Kết quả xác định helicobacter pylori bằng kỹ thuật Real-Time PCR, nhuộm soi và test urease ở bệnh nhân loét dạ dày tá tràng tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Bắc Giang

nghiên cứu khoa học Tạp chí Tài liệu Hội nghị Khoa học Nội khoa Toàn quốc lần IX nội khoa Việt nam 349 I. đẶT VẤN đỀ Loét dạ dày tá tràng (DDTT) là bệnh hay gặp. Nhiều công trình nghiên cứu đã khẳng định HP là một trong những nguyên nhân gây loét DDTT. Hiện nay tại Việt Nam phần lớn BN có dấu hiệu về bệnh lý DDTT đều được nội soi chẩn đoán và xét nghiệm xác định H. pylori. Các kỹ thuật xác định H. pylori thường dùng như: test urease nhanh, nhuộm soi tìm H. pylori tại mảnh sinh thiết, nuôi cấy, PCR và real-time PCR... Khả năng phát hiện H. pylori và tính ưu việt của mỗi kỹ thuật có khác nhau [1]. Chính vì vậy đánh giá, so sánh kết quả các kỹ thuật real-time PCR, test urease, nhuộm soi tìm H. pylori tại mảnh sinh thiết dạ dày có ý nghĩa khoa học, cần thiết trong thực tiễn hiện nay. II. đỐI TƯỢNG Và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. đối tượng nghiên cứu - Gồm 190 BN loét DDTT được chẩn đoán bằng nội soi tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 5 năm 2014: trong đó 144 BN không sử dụng kháng sinh (dưới 4 tuần) trước nội soi và 46 BN có sử dụng kháng sinh (dưới 4 tuần) trước nội soi. - Tiêu chuẩn loại trừ: BN không lấy đủ số mảnh sinh thiết hoặc mảnh sinh thiết không đủ tiêu chuẩn cho các xét nghiệm (XN). Loét DDTT do các nguyên nhân khác xác định được như do hóa chất, ung thư thể loét. KẾT QUẢ XÁC đỊNH HeLICOBACTeR PYLORI BẰNG KỸ THUẬT ReAL-TIMe PCR, NHUỘM sOI Và TesT UReAse Ở BỆNH NHÂN LOÉT DẠ DàY TÁ TRàNG TẠI BỆNH VIỆN đA KHOA TỈNH BẮC GIANG Đỗ quốc tuấn* * Trưởng khoa Vi sinh, Bệnh viện Đa khoa tỉnh Bắc Giang TÓM TẮT Xác định H. pylori tại dạ dày được thực hiện bằng nhiều kỹ thuật và khả năng phát hiện H. pylori của mỗi kỹ thuật có khác nhau. Hiện nay tại Việt Nam thường dùng 3 kỹ thuật là: nhuộm soi tìm H. pylori tại mảnh sinh thiết dạ dày, test urease nhanh và kỹ thuật real-time PCR. Vì vậy nhận xét, so sánh, đánh giá kết quả xác định H. pylori của 3 kỹ thuật trên là hết sức cần thiết. đối tượng, phương pháp: Nghiên cứu cắt ngang 190 bệnh nhân (BN) loét dạ dày tá tràng (DDTT) được chẩn đoán bằng nội soi, xác định H. pylori tại mảnh sinh thiết hang vị dạ dày bằng 3 kỹ thuật: Áp lam - nhuộm Giemsa soi tìm H. pylori, test urease và real-time PCR. Phân tích kết quả bằng phần mềm SPSS 16.0. Kết quả: Tỷ lệ Dương tính của các kỹ thuật ở BN không và có sử dụng kháng sinh <4 tuần trước nội soi (kết quả theo thứ tự): Real-time PCR: 94,4% và 69,6%; nhuộm soi: 92,4% và 47,8%; test urease: 79,2% và 43,5%. Mức phù hợp của các kỹ thuật với nhau: Real-time PCR với nhuộm soi: 93,7% k = 0,49 và 73,9% k = 0,48. Real-time PCR với test urease: 83,3% k = 0,30 và 69,5%; k = 0,42. Test urease với nhuộm soi: 86,1%; k = 0,42 và 91,3%; k = 0,82. Kết luận: H. pylori (+) bằng real-time PCR cao nhất: 94,4%; Tỷ lệ nhuộm soi H. pylori (+): 92,4%; Test urease có tỷ lệ Dương tính thấp nhất: 79,2%. Real-time PCR xác định H. pylori ở BN có sử dụng kháng sinh trước khi nội soi chiếm: 69,6%. Có sự phù hợp mức vừa giữa nhuộm soi, test urease với real-time PCR. nghiên cứu