xác định số lượng CFU-F khi nuôi cấy khối TBG tách từ tủy xương của những bệnh nhân khớp giả (KG) thân xương dài và hoại tử chỏm xương đùi (HTVKCXĐ) và tương quan giữa CFU-F với một số yếu tố khác. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 47 bệnh nhân (32 bệnh nhân khớp giả (KG), 15 bệnh nhân HTVKCXĐ) được chọc hút từ xương chậu để thu 250 ml dịch tủy xương, tách chiết cô đặc thành 30 ml khối TBG và nuôi cấy CFU-F. Kết quả: Số lượng CFU-F trên 106 tế bào có nhân của khối TBG là 56,21 ± 27,57; tổng số lượng CFU-F của 30 ml khối TBG là 52,26x103 ± 46,14x103, 2 chỉ số này có mối tương quan nghịch với tuổi bệnh nhân còn chỉ số thứ 2 có mối tương quan thuận với tổng số lượng tế bào CD34(+) của 30 ml khối TBG. Kết luận: Đây là kết quả bước đầu nuôi cấy CFU-F từ khối tế bào gốc tách từ tủy xương, là giá trị tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về tế bào gốc trung mô. Từ khóa: Tế bào gốc tủy xương, khớp giả, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi ABSTRACT ENUMERATION OF COLONY FORMING UNITS-FIBROBLAST FROM BONE MARROW-DERIVED STEM CELLS IN PATIENTS WITH LONG BONE UNUNION AND NECROSIS OF THE FEMORAL HEAD Nguyen Thanh Binh, Nguyen Thi Thu Ha, Ly Tuan Khai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 485 - 469 Culturing Colony Forming Units-Fibroblast (CFU-F) is the main assay to estimate the number of bone marrow-derived mesenchymal stem cell. Objectives: Determining the number of CFU-F in bone marrow-derived stem cells of patients with long bone union and aseptic necrosis of the femoral head and the correlation between CFU-F with some other factors. Subjects and methods: 47 patients including 32 patients with long bone union and 15 patients with aseptic necrosis of the femoral head. 250 milliliters of bone marrow aspirated from iliac of each patient was seperated and concentrated to obtain 30 milliliters of bone marrow-derived cell suspension and to perform CFU-F assay. Results: The number of CFU-F/106 nucleated cells of above-mentioned cell suspension was 56.21 ± 27.57, the total number of CFU-F of 30 milliliters of this cell suspention is 52.26x103 ± 46.14x103 and both were inversely correlated with patient ages while the latter has positive correlation with the total number of CD34(+) cells of 30 milliliters of this cell suspention. * Bệnh viện Trung ương Quân Đội 108 Tác giả liên lạc: TS BS Lý Tuấn Khải ĐT: 0912.023.465 Email: lytuankhaihh108@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 466 Conclusion: These are initially results of culturing CFU-F from bone marrow-derived stem cell which could be reference values for next rese. Key words: bone marrow-derived stem cell, nonunion, aseptic necrosis of the femoral head. ĐẶT VẤN ĐỀ Tủy xương chứa hai loại tế bào gốc (TBG) chính, đó là TBG tạo máu và TBG trung mô. Các TBG trung mô (hay còn gọi là tế bào đệm của tủy xương) có khả năng biệt hóa thành nhiều loại mô của cơ thể như xương, sụn, mỡ... đang được nghiên cứu ứng dụng điều trị nhiều bệnh và đặc biệt trong điều trị tái tạo các mô và cơ quan bị bệnh hoặc bị tổn thương. TBG trung mô được xác định bằng kỹ thuật nuôi cấy cụm nguyên bào sợi [Colony forming units – Fibroblast (CFU-F)]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh rằng bằng cấy ghép các TBG tự thân