BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN
Trong tổng số 9586 alen cha/mẹ truyền cho
con có 20 đột biến xảy ra với tỉ lệ đột biến là
0,2086%.
Tỉ lệ đột biến cha/con là 0,2494% (18/7215)
cao hơn so với tỉ lệ đột biến mẹ/con là 0,08435%
(2/2317), điều này phù hợp với nghiên cứu nước
ngoài(1). Ở khảo sát này, tỉ lệ đột biến cha/con
cao hơn tỉ lệ đột biến mẹ/con là 2,95 lần.
19/20 (95%) đột biến xảy ra với sự cách biệt
của một “đơn vị lập lại” (single unit repeat hay
one step).
Có một trường hợp đột biến ở locus vWA có
khả năng có sự hiện diện alen ẩn (null allele)(4)
Trong 18 trường hợp đột biến cha/con, số
trường hợp đột biến xảy ra cao hơn ở 2 loci
D18S51 (3/18) và FGA (3/18) so với các loci
còn lại.
Riêng ở các loci THO1, D21S11, Penta D,
TPOX chúng tôi không nhận thấy có đột biến,
khác với kết quả nghiên cứu nước ngoài, có thể
do số lượng khảo sát của chúng tôi còn ít.
Ở những trường hợp có đột biến, hệ số liên
hệ huyết thống đều dao động trong khoảng từ
99,9% đến >99,99%. Điều này cho thấy không
loại bỏ được sự liên hệ huyết thống khi có 1
locus không phù hợp trong 15 loci được khảo
sát. Chỉ có 1 trường hợp có hệ số liên hệ huyết
thống 99,8% là do các alen liên hệ có tần suất
cao. Tất cả những trường hợp này đều được kết
luận có liên hệ huyết thống.
9 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 07/02/2022 | Lượt xem: 102 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Kết quả nuôi cấy cụm nguyên bào sợi từ khối tế bào gốc tách từ tủy xương của bệnh nhân khớp giả thân xương dài và hoại tử chỏm xương đùi, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 465
KẾT QUẢ NUÔI CẤY CỤM NGUYÊN BÀO SỢI TỪ KHỐI TẾ BÀO GỐC
TÁCH TỪ TỦY XƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN KHỚP GIẢ THÂN XƯƠNG DÀI
VÀ HOẠI TỬ CHỎM XƯƠNG ĐÙI
Nguyễn Thanh Bình*, Nguyễn Thị Thu Hà*, Lý Tuấn Khải*
TÓM TẮT
Nuôi cấy cụm nguyên bào sợi (CFU-F) là một kỹ thuật chính để đánh giá số lượng tế bào gốc (TBG) trung
mô của tủy xương.
Mục tiêu: Xác định số lượng CFU-F khi nuôi cấy khối TBG tách từ tủy xương của những bệnh nhân
khớp giả (KG) thân xương dài và hoại tử chỏm xương đùi (HTVKCXĐ) và tương quan giữa CFU-F với
một số yếu tố khác.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 47 bệnh nhân (32 bệnh nhân khớp giả (KG), 15 bệnh nhân
HTVKCXĐ) được chọc hút từ xương chậu để thu 250 ml dịch tủy xương, tách chiết cô đặc thành 30 ml
khối TBG và nuôi cấy CFU-F.
Kết quả: Số lượng CFU-F trên 106 tế bào có nhân của khối TBG là 56,21 ± 27,57; tổng số lượng CFU-F của
30 ml khối TBG là 52,26x103 ± 46,14x103, 2 chỉ số này có mối tương quan nghịch với tuổi bệnh nhân còn chỉ số
thứ 2 có mối tương quan thuận với tổng số lượng tế bào CD34(+) của 30 ml khối TBG.
Kết luận: Đây là kết quả bước đầu nuôi cấy CFU-F từ khối tế bào gốc tách từ tủy xương, là giá trị tham
khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về tế bào gốc trung mô.
Từ khóa: Tế bào gốc tủy xương, khớp giả, hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi
ABSTRACT
ENUMERATION OF COLONY FORMING UNITS-FIBROBLAST FROM BONE MARROW-DERIVED
STEM CELLS IN PATIENTS WITH LONG BONE UNUNION AND NECROSIS
OF THE FEMORAL HEAD
Nguyen Thanh Binh, Nguyen Thi Thu Ha, Ly Tuan Khai
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 485 - 469
Culturing Colony Forming Units-Fibroblast (CFU-F) is the main assay to estimate the number of bone
marrow-derived mesenchymal stem cell.
Objectives: Determining the number of CFU-F in bone marrow-derived stem cells of patients with long
bone union and aseptic necrosis of the femoral head and the correlation between CFU-F with some other factors.