khoa học Tạp chí nội khoa Việt nam Tài liệu Hội nghị Khoa học Nội khoa Toàn quốc lần IX350 2. Phương pháp nghiên cứu - Vị trí, số lượng mảnh sinh thiết: Lấy 03 mảnh sinh thiết tại hang vị cho 3 kỹ thuật: nhuộm soi, test urease, real-time PCR [2]. - Kỹ thuật nhuộm soi mảnh sinh thiết: Dùng dung dịch nhuộm Giemsa 1/5 của Merck (Đức) trong 15 phút rồi rửa dưới vòi nước sạch, để khô tự nhiên và soi dưới vật kính dầu (độ phóng đại 1000 lần). Tìm các vi khuẩn có hình dạng cong hoặc xoắn, bắt màu tím, kích thước 0,3 - 1 x 1,5 - 5 µm. - Test urease: Dùng hóa chất pha chế test urease của Merck (Đức), pha chế theo quy trình của nhà sản xuất. Để test ở nhiệt độ phòng làm việc, dùng kim tiêm vô trùng gắp mảnh sinh thiết và nhúng chìm vào giữa test. Ghi các thời điểm đọc kết quả sau 30 phút; 60 phút; 3 giờ. Kết quả test urease (+) khi có màu hồng xuất hiện xung quanh mảnh sinh thiết và lan dần ra môi trường. Sau 3 giờ không thấy xuất hiện màu hồng thì kết quả âm tính [3]. - Real-time PCR H. pylori: Dùng kit real-time PCR - tiêu chuẩn WHO-GMP, ISO 9001-2008, công ty Việt Á cung cấp gồm: đoạn mồi 115 bp từ đoạn gen 16S rRNA. Tách chiết mẫu, chạy real- time PCR và đọc kết quả theo quy trình của nhà sản xuất [4]. - Xử lý số liệu: Thống kê bằng phần mềm SPSS 16.0; khác biệt có ý nghĩa khi p<0,05; tính độ phù hợp quan sát (OA) và giá trị Kappa; so sánh độ phù hợp của các kỹ thuật với nhau dựa vào giá trị Kappa (0,0 - 0,2 = phù hợp rất ít; 0,2 - 0,4 = phù hợp nhẹ; 0,4 - 0,6 = phù hợp trung bình; 0,6 - 0,8 = phù hợp chặt chẽ; 0,8 - 1,0 = phù hợp hầu như hoàn toàn). III. KẾT QUẢ Và BàN LUẬN 1. Tỷ lệ phát hiện H. pylori của các kỹ thuật Bảng 1. Tỷ lệ dương tính với H. pylori của từng kỹ thuật sử dụng Ks BN không sử dụng kháng sinh BN có sử dụng kháng sinh n p Kỹ thuật xét nghiệm Âm tính Dương tính Âm tính Dương tính n % n % n % n % Real-time PCR 8 5,6 136 94,4 14 30,4 32 69,6 190 0,000 Nhuộm soi 11 7,6 133 92,4 24 52,2 22 47,8 190 0,000 Test urease 30 20,8 114 79,2 26 56,5 20 43,5 190 0,000 Tỷ lệ nhiễm H. pylori ở BN loét DDTT đã được nhiều tác giả nghiên cứu và xác định bằng các kỹ thuật khác nhau. Tùy thuộc vị trí địa lý, thời điểm nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng điều tra tỷ lệ nhiễm H. pylori ở BN loét DDTT dao động từ 80 - 100% [5],[6]. Kỹ thuật real-time PCR H. pylori có độ nhạy rất cao, trong 5 µl mẫu phản ứng có 1 copy DNA đặc hiệu của vi khuẩn (tương đương 101 vi khuẩn/ 1 mảnh sinh thiết), sau 40 chu kỳ nhiệt sẽ có 239 copy (hiệu suất bắt cặp là 95 - 105%), phát hiện được qua CCD camera. Nhiều tác giả sử dụng real-time PCR xác định H. pylori tại mảnh sinh thiết dạ dày cho kết quả độ nhạy rất cao, thậm chí, có tác giả sử dụng real-time PCR phát hiện H. pylori trong phân cũng cho kết quả độ nhạy rất cao (> 90%) [7],[8],[9]. Độ đặc hiệu của real-time PCR H. pylori dựa trên độ đặc hiệu của đoạn mồi sử dụng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi có sử dụng kit với đặc điểm cấu tạo mồi và probe đáp ứng đầy đủ các quy định chung về thiết kế mồi cho real-time PCR và cho xác định H. pylori [4],[10],[11],[12]. Nghiên cứu của một số tác giả có sử dụng các đoạn mồi tương tự tại 16S rRNA cho kết quả độ đặc hiệu cao như Kobayashi (2002) [6] cho