lấy từ tủy xương có thể điều trị thành công các trường hợp gãy xương không liền, mất đoạn xương ở bệnh nhân khớp giả cũng như tái tạo các mô xương bị hoại tử ở bệnh nhân bị hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi (HTVKCXĐ)(2,3,4). Ở Việt Nam, chúng tôi đã phối hợp với các bác sỹ chấn thương chỉnh hình để nghiên cứu áp dụng phương pháp điều trị mới này. Trong qui trình điều trị này dịch tủy xương được thu gom sau đó tách lấy thành phần TBG và ghép vào vị trí tổn thương xương, do đó việc xác định chính xác thành phần TBG trung mô ghép cho bệnh nhân là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả điều trị. Mục tiêu nghiên cứu Xác định số lượng cụm nguyên bào sợi (CFU-F) khi nuôi cấy khối TBG tách từ tủy xương của những bệnh nhân khớp giả thân xương dài và hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi. Xác định mối tương quan giữa số lượng CFU-F với một số yếu tố khác. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 47 bệnh nhân (39 nam, 8 nữ), gồm 32 bệnh nhân khớp giả thân xương dài và 15 bệnh nhân hoại tử chỏm xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO(1)), có chỉ định ghép tế bào gốc tự thân điều trị tại Viện Chấn thương Chỉnh hình- Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 và Khoa chấn thương - Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức từ 12/2009-12/2010. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu - Tách khối TBG từ dịch hút tủy xương: mỗi bệnh nhân được chọc hút thu gom 250 ml dịch tủy xương từ hai mào chậu sau. Dùng phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng có sử dụng dung dịch Ficoll (p=1,077) để tách lấy thành phần tế bào đơn nhân (trong đó có chứa các TBG), huyền dịch khối TBG này trong 30 ml nước muối sinh lý. - Xét nghiệm tế bào máu và tủy xương: sử dụng máy đếm tế bào tự động CD1800 (Abbott - Hoa Kỳ) và phương pháp tế bào học kinh điển (nhuộm Giemsa và quan sát trên kính hiển vi quang học (Olympus-Nhật bản). - Các kỹ thuật xác định thành phần khối TBG: + Đếm số lượng tế bào nhân (TBN) bằng máy huyết học tự động CELL-DYN 1800 (ABBOT – Hoa Kỳ). + Xác định thành phần TBG tạo máu CD34+: sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang tế bào dòng chảy theo hướng dẫn của ISHAGE(8). Kết quả tính bằng tỷ lệ phần trăm và tổng số tế bào CD34+ trong 30 ml khối TBG (ΣCD34+). + Xác định TBG trung mô bằng kỹ thuật nuôi cấy cụm nguyên bào sợi CFU-F (Colony forming unit - Fibroblast) với môi trường nuôi cấy của Stem cell technologies (Canada). Kết quả được tính bằng số lượng CFU-F mọc khi nuôi cấy 106 tế bào có nhân của khối TBG [hay còn gọi là hiệu quả tạo cụm - colony forming Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 467 efficiency (CFE)] và tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG (ΣCFU-F). Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng các thuật toán thống kê với phần mềm SPSS 18.0. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 1: Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Đặc điểm Khớp giả (1) HTVKCXĐ (2) Chung p1-2 Tuổi (X±SD) 37,86±12,99 46,67±9,26 41,43±12,29 < 0,05 Nam (n,%) 24 (75%) 15 (100%) 39 (83%) Giới Nữ (n,%) 8 (25%) 0 (0%) 8 (17%) Nhận xét: Đa số bệnh nhân nghiên cứu trong độ tuổi lao động (20-60 tuổi), trong đó nhóm bệnh nhân HTVKCXĐ có tuổi trung bình cao hơn nhóm bệnh nhân khớp giả (p<0,05). Đa số bệnh nhân là nam giới (83%), trong đó bệnh nhân HTVKCXĐ đều là nam giới (100%). Bảng 2: Một số chỉ số máu ngoại vi và tủy xương của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu Chỉ số Khớp giả (1) HTVKCXĐ (2) Chung p1-2 SLTB (G/l) 66,63 ±38,29 66,11 ±37,47 66,46 ±37,62 >0,05 Tủy xương CD34+ (%) 0,61 ± 0,29 0,71 ±0,27 0,64 ±0,29 >0,05 SLHC (T/l) 4,97 ±0,46 4,29 ±0,63 4,65 ±0,61 <0,05 HST(g/l) 142,03 ±14,86 130 ±19,27 138,19 ±17,14 <0,05 SLBC (G/l) 7,23 ±1,4 9,16 ±1,99 7,82±1,84 <0,05 SLTC (G/l) 287,9 ±106,62 462,6 ±203,08 343,66 ±164,28 <0,05 Máu ngoại vi CD34+ (%) 0,035 ±0,01 0,028 ±0,018 0,033 ±0,018 >0,05 Nhận xét: Các chỉ số của máu ngoại vi như số lượng hồng cầu (SLHC), nồng độ huyết sắc tố (HST), số lượng bạch cầu (SLBC), số lượng tiểu cầu (SLTC) đều trong giới hạn của người Việt Nam trưởng thành. Số lượng tế bào (SLTB) có nhân của tủy xương của các bệnh nhân nghiên cứu đều nằm trong giới hạn bình thường. Bảng 3: Kết quả nuôi cấy CFU-F và số lượng tế bào CD34(+) từ khối TBG Chỉ số Khớp giả (1) HTVKCXĐ (2) Chung p1-2 CFE 59,5 ± 30,07 49,2 ± 20,45 56,21 ± 27,57 >0,05 CFU-F ΣCFU-F (x103) 54,58 ± 51,55 47,32 ± 32,65 52,26 ± 46,14 >0,05 % 1,18 ± 0,47 1,12 ± 0,49 1,16 ± 0,48 >0,05 CD34 (+) ΣCD34+ (x106) 14,34 ± 7,91 16,91 ± 10,79 14,15 ± 9,13 >0,05 Nhận xét: Số lượng CFU-F và số lượng tế bào CD 34+ trong khối TBG giữa nhóm bệnh nhân khớp giả và HTVKCXĐ là tương tự nhau (p>0,05). Bảng 4: Tương quan giữa CFE và tổng số lượng CFU-F trong khối TBG với một số yếu tố Yếu tố CFE ΣCFU-F Hệ số tương quan - 0,416 -0,313 Tuổi p 0,01 0,04 Hệ số tương quan 0,421 0,21 SLTB tủy xương p 0,003 0,157 Hệ số tương quan - 0,273 0,366 Tổng SLTB CD34(+) trong khối TBG p 0,073 0,014 Nhận xét: Hiệu quả tạo cụm nguyên bào sợi (CFE) và tổng số lượng CFU-F trong khối TBG tương quan nghịch mức độ vừa với tuổi của bệnh nhân, CFE tương quan thuận mức độ vừa với SLTB có nhân của tủy. Trong 30 ml khối TBG, tổng số lượng CFU-F tương quan thuận với tổng số lượng tế bào CD34+. BÀN LUẬN Nghiên cứu được tiến hành trên 47 bệnh nhân với độ tuổi trung bình là 41,43 tuổi (SD = 12,29), hầu hết là trong độ tuổi lao động; trong đó có 39 bệnh nhân nam (83%), 9 bệnh nhân nữ (17%). Về mặt tổn thương, có 32 bệnh nhân bị gãy xương không liền (khớp giả) và 15 bệnh nhân bị HTVKCXĐ, các bệnh nhân HTVKCXĐ độ I, II có độ tuổi trung bình 46,67 tuổi (SD = 9,26) cao hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân khớp giả (p<0,05) và đều là nam giới, đa số bị hoại tử chỏm xương đùi do lạm dụng rượu (70%), còn lại không rõ nguyên nhân. Các bệnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 468 nhân khớp giả được điều trị ghép TBG tủy xương tự thân được lựa chọn trong nghiên cứu theo tiêu chuẩn của Ph. Hernigou (2006)(4) đều là các khớp giả chặt (phì đại hoặc teo đét) và vô khuẩn. Còn đối với bệnh nhân HTVKCXĐ, chỉ định ghép TBG tủy xương tự thân là khi chỏm xương đùi mới bị hoại tử giai đoạn đầu (giai đoạn I, II theo ARCO)(2,3). Các bệnh nhân được điều trị theo kỹ thuật của Ph. Hernigou(3,4) và Valérie Gangji(2) theo qui trình thống nhất: chọc hút khoảng 250 ml dịch tủy xương từ xương mào chậu, tách chiết cô đặc thu được khối TBG với thể tích 30 ml. Đối với bệnh nhân khớp giả, khối TBG được tiêm qua