Subjects and methods: 47 patients including 32 patients with long bone union and 15 patients with
aseptic necrosis of the femoral head. 250 milliliters of bone marrow aspirated from iliac of each patient was
seperated and concentrated to obtain 30 milliliters of bone marrow-derived cell suspension and to perform CFU-F
assay.
Results: The number of CFU-F/106 nucleated cells of above-mentioned cell suspension was 56.21 ± 27.57,
the total number of CFU-F of 30 milliliters of this cell suspention is 52.26x103 ± 46.14x103 and both were
inversely correlated with patient ages while the latter has positive correlation with the total number of CD34(+)
cells of 30 milliliters of this cell suspention.
* Bệnh viện Trung ương Quân Đội 108
Tác giả liên lạc: TS BS Lý Tuấn Khải ĐT: 0912.023.465 Email: lytuankhaihh108@gmail.com
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 466
Conclusion: These are initially results of culturing CFU-F from bone marrow-derived stem cell which could
be reference values for next rese.
Key words: bone marrow-derived stem cell, nonunion, aseptic necrosis of the femoral head.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tủy xương chứa hai loại tế bào gốc (TBG)
chính, đó là TBG tạo máu và TBG trung mô. Các
TBG trung mô (hay còn gọi là tế bào đệm của
tủy xương) có khả năng biệt hóa thành nhiều
loại mô của cơ thể như xương, sụn, mỡ... đang
được nghiên cứu ứng dụng điều trị nhiều bệnh
và đặc biệt trong điều trị tái tạo các mô và cơ
quan bị bệnh hoặc bị tổn thương. TBG trung mô
được xác định bằng kỹ thuật nuôi cấy cụm
nguyên bào sợi [Colony forming units –
Fibroblast (CFU-F)]. Một số nghiên cứu trên thế
giới đã chứng minh rằng bằng cấy ghép các TBG
tự thân lấy từ tủy xương có thể điều trị thành
công các trường hợp gãy xương không liền, mất
đoạn xương ở bệnh nhân khớp giả cũng như tái
tạo các mô xương bị hoại tử ở bệnh nhân bị hoại
tử vô khuẩn chỏm xương đùi (HTVKCXĐ)(2,3,4).
Ở Việt Nam, chúng tôi đã phối hợp với các bác
sỹ chấn thương chỉnh hình để nghiên cứu áp
dụng phương pháp điều trị mới này. Trong qui
trình điều trị này dịch tủy xương được thu gom
sau đó tách lấy thành phần TBG và ghép vào vị
trí tổn thương xương, do đó việc xác định chính
xác thành phần TBG trung mô ghép cho bệnh
nhân là rất quan trọng để đảm bảo hiệu quả
điều trị.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định số lượng cụm nguyên bào sợi
(CFU-F) khi nuôi cấy khối TBG tách từ tủy
xương của những bệnh nhân khớp giả thân
xương dài và hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi.
Xác định mối tương quan giữa số lượng
CFU-F với một số yếu tố khác.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
47 bệnh nhân (39 nam, 8 nữ), gồm 32 bệnh
nhân khớp giả thân xương dài và 15 bệnh nhân
hoại tử chỏm xương đùi giai đoạn I, II (theo
ARCO(1)), có chỉ định ghép tế bào gốc tự thân
điều trị tại Viện Chấn thương Chỉnh hình- Bệnh
viện Trung ương Quân đội 108 và Khoa chấn
thương - Bệnh viện Hữu Nghị Việt Đức từ
12/2009-12/2010.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Mô tả cắt ngang
Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Tách khối TBG từ dịch hút tủy xương: mỗi
bệnh nhân được chọc hút thu gom 250 ml dịch
tủy xương từ hai mào chậu sau. Dùng phương
pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng có sử dụng
dung dịch Ficoll (p=1,077) để tách lấy thành
phần tế bào đơn nhân (trong đó có chứa các
TBG), huyền dịch khối TBG này trong 30 ml
nước muối sinh lý.
- Xét nghiệm tế bào máu và tủy xương: sử
dụng máy đếm tế bào tự động CD1800 (Abbott -
Hoa Kỳ) và phương pháp tế bào học kinh điển
(nhuộm Giemsa và quan sát trên kính hiển vi
quang học (Olympus-Nhật bản).
- Các kỹ thuật xác định thành phần khối
TBG:
+ Đếm số lượng tế bào nhân (TBN) bằng
máy huyết học tự động CELL-DYN 1800
(ABBOT – Hoa Kỳ).
+ Xác định thành phần TBG tạo máu CD34+:
sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
tế bào dòng chảy theo hướng dẫn của
ISHAGE(8). Kết quả tính bằng tỷ lệ phần trăm và
tổng số tế bào CD34+ trong 30 ml khối TBG
(ΣCD34+).