độ đặc hiệu 100%. Chisholm (2001) [8], sử dụng đoạn gen 16S rRNA 80 bp (ngắn hơn mồi trong nghiên cứu này) cho độ đặc hiệu 99,0%. nghiên cứu khoa học Tạp chí Tài liệu Hội nghị Khoa học Nội khoa Toàn quốc lần IX nội khoa Việt nam 351 Kỹ thuật áp mảnh sinh thiết trên lam kính và nhuộm soi rất đơn giản, có thể thực hiện được tại nhiều labo Vi sinh. Trong 144 mẫu sinh thiết từ BN loét DDTT chưa dùng kháng sinh <4 tuần trước nội soi, có 92,4% Dương tính với H. pylori. Tỷ lệ này thấp hơn so với kỹ thuật real-time PCR (p<0,01), tuy nhiên, kỹ thuật có độ nhạy cao hơn test urease với 79,2% (p < 0,01). Mặt khác, kỹ thuật này còn phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn, số lượng vi khuẩn và kỹ thuật nhuộm soi. Test urease là kỹ thuật đơn giản cho xác định H. pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày. Nhiều nghiên cứu xác định độ nhạy và đặc hiệu của test urease trong xác định H. pylori có giá trị cao như: Akanda (2011) [7]: độ nhạy 96,6%; đặc hiệu 97,7%. Tuy nhiên, theo Calvet (2013) [8], độ nhạy của test urease phụ thuộc vào mật độ H. pylori ở mảnh sinh thiết. Trong nghiên cứu của chúng tôi, tỷ lệ Dương tính của test urease là 79,2%; thấp hơn tỷ lệ Dương tính của real-time PCR và nhuộm soi (p < 0,01). test urease dựa vào đặc tính sinh urease ngoại bào rất mạnh của H. pylori. Tuy nhiên, các đặc tính của H. pylori ứng dụng để nhận diện vi khuẩn của kỹ thuật nhuộm soi và test urease có thể thay đổi khi vi khuẩn có tiếp xúc với kháng sinh (OA của real-time PCR với nhuộm soi và test urease thay đổi từ 93,7% và 83,3% ở BN chưa dùng kháng sinh trước nội soi xuống còn 73,9% và 69,5% ở BN có sử dụng kháng sinh < 4 tuần trước nội soi). Mặt khác, kỹ thuật này còn phụ thuộc vào mật độ vi khuẩn (kỹ thuật nhuộm soi), số lượng vi khuẩn và thời gian từ khi lấy mảnh sinh thiết đến khi thực hiện xét nghiệm (kỹ thuật test urease). 2. so sánh kết quả phát hiện H. pylori của 3 kỹ thuật trên BN không sử dụng kháng sinh Bảng 2. So sánh kết quả phát hiện H. pylori của 3 kỹ thuật trên BN không sử dụng kháng sinh Các chỉ số so sánh OA % Kappa p So sánh giữa các kỹ thuật Real-time PCR và nhuộm soi 135/144 93,7 0,49 0,000 Real-time PCR và test urease 120/144 83,3 0,30 0,000 Nhuộm soi và test urease 124/144 86,1 0,42 0,000 Các BN không sử dụng kháng sinh < 4 tuần trước nội soi thì tỷ lệ H. pylori (+) của real-time PCR cao nhất (94,4%); tỷ lệ H. pylori (+) của nhuộm soi (92,4%) thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,001); tỷ lệ Dương tính của test urease thấp nhất: 79,2% (p< 0,001). Kết quả nghiên cứu này cao hơn một số tác giả khác, tuy nhiên, đối tượng nghiên cứu ở đây là BN loét DDTT. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với nhận định của Tạ Long và Mergraud [5],[6]: tỷ lệ nhiễm H. pylori ở BN loét DDTT là 80 - 100%. 