da vào vị trí khớp giả; đối với bệnh nhân HTVKCXĐ, khối TBG được đưa vào vùng hoại tử chỏm qua đường khoan giảm áp. Trước khi lấy tủy xương, các bệnh nhân đều được làm huyết đồ và tủy đồ, kết quả bảng 3.2 cho thấy các chỉ số của máu ngoại vi như SLHC, nồng độ HST, SLBC và SLTC cũng như số lượng tế bào có nhân của tủy xương đều trong giới hạn bình thường của người Việt Nam trưởng thành. Các chỉ số SLHC, nồng độ HST của nhóm bệnh nhân HTVKCXĐ thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân khớp giả (p<0,05), có thể do tuổi cao hơn (bảng 1) và do đa số bệnh nhân HTVKCXĐ đều có lạm dụng rượu. Tuy nhiên tỷ lệ tế bào CD34(+) ở máu ngoại vi và tủy xương cũng như số lượng tế bào có nhân của tủy xương ở cả 2 nhóm bệnh nhân là tương tự nhau (p>0,05). Tỷ lệ tế bào CD34(+) ở máu ngoại vi và tủy xương ở nhóm bệnh nhân khớp giả trong nghiên cứu của chúng tôi (0,033 ± 0,018% và 0,64 ± 0,29%) tương tự như nghiên cứu của Lý Tuấn Khải và cộng sự (2008)(7). Để đánh giá số lượng TBG trung mô trong khối TBG ghép cho bệnh nhân, chúng tôi sử dụng kỹ thuật nuôi cấy cụm nguyên bào sợi. Mỗi một cụm nguyên bào sợi phát sinh từ một TBG trung mô duy nhất do đó số lượng CFU-F phản ánh số lượng TBG trung mô trong mẫu nuôi cấy. Hiện nay, CFU-F được coi là “xét nghiệm tiêu chuẩn” để đánh giá số lượng cũng như hoạt động sinh lý của TBG trung mô. Chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy CFU-F từ mẫu TBG tách từ tủy xương và đã xác định hiệu quả tạo CFU-F của 1 triệu tế bào có nhân (CFE) là 59,5 ± 30,07 ở nhóm bệnh nhân khớp giả; 49,2 ± 20,45 ở nhóm bệnh nhân HTVKCXĐ (sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê); CFE chung cho cả hai nhóm là 56,21 ± 27,57. Kết quả này cao hơn nghiên cứu của Hernigou và CS (1997)(5), CFE ở nhóm bệnh nhân khớp giả và HTVKCXĐ do rượu lần lượt là 13,0 ± 5,70 và 2,29 ± 1,73 và sự khác biệt giữa hai nhóm là có có ý nghĩa (p<0,001). Có thể do tác giả nuôi cấy trực tiếp trên dịch hút tủy xương còn chúng tôi nuôi cấy trên mẫu là khối TBG đã được cô đặc loại bớt các tế bào đã trưởng thành và giữ lại chủ yếu là thành phần tế bào đơn nhân nên nồng độ TBG trung mô sẽ nhiều hơn. Tuy nhiên trong một nghiên cứu khác(6) cho thấy CFE ở tủy xương người cho khỏe mạnh khá cao (320 ± 30). Bên cạnh CFE chúng tôi còn đánh giá tổng số lượng CFU-F có trong 30 ml khối TBG ghép cho bệnh nhân, kết quả bảng 3 cho thấy tổng số lượng CFU-F ghép cho bệnh nhân khớp giả là 54,58x103 ± 51,55x103; bệnh nhân HTVKCXĐ là 47,32x103 ± 32,65x103; sự khác biệt giữa hai nhóm là không có ý nghĩa (p>0,05). Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Ph. Hernigou và CS (2006)(4) với trung bình 51x103 tế bào tạo cụm CFU-F được ghép cho bệnh nhân. Về mối tương quan giữa CFU-F với một số yếu tố khác, kết quả ở bảng 3.4 cho thấy CFE và tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG đều có tương quan nghịch với tuổi của bệnh nhân (p<0,05); điều này phù hợp với nhận xét của Hernigou(5): tuổi càng cao thì số lượng TBG trong tủy xương càng giảm. Chúng tôi cũng nhận thấy CFE có mối tương quan thuận mức độ vừa với số lượng tế bào tủy (r=0,421; p=0,003), điều này có thể giúp dự đoán số lượng TBG trung mô thu được qua kết quả tủy đồ. Ngoài ra tổng số lượng CFU-F và tổng số lượng tế bào CD34(+) trong khối TBG có mối tương quan