+ Xác định TBG trung mô bằng kỹ thuật
nuôi cấy cụm nguyên bào sợi CFU-F (Colony
forming unit - Fibroblast) với môi trường nuôi
cấy của Stem cell technologies (Canada). Kết quả
được tính bằng số lượng CFU-F mọc khi nuôi
cấy 106 tế bào có nhân của khối TBG [hay còn
gọi là hiệu quả tạo cụm - colony forming
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 467
efficiency (CFE)] và tổng số lượng CFU-F trong
30 ml khối TBG (ΣCFU-F).
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng các thuật toán thống
kê với phần mềm SPSS 18.0.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 1: Đặc điểm đối tượng nghiên cứu
Đặc điểm Khớp giả
(1)
HTVKCXĐ
(2)
Chung p1-2
Tuổi (X±SD) 37,86±12,99 46,67±9,26 41,43±12,29 <
0,05
Nam
(n,%)
24 (75%) 15 (100%) 39 (83%)
Giới
Nữ
(n,%)
8 (25%) 0 (0%) 8 (17%)
Nhận xét:
Đa số bệnh nhân nghiên cứu trong độ tuổi
lao động (20-60 tuổi), trong đó nhóm bệnh nhân
HTVKCXĐ có tuổi trung bình cao hơn nhóm
bệnh nhân khớp giả (p<0,05). Đa số bệnh nhân là
nam giới (83%), trong đó bệnh nhân HTVKCXĐ
đều là nam giới (100%).
Bảng 2: Một số chỉ số máu ngoại vi và tủy xương
của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu
Chỉ số Khớp giả
(1)
HTVKCXĐ
(2)
Chung p1-2
SLTB (G/l) 66,63
±38,29
66,11
±37,47
66,46
±37,62
>0,05
Tủy
xương CD34+
(%)
0,61 ± 0,29 0,71 ±0,27 0,64 ±0,29 >0,05
SLHC (T/l) 4,97 ±0,46 4,29 ±0,63 4,65 ±0,61 <0,05
HST(g/l) 142,03
±14,86
130
±19,27
138,19
±17,14
<0,05
SLBC (G/l) 7,23 ±1,4 9,16 ±1,99 7,82±1,84 <0,05
SLTC (G/l) 287,9
±106,62
462,6
±203,08
343,66
±164,28
<0,05
Máu
ngoại
vi
CD34+
(%)
0,035 ±0,01 0,028
±0,018
0,033
±0,018
>0,05
Nhận xét:
Các chỉ số của máu ngoại vi như số lượng
hồng cầu (SLHC), nồng độ huyết sắc tố (HST),
số lượng bạch cầu (SLBC), số lượng tiểu cầu
(SLTC) đều trong giới hạn của người Việt Nam
trưởng thành. Số lượng tế bào (SLTB) có nhân
của tủy xương của các bệnh nhân nghiên cứu
đều nằm trong giới hạn bình thường.
Bảng 3: Kết quả nuôi cấy CFU-F và số lượng tế bào
CD34(+) từ khối TBG
Chỉ số Khớp giả
(1)
HTVKCXĐ
(2)
Chung p1-2
CFE 59,5 ± 30,07 49,2 ±
20,45
56,21 ±
27,57
>0,05
CFU-F
ΣCFU-F
(x103)
54,58 ±
51,55
47,32 ±
32,65
52,26 ±
46,14 >0,05
% 1,18 ± 0,47 1,12 ± 0,49 1,16 ± 0,48 >0,05
CD34
(+) ΣCD34+
(x106)
14,34 ± 7,91 16,91 ± 10,79
14,15 ±
9,13 >0,05
Nhận xét:
Số lượng CFU-F và số lượng tế bào CD 34+
trong khối TBG giữa nhóm bệnh nhân khớp giả
và HTVKCXĐ là tương tự nhau (p>0,05).
Bảng 4: Tương quan giữa CFE và tổng số lượng
CFU-F trong khối TBG với một số yếu tố
Yếu tố CFE ΣCFU-F
Hệ số tương quan - 0,416 -0,313
Tuổi
p 0,01 0,04
Hệ số tương quan 0,421 0,21
SLTB tủy xương
p 0,003 0,157
Hệ số tương quan - 0,273 0,366 Tổng SLTB
CD34(+) trong khối
TBG
p 0,073 0,014
Nhận xét:
Hiệu quả tạo cụm nguyên bào sợi (CFE) và
tổng số lượng CFU-F trong khối TBG tương
quan nghịch mức độ vừa với tuổi của bệnh
nhân, CFE tương quan thuận mức độ vừa với
SLTB có nhân của tủy. Trong 30 ml khối TBG,
tổng số lượng CFU-F tương quan thuận với
tổng số lượng tế bào CD34+.