3. so sánh kết quả phát hiện H. pylori của 3 kỹ thuật trên BN có sử dụng kháng sinh Bảng 3. So sánh kết quả phát hiện H. pylori của 3 kỹ thuật trên BN có sử dụng kháng sinh Các chỉ số so sánh OA % Kappa p So sánh giữa các kỹ thuật Real-time PCR và nhuộm soi 34/46 73,9 0,48 0,000 Real-time PCR và test urease 32/46 69,5 0,42 0,000 Nhuộm soi và test urease 42/46 91,3 0,82 0,000 Các tác giả nghiên cứu về giá trị của các XN phát hiện trực tiếp H. pylori, khi chọn đối tượng nghiên cứu đều loại trừ BN đã có sử dụng kháng sinh dưới 4 tuần trước khi nội soi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn cả BN đã sử dụng kháng sinh dưới 4 tuần trước khi nội soi với mục đích đánh giá, so sánh tỷ lệ và khả năng phát hiện được H. pylori của các kỹ thuật khi BN có sử dụng kháng sinh điều trị dưới 4 tuần nhưng không đỡ, vì vậy BN đi khám và nội soi DDTT. nghiên cứu khoa học Tạp chí nội khoa Việt nam Tài liệu Hội nghị Khoa học Nội khoa Toàn quốc lần IX352 Kết quả ở bảng 1 cho thấy: nếu so sánh trong cùng một kỹ thuật giữa hai đối tượng không và có sử dụng kháng sinh < 4 tuần trước nội soi thì tỷ lệ H. pylori (+) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Như vậy, trên BN có sử dụng kháng sinh < 4 tuần trước nội soi thì tỷ lệ H. pylori (+) của các kỹ thuật đều giảm có ý nghĩa so với BN không sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, khả năng phát hiện H. pylori của real-time PCR là cao nhất (69,6%), nhuộm soi và test urease có khả năng phát hiện thấp hơn nhiều (47,8% và 43,5%) với p<0,001. Theo Tạ Long [5], khi H. pylori có tiếp xúc với kháng sinh, vi khuẩn sẽ thay đổi hình dạng sang hình cầu (nhuộm soi không thấy hình dạng đặc trưng) và các quá trình chuyển hóa bị ngừng lại hoặc rất yếu (test urease không Dương tính do không có enzym urease). Tuy nhiên, có thể xác định được H. pylori bằng real-time PCR thông qua các gen đặc hiệu. Đây là ưu điểm của real-time PCR so với kỹ thuật nhuộm soi và test urease trong xác định H. pylori ở BN đã sử dụng kháng sinh <4 tuần trước nội soi. Vì vậy nếu BN đã dùng kháng sinh < 4 tuần trước nội soi thì khi XN tìm H. pylori tại mảnh sinh thiết, nên chỉ định sử dụng kỹ thuật là real-time PCR để đảm bảo độ nhạy của chẩn đoán. Trong ba kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu, mỗi kỹ thuật đều dựa trên nguyên lý khác nhau để xác định H. pylori: Với real-time PCR dựa vào đoạn gen đặc hiệu của vi khuẩn; kỹ thuật nhuộm soi dựa vào hình dạng đặc biệt và vị trí ký sinh của vi khuẩn, điều này cho thấy real-time PCR xác định H. pylori tại mảnh sinh thiết dạ dày là tiêu chuẩn vàng, kỹ thuật đảm bảo độ ổn định ngay cả khi BN có sử dụng kháng sinh <4 tuần trước khi XN. IV. KẾT LUẬN Tỷ lệ Dương tính với H. pylori ở BN loét DDTT không sử dụng kháng sinh của Real-time PCR: 94,4%; nhuộm soi: 92,4%; test urease: 79,2%. Tỷ lệ Dương tính với H. pylori ở BN loét DDTT có sử dụng kháng sinh của Real-time PCR: 69,6%; nhuộm soi: 47,8%; test urease: 43,5%. Real-time PCR xác định H. pylori tại mảnh sinh thiết dạ dày có thể ứng dụng tốt trên BN có sử dụng kháng sinh <4 tuần trước khi nội soi. Mức phù hợp của nhuộm soi và test urease với real- time PCR ở mức độ vừa. TàI LIỆU THAM KHẢO 1. Madhu Sharma, Preeti Mehta, Prakriti Vohra (2012). Comperative Evanluation of Diffrent Diagnostic Techniques Available for Diagnosis of H. pylori. International Journal of Scientific and Research Publications, Volume 2, Issue 12. 2. Quách Trọng Đức, Trần Kiều Miên (2007). Vị trí sinh thết dạ dày thích hợp trong chẩn đoán nhiễm H. pylori bằng thử nghệm Urease nhanh. Y học TP Hồ Chí minh. Tập 11, Phụ bản số 1. 