thuận với mức ý nghĩa p<0,05, do đó bước đầu có thể thấy hai thành phần TBG trung mô và TBG tạo máu trong tủy xương cùng tăng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 469 hoặc cùng giảm. Chúng tôi không thấy có mối tương quan giữa tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG với số lượng tế bào có nhân của tủy xương. KẾT LUẬN Nghiên cứu nuôi cấy cụm nguyên bào sợi (CFU-F) từ khối TBG tách từ tủy xương của 32 bệnh nhân khớp giả và 15 bệnh nhân HTVKCXĐ cho thấy: Số lượng CFU-F trên 106 tế bào có nhân của khối TBG (CFE) là 56,21 ± 27,57; tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG là 52,26x103 ± 46,14x103 và không có sự khác biệt giữa nhóm bệnh nhân khớp giả và bệnh nhân HTVKCXĐ (p>0,05). CFE, tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG có mối tương quan nghịch với tuổi bệnh nhân; CFE có mối tương thuận mức độ chặt với số lượng tế bào tủy xương; tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG có mối tương quan thuận với tổng số lượng tế bào CD34(+). Đây là kết quả bước đầu nuôi cấy CFU-F từ khối tế bào gốc tách từ tủy xương, là giá trị tham khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về tế bào gốc trung mô. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. ARCO (Association Research Circulation Osseous) (1992), Committee on Terminology and Classification, ARCO News: pp. 41-46. 2. Gangji V, Hauzeur JP et al. (2004), Treatment of Osteonecrosis of the Femoral Head with Implantation of Autologous Bone Marrow Cells. A Pilot Study, J Bone Joint Surg Am, 86p. 1153- 1160. 3. Hernigou P. and Beaujean F. (2002), Treatment of osteonecrosis with autologous bone marrow grafting, Clin Orthop Relat Res, 405: 14-23. 4. Hernigou Ph., et al. (2006), Percutaneous Autologous Bone Marrow Grafting for Nonunions. Surgical Technique, J Bone Joint Surg Am, 88: 322-327. 5. Hernigou Pe and Beaujean F (1997), Abnormalities in the Bone Marrow of the Iliac Crest in Patients Who Have Osteonecrosis Secondary to Corticosteroid Therapy or Alcohol Abuse, J Bone Joint Surg [Am], 79-A: 1047-1053 6. Kuznetsov AS, Mankani MH. et al. (2009), Enumeration of the colony-forming units–fibroblast from mouse and human bone marrow in normal and pathological conditions, Stem Cell Research, 2: 83-94. 7. Lý Tuấn Khải, Nguyễn Thị Thu Hà và CS (2008), Hình ảnh tế bào máu, tủy xương của bệnh nhân khớp giả thân xương chày trước khi lấy tế bào gốc để điều trị, Tạp chí Y học Việt Nam, 344: 320-324. 8. Sutherland DR., Anderson L, and Keeney M (1996), The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry, J Hematother, 5: 213-236. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 470 TỈ LỆ ĐỘT BIẾN ALEN STR QUA GIÁM ĐỊNH HUYẾT THỐNG TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP. HỒ CHÍ MINH Bửu Mật*, Đặng Thị Tố Linh*, Phạm Thị Mỹ Hạnh*, Bùi Thị Phụng* TÓM TẮT Mục tiêu: Khảo sát đột biến alen STR nhằm tránh nhầm lẫn trong biện luận kết quả liên hệ huyết thống. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các trường hợp người Việt Nam đến xét nghiệm DNA huyết thống tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. HCM từ tháng 4/2010 đến tháng 8/2011. Tất cả các trường hợp xuất hiện với sự khác biệt 1 alen STR giữa cha/con hoặc mẹ/con được ghi nhận và khảo sát về hiện tượng đột biến. Kết quả: Qua khảo sát 9586 alen STR cha và mẹ truyền cho con, chúng tôi ghi nhận có 20 trường hợp đột biến. Số trường hợp đột biến cha/con cao hơn mẹ/con. Sự đột biến xảy ra ở 12/15 (80%) loci khảo sát. Ở 4 loci THO1, D21S11, Penta D và TPOX, chúng tôi không ghi nhận đột biến. 95% đột biến xảy ra với cách biệt một step. Một trường hợp đột biến có thể có sự hiện diện của alen ẩn. Ngoài ra, chúng tôi còn ghi nhận có 1 trường hợp đột biến với 3 step và 1 trường hợp xảy ra 2 đột biến ở 2 loci khác nhau CSF1PO và D13S1358. Kết luận: Xác suất liên hệ huyết thống ở tất cả các trường hợp có đột biến đều đạt từ 99,9% đến >99,99%. Điều này cho thấy khi có 1 đột biến (hoặc rất hiếm 2 đột biến), chúng ta không thể loại bỏ được có sự liên hệ huyết thống. Từ khóa: Alen STR, đột biến, tỉ lệ đột biến. ABSTRACT MUTATION RATE OF STR ALLELES THROUGH FORENSIC STUDY AT THE BLOOD TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HCMC Buu Mat, Dang Thi To Linh, Pham Thi My Hanh, Bui Thi Phung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 470 - 473 Objective: Mutation of STR alleles has been studied aiming to avoid errors in DNA parentage assessment. Subjects and Methods: The study covers all DNA parentage testings occurred from may 4/2010 to march 8/2011; all cases happening with one inconsistency within STR allele between parents and child were studied for presence of mutation. Results: A study of 9586 paternal and maternal allele STR transferring to children, has showed 20 cases of mutation. The overall paternal mutation percentage is higher than that of maternal mutation. Mutations were observed at 12 among 15 loci studied while there are no mutation at 4 loci THO1, D21S11, Penta D and TPOX. 95% of mutation occurred with one step. One mutation assumed to be an null allele. On the other hand, we have recorded one case of mutation with 3 steps, and one case with 2 mutations at 2 different loci CSF1PO and D13S1358. Conclusion: The probability of paternity in all cases of mutations has been ranged from 99,9% to more than 99,99%; thus allowing us to conclude that we cannot exclude the presence of paternity. Keywords: STRs, mutation, mutation rate. * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. HCM Tác giả liên lạc: PGS. Bửu Mật ĐT: 0918348228 Email: mtbuu245@yahoo.com.au Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 471 ĐẶT VẤN ĐỀ Truy tìm huyết thống đã được thực hiện bắt đầu từ những năm 1920, với hệ thống kháng nguyên hồng cầu, tiếp sau đó là hệ thống kháng nguyên bạch cầu. Ngày nay, với sự hiểu biết về di truyền gen cùng với những kỹ thuật sinh học phân tử khảo sát hệ thống STR; chất lượng truy tìm huyết thống từ đó đã được nâng lên rất nhiều. Ngày nay, tỉ lệ liên hệ huyết thống cha/ con hay mẹ/con đạt được 99,9999%. Tuy nhiên, các nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh trong những trường hợp chỉ có 1 alen khác biệt giữa cha/con hoặc mẹ/con và nếu tỉ lệ liên hệ huyết thống >99% bao gồm cả alen liên hệ, thì những trường hợp này vẫn được xác nhận có liên hệ huyết thống; các nhà khoa học đã chứng minh hiện tượng trên là do có sự đột biến xảy ra trong giai đoạn phân bào giảm nhiễm (meiosis) trong quá trình hình thành phôi thai(2,3). Do đó, nghiên cứu hiện tượng đột biến là một việc làm rất quan trọng nhằm khẳng định sự liên hệ huyết thống để tránh những nhầm lẫn loại bỏ liên hệ cha/con hay mẹ/con. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Tất cả các trường hợp người Việt Nam đến xét nghiệm DNA huyết thống tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. HCM từ tháng 4/2010 đến tháng 8/2011. Phương pháp tiến hành Máu tĩnh mạch được lấy trong ống nghiệm EDTA, sau đó trích DNA với bộ kit DNA QIAGEN (Đức) hoặc GenElute Blood Genomic DNA kit (Sigma -Mỹ). Xác định lượng DNA tinh sạch với máy quang phổ Ultrospec 5300 pro (Thụy Điển). DNA tinh sạch được khuếch đại với bộ kit PowerPlex 16HS system(Error! Reference source not found.) (Promega – Mỹ) và bộ kit AmpFl STRRIdentifilerTM (Applied Biosystems - Mỹ). Tiếp theo, tiến hành điện di sản phẩm DNA sau PCR bằng máy giải trình tự gen tự động AB3130 (Applied Biosystems - Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID v.3.1. (Applied Biosystems -Mỹ). Chúng tôi chọn những trường hợp có sự khác biệt 1 alen STR giữa cha/con hoặc mẹ/con, để khảo sát đột biến. KẾT QUẢ Tiến hành khảo sát các alen STR D3S1358, TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818, D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D, vWA, D8S1179, TPOX, FGA, trên tổng số 9586 alen được truyền từ cha sang con và từ mẹ sang con, chúng tôi nhận thấy có 20 trường hợp có đột biến xảy ra, trong đó có 18 trường hợp đột biến cha/con, 2 trường hợp đột biến mẹ/con. Trong đó, số trường hợp có nhiều đột biến xảy ra ở 2 loci D18S51 và FGA (3 trường hợp), các loci khác thấp hơn, và có 4 loci TH01, D21S11, Penta D, TPOX không có trường hợp nào (Bảng 1). Bảng 1: Tỉ lệ đột biến của từng alen đột biến ở 15 loci STR Loci Số alen cha truyền cho con Số ca đột biến cha - con Tỉ lệ đột biến cha – con (%) Số alen mẹ truyền cho con Số ca đột biến mẹ - con Tỉ lệ đột biến mẹ - con (%) D3S1358 483 1 0,207 159 0 <0,628 TH01 483 0 <0,207 159 0 <0,628 D21S11 483 0 <0,207 159 1 0,628 D18S51 483 3 0,621 159 0 <0,628 Penta E 468 1 0,213 152 0 <0,657 D5S818 483 2 0,414 159 0 <0,628 D13S317 483 2 0,414 159 0 <0,628 D7S820 483 1 0,207 159 0 <0,628 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 472 Loci Số alen cha truyền cho con Số ca đột biến cha - con Tỉ lệ đột biến cha – con (%) Số alen mẹ truyền cho con Số ca đột biến mẹ - con Tỉ lệ đột biến mẹ - con (%) D16S539 483 1 0,207 159 0 <0,628 CSF1PO 483 2 0,414 159 0 <0,628 Penta D 468 0 <0,213 152 0 <0,657 vWA 483 1 0,207 159 1 0,628 D8S1179 483 1 0,207 159 0 <0,628 TPOX 483 0 <0,207 159 0 <0,628 FGA 483 3 0,621 159 0 <0,628 Ở những trường hợp có đột biến, xác suất liên hệ huyết thống bao gồm alen có đột biến thấp hơn so với những trường hợp không có đột biến nhưng đều >99,9% (Bảng 2). Bảng 2: Phân bố các alen STR đột biến cùng với xác suất liên hệ huyết thống, có tính và không tính các alen đột biến liên hệ Loci Cha Con Mẹ Xác suất liên hệ huyết thống có đột biến (%) Xác suất liên hệ huyết thống không tính đột biến (%) D3S1358 14, 16 15, 17 99,9965 99,999999489 D21S11 31.2,32.2 31,32.2 32,33.2 99,999908 99,999999954 (mẹ) D18S51 16, 16 15, 15 99,9966 99,99999803 14, 16 12, 17 99,9991 99,999994707 14, 20 15, 19 15, 16 99,9997 99,999999714 Penta E 11, 16 12, 17 99,99998002 99,999999992 D5S818 10, 12 11, 13 99,9860 99,99998788 11, 12 10, 13 99,9998 