BÀN LUẬN
Nghiên cứu được tiến hành trên 47 bệnh
nhân với độ tuổi trung bình là 41,43 tuổi (SD =
12,29), hầu hết là trong độ tuổi lao động; trong
đó có 39 bệnh nhân nam (83%), 9 bệnh nhân nữ
(17%). Về mặt tổn thương, có 32 bệnh nhân bị
gãy xương không liền (khớp giả) và 15 bệnh
nhân bị HTVKCXĐ, các bệnh nhân HTVKCXĐ
độ I, II có độ tuổi trung bình 46,67 tuổi (SD =
9,26) cao hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân
khớp giả (p<0,05) và đều là nam giới, đa số bị
hoại tử chỏm xương đùi do lạm dụng rượu
(70%), còn lại không rõ nguyên nhân. Các bệnh
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 468
nhân khớp giả được điều trị ghép TBG tủy
xương tự thân được lựa chọn trong nghiên cứu
theo tiêu chuẩn của Ph. Hernigou (2006)(4) đều là
các khớp giả chặt (phì đại hoặc teo đét) và vô
khuẩn. Còn đối với bệnh nhân HTVKCXĐ, chỉ
định ghép TBG tủy xương tự thân là khi chỏm
xương đùi mới bị hoại tử giai đoạn đầu (giai
đoạn I, II theo ARCO)(2,3). Các bệnh nhân được
điều trị theo kỹ thuật của Ph. Hernigou(3,4) và
Valérie Gangji(2) theo qui trình thống nhất: chọc
hút khoảng 250 ml dịch tủy xương từ xương
mào chậu, tách chiết cô đặc thu được khối TBG
với thể tích 30 ml. Đối với bệnh nhân khớp giả,
khối TBG được tiêm qua da vào vị trí khớp giả;
đối với bệnh nhân HTVKCXĐ, khối TBG được
đưa vào vùng hoại tử chỏm qua đường khoan
giảm áp.
Trước khi lấy tủy xương, các bệnh nhân đều
được làm huyết đồ và tủy đồ, kết quả bảng 3.2
cho thấy các chỉ số của máu ngoại vi như SLHC,
nồng độ HST, SLBC và SLTC cũng như số lượng
tế bào có nhân của tủy xương đều trong giới hạn
bình thường của người Việt Nam trưởng thành.
Các chỉ số SLHC, nồng độ HST của nhóm bệnh
nhân HTVKCXĐ thấp hơn có ý nghĩa so với
nhóm bệnh nhân khớp giả (p<0,05), có thể do
tuổi cao hơn (bảng 1) và do đa số bệnh nhân
HTVKCXĐ đều có lạm dụng rượu. Tuy nhiên tỷ
lệ tế bào CD34(+) ở máu ngoại vi và tủy xương
cũng như số lượng tế bào có nhân của tủy
xương ở cả 2 nhóm bệnh nhân là tương tự nhau
(p>0,05). Tỷ lệ tế bào CD34(+) ở máu ngoại vi và
tủy xương ở nhóm bệnh nhân khớp giả trong
nghiên cứu của chúng tôi (0,033 ± 0,018% và 0,64
± 0,29%) tương tự như nghiên cứu của Lý Tuấn
Khải và cộng sự (2008)(7).
Để đánh giá số lượng TBG trung mô trong
khối TBG ghép cho bệnh nhân, chúng tôi sử
dụng kỹ thuật nuôi cấy cụm nguyên bào sợi.
Mỗi một cụm nguyên bào sợi phát sinh từ một
TBG trung mô duy nhất do đó số lượng CFU-F
phản ánh số lượng TBG trung mô trong mẫu
nuôi cấy. Hiện nay, CFU-F được coi là “xét
nghiệm tiêu chuẩn” để đánh giá số lượng cũng
như hoạt động sinh lý của TBG trung mô.
Chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy CFU-F từ mẫu
TBG tách từ tủy xương và đã xác định hiệu quả
tạo CFU-F của 1 triệu tế bào có nhân (CFE) là
59,5 ± 30,07 ở nhóm bệnh nhân khớp giả; 49,2 ±
20,45 ở nhóm bệnh nhân HTVKCXĐ (sự khác
biệt không có ý nghĩa thống kê); CFE chung cho
cả hai nhóm là 56,21 ± 27,57. Kết quả này cao
hơn nghiên cứu của Hernigou và CS (1997)(5),
CFE ở nhóm bệnh nhân khớp giả và HTVKCXĐ
do rượu lần lượt là 13,0 ± 5,70 và 2,29 ± 1,73 và
sự khác biệt giữa hai nhóm là có có ý nghĩa
(p<0,001). Có thể do tác giả nuôi cấy trực tiếp
trên dịch hút tủy xương còn chúng tôi nuôi cấy
trên mẫu là khối TBG đã được cô đặc loại bớt
các tế bào đã trưởng thành và giữ lại chủ yếu là
thành phần tế bào đơn nhân nên nồng độ TBG
trung mô sẽ nhiều hơn. Tuy nhiên trong một
nghiên cứu khác(6) cho thấy CFE ở tủy xương
người cho khỏe mạnh khá cao (320 ± 30). Bên
cạnh CFE chúng tôi còn đánh giá tổng số lượng
CFU-F có trong 30 ml khối TBG ghép cho bệnh
nhân, kết quả bảng 3 cho thấy tổng số lượng
CFU-F ghép cho bệnh nhân khớp giả là
54,58x103 ± 51,55x103; bệnh nhân HTVKCXĐ là
47,32x103 ± 32,65x103; sự khác biệt giữa hai nhóm
là không có ý nghĩa (p>0,05). Kết quả này tương
tự như nghiên cứu của Ph. Hernigou và CS
(2006)(4) với trung bình 51x103 tế bào tạo cụm
CFU-F được ghép cho bệnh nhân.