3. Phan Quốc Hoàn (2013). Công thức, cách sản xuất urease test để chẩn đoán H. pylori. Tạp chí tiêu hóa, Số 30. 4. Công ty Việt Á. Hướng dẫn sử dụng Crush tool kit, IVA pDNA Extraction kit, LightPower iVAHP rPCR Plus Kit, LightPower iVAHP ClaR rPCR Plus Kit. 5. Tạ Long (2003). Bệnh lý dạ dày tá tràng và vi khuẩn Helicobacter pylori - NXB Y học, Hà Nội. 6. Francis Megraud, Philippe Lehours (2007). Helicobacter pylori Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing. Clinical Microbio-logy Reviews, Apr. 2007, p. 280–322. Vol. 20, No. 2. 7. W. G. MacKay, C. L. Williams, M. McMillan et al (2003). Evaluation of Protocol Using Gene Capture and PCR for Detection of Helicobacter pylori DNA in feces. Journal oF clinical microbiology, p. 4589–4593 Vol. 41, No. 10. 8. Bio-rad Laboratory, Inc. All rights reserved. Real-time PCR Application Guide, 2006. 9. Yi Wei Tang, Charles W. Stratton (2006). Advaced techniques in Diagnostic Microbiology. Springer press, ISBN, 10,0-387-29741-3.. 10. Nguyễn Lâm Tùng, Tomohisha và CS (2010). Nhiễm khuẩn H. pylori và bệnh dạ dày tá tràng ở Việt Nam: nghiên cứu cắt ngang ở bệnh viện. Tạp chí tiêu hóa Việt Nam, Tập V, Số 20, trang 1377-1379. nghiên cứu khoa học Tạp chí Tài liệu Hội nghị Khoa học Nội khoa Toàn quốc lần IX nội khoa Việt nam 353 ABsTRACT LABORATORY FINDING OF DIAGNOsIs HeLICOBACTeR PYLORI IN GAsTRIC BIOPsY BY ReAL-TIMe PCR, MICROsCOPe sMeAR AND UReAse TesT ON PATIeNTs WITH PePTIC ULCeR AT BAC GIANG GeNeRAL HOsPITAL Background: H. pylori can be determined by a variety of techniques, however, the ability to detect bacteria of each technique are different. Currently, many patients have symptoms of peptic diseae was prescribed antibiotic treatment, but not better, then come and endoscopic examination. Objective and methods: A cross-sectional study on 190 patients with peptic ulcer determined by endoscopic (144 patients without antibiotics used less than 4 weeks before endoscopy and 46 patients with antibiotic used less than 4 weeks before endoscopy). Identifying HP in antral biopsy fragments by three techniques: imprinted smear - Giemsa staining, urease test and real-time PCR. Data management and analysis results using SPSS 16.0 software. Use Kappa index compatibility assessment of the test results with 95% reliability. Results: Positive rate of H. pylori in patients without and with antibiotic use <4 weeks before endoscopy: realtime PCR: 94.4% and 69.6%; imprinted smear: 92.4% and 47.8%; urease test: 79.2% and 43.5%; Appropriate level of technices together: real-time PCR with imprinted smear (93.7% k = 0,49) and (73.9% k = 0.48). real-time PCR with urease test: (83.3% k = 0.30) and (69.5% k = 0.42). urease test with imprinted smear: (86.1% k = 0.42) and (91.3% k = 0.82). Conclusions: Rate of H. pylori (+) by real-time PCR was highest (94.4%); H. pylori (+) by imprinted smear was high (92.4%); Positive urease test has the lowest percentage (79.2%). Real- time PCR determination of H. pylori in gastric biopsy fragments can be applied well in patients with antibiotic use < 4 weeks before endoscopy. Match between moderate of imprinted smear and urease test with real-time PCR. Keywords: peptic ulcer, H. pylori, real-time PCR, urease test, imprint smear, biopsy.