99,999999965 D13S317 11, 12 13, 13 99,9855 99,999945017 9, 11 12, 13 99,9 99,99984688 D7S820 13, 13 11, 14 99,999167 99,999998286 D16S539 10, 12 11, 11 99,99 99,999998635 CFS1PO 11, 13 10, 12 99,9980 99,999999384 11, 12 10, 13 99,9809 99,999983715 vWA * 18, 18 16, 16 99,99996207 99,999999997 16, 17 17, 20 18, 19 99,999901 99,99999912 (mẹ) D8S1179 11, 14 10, 13 10, 15 99,9434 99,999995868 FGA 23, 26.2 21, 27.2 99,9983 99,999998822 22, 24 25, 27 25, 27 99,9991 99,999996789 19, 22 21, 21 21,27 99,9996 99,999999242 (*): Có thể là alen ẩn (null allelle) BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN Trong tổng số 9586 alen cha/mẹ truyền cho con có 20 đột biến xảy ra với tỉ lệ đột biến là 0,2086%. Tỉ lệ đột biến cha/con là 0,2494% (18/7215) cao hơn so với tỉ lệ đột biến mẹ/con là 0,08435% (2/2317), điều này phù hợp với nghiên cứu nước ngoài(1). Ở khảo sát này, tỉ lệ đột biến cha/con cao hơn tỉ lệ đột biến mẹ/con là 2,95 lần. 19/20 (95%) đột biến xảy ra với sự cách biệt của một “đơn vị lập lại” (single unit repeat hay one step). Có một trường hợp đột biến ở locus vWA có khả năng có sự hiện diện alen ẩn (null allele)(4) Trong 18 trường hợp đột biến cha/con, số trường hợp đột biến xảy ra cao hơn ở 2 loci D18S51 (3/18) và FGA (3/18) so với các loci còn lại. Riêng ở các loci THO1, D21S11, Penta D, TPOX chúng tôi không nhận thấy có đột biến, khác với kết quả nghiên cứu nước ngoài, có thể do số lượng khảo sát của chúng tôi còn ít. Ở những trường hợp có đột biến, hệ số liên hệ huyết thống đều dao động trong khoảng từ 99,9% đến >99,99%. Điều này cho thấy không Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 473 loại bỏ được sự liên hệ huyết thống khi có 1 locus không phù hợp trong 15 loci được khảo sát. Chỉ có 1 trường hợp có hệ số liên hệ huyết thống 99,8% là do các alen liên hệ có tần suất cao. Tất cả những trường hợp này đều được kết luận có liên hệ huyết thống. Bảng 3: Trường hợp có đột biến ở 2 loci khác nhau Loci Cha Con Mẹ Xác suất liên hệ huyết thống có đột biến (%) CSF1PO D13S1358 11, 12 15, 17 12, 13 16, 17 10, 12 15, 17 99,9976 Ngoài ra, trong khoảng thời gian trước tháng 4/2010 (từ tháng 8/2004 đến tháng 3/2010), khi chúng tôi bắt đầu tiến hành thực hiện khảo sát DNA huyết thống với 9 loci STR, chúng tôi có gởi đến một phòng xét nghiệm huyết thống DNA ở Đức để xét nghiệm bổ sung một số trường hợp mà chúng tôi chưa xác định được, trong đó có 1 trường hợp xuất hiện 2 đột biến ở 2 loci khác nhau (Bảng 3) và 1 trường hợp đột biến 3 step (Bảng 4). Đây là những trường hợp rất hiếm gặp. Bảng 4: Trường hợp đột biến 3 step Loci Cha Con Mẹ Xác suất liên hệ huyết thống có đột biến (%) D13S317 11, 11 8, 8 8, 11 99,999999 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Annual Report (2003), AABB Apparent Mutations Observed at the 13 CODIS STR loci in the course of Paternity. 2. Brinkmann B., Klintschar M., Neuhuber F., Huehne J., Rolf B., (1998), Mutation rate in human microsatellites: influence of the structure and length of the tandem repeat, Am. J. Hum. Genet, 62: 1408-1415. 3. Dauber EM, Bar W, Klintschar M, Neuhuber F, Parson W, Glock B, Mayr WR (2003), Mutation rates at 23 different short tandem repeat, International Congress Series 1239, 565-567. 4. Butler JM (2001), Forensic DNA typing, pp 90-96, Academic Press.