Về mối tương quan giữa CFU-F với một số
yếu tố khác, kết quả ở bảng 3.4 cho thấy CFE và
tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối TBG đều
có tương quan nghịch với tuổi của bệnh nhân
(p<0,05); điều này phù hợp với nhận xét của
Hernigou(5): tuổi càng cao thì số lượng TBG
trong tủy xương càng giảm. Chúng tôi cũng
nhận thấy CFE có mối tương quan thuận mức
độ vừa với số lượng tế bào tủy (r=0,421;
p=0,003), điều này có thể giúp dự đoán số lượng
TBG trung mô thu được qua kết quả tủy đồ.
Ngoài ra tổng số lượng CFU-F và tổng số lượng
tế bào CD34(+) trong khối TBG có mối tương
quan thuận với mức ý nghĩa p<0,05, do đó bước
đầu có thể thấy hai thành phần TBG trung mô
và TBG tạo máu trong tủy xương cùng tăng
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 469
hoặc cùng giảm. Chúng tôi không thấy có mối
tương quan giữa tổng số lượng CFU-F trong 30
ml khối TBG với số lượng tế bào có nhân của
tủy xương.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu nuôi cấy cụm nguyên bào sợi
(CFU-F) từ khối TBG tách từ tủy xương của 32
bệnh nhân khớp giả và 15 bệnh nhân
HTVKCXĐ cho thấy:
Số lượng CFU-F trên 106 tế bào có nhân của
khối TBG (CFE) là 56,21 ± 27,57; tổng số lượng
CFU-F trong 30 ml khối TBG là 52,26x103 ±
46,14x103 và không có sự khác biệt giữa nhóm
bệnh nhân khớp giả và bệnh nhân HTVKCXĐ
(p>0,05).
CFE, tổng số lượng CFU-F trong 30 ml khối
TBG có mối tương quan nghịch với tuổi bệnh
nhân; CFE có mối tương thuận mức độ chặt với
số lượng tế bào tủy xương; tổng số lượng CFU-F
trong 30 ml khối TBG có mối tương quan thuận
với tổng số lượng tế bào CD34(+).
Đây là kết quả bước đầu nuôi cấy CFU-F từ
khối tế bào gốc tách từ tủy xương, là giá trị tham
khảo cho các nghiên cứu tiếp theo về tế bào gốc
trung mô.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. ARCO (Association Research Circulation Osseous) (1992),
Committee on Terminology and Classification, ARCO News:
pp. 41-46.
2. Gangji V, Hauzeur JP et al. (2004), Treatment of Osteonecrosis of
the Femoral Head with Implantation of Autologous Bone
Marrow Cells. A Pilot Study, J Bone Joint Surg Am, 86p. 1153-
1160.
3. Hernigou P. and Beaujean F. (2002), Treatment of osteonecrosis
with autologous bone marrow grafting, Clin Orthop Relat Res,
405: 14-23.
4. Hernigou Ph., et al. (2006), Percutaneous Autologous Bone
Marrow Grafting for Nonunions. Surgical Technique, J Bone
Joint Surg Am, 88: 322-327.
5. Hernigou Pe and Beaujean F (1997), Abnormalities in the Bone
Marrow of the Iliac Crest in Patients Who Have Osteonecrosis
Secondary to Corticosteroid Therapy or Alcohol Abuse, J Bone
Joint Surg [Am], 79-A: 1047-1053
6. Kuznetsov AS, Mankani MH. et al. (2009), Enumeration of the
colony-forming units–fibroblast from mouse and human bone
marrow in normal and pathological conditions, Stem Cell
Research, 2: 83-94.
7. Lý Tuấn Khải, Nguyễn Thị Thu Hà và CS (2008), Hình ảnh tế
bào máu, tủy xương của bệnh nhân khớp giả thân xương chày
trước khi lấy tế bào gốc để điều trị, Tạp chí Y học Việt Nam, 344:
320-324.
8. Sutherland DR., Anderson L, and Keeney M (1996), The
ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow
cytometry, J Hematother, 5: 213-236.
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 470
TỈ LỆ ĐỘT BIẾN ALEN STR QUA GIÁM ĐỊNH HUYẾT THỐNG
TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC TP. HỒ CHÍ MINH
Bửu Mật*, Đặng Thị Tố Linh*, Phạm Thị Mỹ Hạnh*, Bùi Thị Phụng*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Khảo sát đột biến alen STR nhằm tránh nhầm lẫn trong biện luận kết quả liên hệ huyết thống.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các trường hợp người Việt Nam đến xét nghiệm DNA huyết
thống tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. HCM từ tháng 4/2010 đến tháng 8/2011. Tất cả các trường
hợp xuất hiện với sự khác biệt 1 alen STR giữa cha/con hoặc mẹ/con được ghi nhận và khảo sát về hiện tượng đột
biến.
Kết quả: Qua khảo sát 9586 alen STR cha và mẹ truyền cho con, chúng tôi ghi nhận có 20 trường hợp đột
biến. Số trường hợp đột biến cha/con cao hơn mẹ/con. Sự đột biến xảy ra ở 12/15 (80%) loci khảo sát. Ở 4 loci
THO1, D21S11, Penta D và TPOX, chúng tôi không ghi nhận đột biến. 95% đột biến xảy ra với cách biệt một
step. Một trường hợp đột biến có thể có sự hiện diện của alen ẩn. Ngoài ra, chúng tôi còn ghi nhận có 1 trường
hợp đột biến với 3 step và 1 trường hợp xảy ra 2 đột biến ở 2 loci khác nhau CSF1PO và D13S1358.
Kết luận: Xác suất liên hệ huyết thống ở tất cả các trường hợp có đột biến đều đạt từ 99,9% đến >99,99%.
Điều này cho thấy khi có 1 đột biến (hoặc rất hiếm 2 đột biến), chúng ta không thể loại bỏ được có sự liên hệ huyết
thống.
Từ khóa: Alen STR, đột biến, tỉ lệ đột biến.
ABSTRACT
MUTATION RATE OF STR ALLELES THROUGH FORENSIC STUDY AT THE BLOOD
TRANSFUSION HEMATOLOGY HOSPITAL HCMC
Buu Mat, Dang Thi To Linh, Pham Thi My Hanh, Bui Thi Phung
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 470 - 473
Objective: Mutation of STR alleles has been studied aiming to avoid errors in DNA parentage assessment.
Subjects and Methods: The study covers all DNA parentage testings occurred from may 4/2010 to march
8/2011; all cases happening with one inconsistency within STR allele between parents and child were studied for
presence of mutation.
Results: A study of 9586 paternal and maternal allele STR transferring to children, has showed 20 cases of
mutation. The overall paternal mutation percentage is higher than that of maternal mutation. Mutations were
observed at 12 among 15 loci studied while there are no mutation at 4 loci THO1, D21S11, Penta D and TPOX.
95% of mutation occurred with one step. One mutation assumed to be an null allele. On the other hand, we have
recorded one case of mutation with 3 steps, and one case with 2 mutations at 2 different loci CSF1PO and
D13S1358.
Conclusion: The probability of paternity in all cases of mutations has been ranged from 99,9% to more than
99,99%; thus allowing us to conclude that we cannot exclude the presence of paternity.
Keywords: STRs, mutation, mutation rate.
* Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP. HCM
Tác giả liên lạc: PGS. Bửu Mật ĐT: 0918348228 Email: mtbuu245@yahoo.com.au
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 471
ĐẶT VẤN ĐỀ
Truy tìm huyết thống đã được thực hiện bắt
đầu từ những năm 1920, với hệ thống kháng
nguyên hồng cầu, tiếp sau đó là hệ thống kháng
nguyên bạch cầu. Ngày nay, với sự hiểu biết về
di truyền gen cùng với những kỹ thuật sinh học
phân tử khảo sát hệ thống STR; chất lượng truy
tìm huyết thống từ đó đã được nâng lên rất
nhiều. Ngày nay, tỉ lệ liên hệ huyết thống cha/
con hay mẹ/con đạt được 99,9999%.
Tuy nhiên, các nhà khoa học trên thế giới đã
chứng minh trong những trường hợp chỉ có 1
alen khác biệt giữa cha/con hoặc mẹ/con và nếu
tỉ lệ liên hệ huyết thống >99% bao gồm cả alen
liên hệ, thì những trường hợp này vẫn được xác
nhận có liên hệ huyết thống; các nhà khoa học
đã chứng minh hiện tượng trên là do có sự đột
biến xảy ra trong giai đoạn phân bào giảm
nhiễm (meiosis) trong quá trình hình thành phôi
thai(2,3). Do đó, nghiên cứu hiện tượng đột biến
là một việc làm rất quan trọng nhằm khẳng định
sự liên hệ huyết thống để tránh những nhầm lẫn
loại bỏ liên hệ cha/con hay mẹ/con.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Tất cả các trường hợp người Việt Nam đến
xét nghiệm DNA huyết thống tại bệnh viện
Truyền Máu Huyết Học TP. HCM từ tháng
4/2010 đến tháng 8/2011.
Phương pháp tiến hành
Máu tĩnh mạch được lấy trong ống
nghiệm EDTA, sau đó trích DNA với bộ kit
DNA QIAGEN (Đức) hoặc GenElute Blood
Genomic DNA kit (Sigma -Mỹ). Xác định
lượng DNA tinh sạch với máy quang phổ
Ultrospec 5300 pro (Thụy Điển). DNA tinh
sạch được khuếch đại với bộ kit PowerPlex
16HS system(Error! Reference source not found.) (Promega
– Mỹ) và bộ kit AmpFl STRRIdentifilerTM
(Applied Biosystems - Mỹ). Tiếp theo, tiến
hành điện di sản phẩm DNA sau PCR bằng
máy giải trình tự gen tự động AB3130
(Applied Biosystems - Mỹ). Kết quả được
phân tích bằng phần mềm GeneMapper ID
v.3.1. (Applied Biosystems -Mỹ).
Chúng tôi chọn những trường hợp có sự
khác biệt 1 alen STR giữa cha/con hoặc mẹ/con,
để khảo sát đột biến.
KẾT QUẢ
Tiến hành khảo sát các alen STR D3S1358,
TH01, D21S11, D18S51, Penta E, D5S818,
D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, Penta D,
vWA, D8S1179, TPOX, FGA, trên tổng số 9586
alen được truyền từ cha sang con và từ mẹ
sang con, chúng tôi nhận thấy có 20 trường
hợp có đột biến xảy ra, trong đó có 18 trường
hợp đột biến cha/con, 2 trường hợp đột biến
mẹ/con. Trong đó, số trường hợp có nhiều đột
biến xảy ra ở 2 loci D18S51 và FGA (3 trường
hợp), các loci khác thấp hơn, và có 4 loci
TH01, D21S11, Penta D, TPOX không có
trường hợp nào (Bảng 1).
Bảng 1: Tỉ lệ đột biến của từng alen đột biến ở 15 loci STR
Loci Số alen cha
truyền cho con
Số ca đột biến
cha - con
Tỉ lệ đột biến
cha – con (%)
Số alen mẹ
truyền cho con
Số ca đột biến
mẹ - con
Tỉ lệ đột biến
mẹ - con (%)
D3S1358 483 1 0,207 159 0 <0,628
TH01 483 0 <0,207 159 0 <0,628
D21S11 483 0 <0,207 159 1 0,628
D18S51 483 3 0,621 159 0 <0,628
Penta E 468 1 0,213 152 0 <0,657
D5S818 483 2 0,414 159 0 <0,628
D13S317 483 2 0,414 159 0 <0,628
D7S820 483 1 0,207 159 0 <0,628
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 472
Loci Số alen cha
truyền cho con
Số ca đột biến
cha - con
Tỉ lệ đột biến
cha – con (%)
Số alen mẹ
truyền cho con
Số ca đột biến
mẹ - con
Tỉ lệ đột biến
mẹ - con (%)
D16S539 483 1 0,207 159 0 <0,628
CSF1PO 483 2 0,414 159 0 <0,628
Penta D 468 0 <0,213 152 0 <0,657
vWA 483 1 0,207 159 1 0,628
D8S1179 483 1 0,207 159 0 <0,628
TPOX 483 0 <0,207 159 0 <0,628
FGA 483 3 0,621 159 0 <0,628
Ở những trường hợp có đột biến, xác suất
liên hệ huyết thống bao gồm alen có đột biến
thấp hơn so với những trường hợp không có đột
biến nhưng đều >99,9% (Bảng 2).
Bảng 2: Phân bố các alen STR đột biến cùng với xác suất liên hệ huyết thống, có tính và không tính các alen đột
biến liên hệ
Loci Cha Con Mẹ Xác suất liên hệ huyết thống
có đột biến (%)
Xác suất liên hệ huyết thống
không tính đột biến (%)
D3S1358 14, 16 15, 17 99,9965 99,999999489
D21S11 31.2,32.2 31,32.2 32,33.2 99,999908 99,999999954
(mẹ)
D18S51 16, 16 15, 15 99,9966 99,99999803
14, 16 12, 17 99,9991 99,999994707
14, 20 15, 19 15, 16 99,9997 99,999999714
Penta E 11, 16 12, 17 99,99998002 99,999999992
D5S818 10, 12 11, 13 99,9860 99,99998788
11, 12 10, 13 99,9998 99,999999965
D13S317 11, 12 13, 13 99,9855 99,999945017
9, 11 12, 13 99,9 99,99984688
D7S820 13, 13 11, 14 99,999167 99,999998286
D16S539 10, 12 11, 11 99,99 99,999998635
CFS1PO 11, 13 10, 12 99,9980 99,999999384
11, 12 10, 13 99,9809 99,999983715
vWA * 18, 18 16, 16 99,99996207 99,999999997
16, 17 17, 20 18, 19 99,999901 99,99999912 (mẹ)
D8S1179 11, 14 10, 13 10, 15 99,9434 99,999995868
FGA 23, 26.2 21, 27.2 99,9983 99,999998822
22, 24 25, 27 25, 27 99,9991 99,999996789
19, 22 21, 21 21,27 99,9996 99,999999242
(*): Có thể là alen ẩn (null allelle)
BÀN LUẬN VÀ KẾT LUẬN
Trong tổng số 9586 alen cha/mẹ truyền cho
con có 20 đột biến xảy ra với tỉ lệ đột biến là
0,2086%.
Tỉ lệ đột biến cha/con là 0,2494% (18/7215)
cao hơn so với tỉ lệ đột biến mẹ/con là 0,08435%
(2/2317), điều này phù hợp với nghiên cứu nước
ngoài(1). Ở khảo sát này, tỉ lệ đột biến cha/con
cao hơn tỉ lệ đột biến mẹ/con là 2,95 lần.
19/20 (95%) đột biến xảy ra với sự cách biệt
của một “đơn vị lập lại” (single unit repeat hay
one step).
Có một trường hợp đột biến ở locus vWA có
khả năng có sự hiện diện alen ẩn (null allele)(4)
Trong 18 trường hợp đột biến cha/con, số
trường hợp đột biến xảy ra cao hơn ở 2 loci
D18S51 (3/18) và FGA (3/18) so với các loci
còn lại.
Riêng ở các loci THO1, D21S11, Penta D,
TPOX chúng tôi không nhận thấy có đột biến,
khác với kết quả nghiên cứu nước ngoài, có thể
do số lượng khảo sát của chúng tôi còn ít.
Ở những trường hợp có đột biến, hệ số liên
hệ huyết thống đều dao động trong khoảng từ
99,9% đến >99,99%. Điều này cho thấy không
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 473
loại bỏ được sự liên hệ huyết thống khi có 1
locus không phù hợp trong 15 loci được khảo
sát. Chỉ có 1 trường hợp có hệ số liên hệ huyết
thống 99,8% là do các alen liên hệ có tần suất
cao. Tất cả những trường hợp này đều được kết
luận có liên hệ huyết thống.
Bảng 3: Trường hợp có đột biến ở 2 loci khác nhau
Loci Cha Con Mẹ Xác suất liên hệ
huyết thống có đột
biến (%)
CSF1PO
D13S1358
11, 12
15, 17
12, 13
16, 17
10, 12
15, 17
99,9976
Ngoài ra, trong khoảng thời gian trước
tháng 4/2010 (từ tháng 8/2004 đến tháng 3/2010),
khi chúng tôi bắt đầu tiến hành thực hiện khảo
sát DNA huyết thống với 9 loci STR, chúng tôi
có gởi đến một phòng xét nghiệm huyết thống
DNA ở Đức để xét nghiệm bổ sung một số
trường hợp mà chúng tôi chưa xác định được,
trong đó có 1 trường hợp xuất hiện 2 đột biến ở
2 loci khác nhau (Bảng 3) và 1 trường hợp đột
biến 3 step (Bảng 4). Đây là những trường hợp
rất hiếm gặp.
Bảng 4: Trường hợp đột biến 3 step
Loci Cha Con Mẹ Xác suất liên hệ huyết
thống có đột biến (%)
D13S317 11, 11 8, 8 8, 11 99,999999
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Annual Report (2003), AABB Apparent Mutations Observed at
the 13 CODIS STR loci in the course of Paternity.
2. Brinkmann B., Klintschar M., Neuhuber F., Huehne J., Rolf B.,
(1998), Mutation rate in human microsatellites: influence of the
structure and length of the tandem repeat, Am. J. Hum. Genet,
62: 1408-1415.
3. Dauber EM, Bar W, Klintschar M, Neuhuber F, Parson W, Glock
B, Mayr WR (2003), Mutation rates at 23 different short tandem
repeat, International Congress Series 1239, 565-567.
4. Butler JM (2001), Forensic DNA typing, pp 90-96, Academic
Press.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
ket_qua_nuoi_cay_cum_nguyen_bao_soi_tu_khoi_te_bao_goc_tach.pdf