Nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế palmatin từ dược liệu hoàng đằng (caulis et radix fibraureae) để làm chất chuẩn

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 80 NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ PALMATIN TỪ DƯỢC LIỆU HOÀNG ĐẰNG (Caulis et Radix Fibraureae) ĐỂ LÀM CHẤT CHUẨN Lê Trường Minh*; Nguyễn Minh Chính*; Phạm Văn Hiển* TÓM TẮT Mục tiêu: chiết xuất, phân lập và tinh chế palmatin từ dược liệu Hoàng đằng để làm chất chuẩn, chất đối chiếu phục vụ công tác kiểm tra đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm đông dược. Phương pháp: khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần, phân lập bằng phương pháp trao đổi dung môi, tinh chế trên sắc ký cột. Kiểm tra nhận dạng cấu trúc hóa học chất tinh chế bằng phổ UV-Vis, MS và NMR. Đánh giá độ tinh khiết dựa vào kết quả kiểm tra điểm chảy và HPLC. Kết quả: đã chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatin từ Hoàng đằng. Nhận dạng hợp chất tinh chế được bằng phổ UV-Vis, MS và NMR cho thấy: chất tinh chế được phù hợp với dữ liệu chuẩn của palmatin. Độ tinh khiết của palmatin tinh chế được xác định bằng HPLC (97,31%) và bằng đo điểm chảy. Kết luận: nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatin và xây dựng được bộ dữ liệu chuẩn của hợp chất tinh chế này để làm chất chuẩn, chất đối chiếu phục vụ kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm đông dược. * Từ khóa: Palmatin; Hoàng đằng; Chiết xuất; Phân lập; Tinh chế. Extract and Isolation of High Purity Palmatin from Caulis et Radix Fibraureae Summary Objectives: To extract, isolate and purify palmatin from Caulis et Radix Fibraureae to use as a reference substance for quality control of materials and finished products in pharmaceuticals. Methods: Investigate and choose the extract method of total alcaloids. From this mixture, isolating palmatin by solvent-solvent exchange. Finally, purity palmatin was isolated by column chromatography using silicagel. Purity palmatin was determined structure by spectrometry of UV-Vis, MS and NMR. Concentration and purity of palmatin were identified by HPLC and melting point measurement. Results: It was extracted, isolated and purified palmatin from Caulis et Radix Fibraureae and established data of purified palmatin. This compound was determined structure by spectrometry of UV-Vis, MS and NMR showed that complied to data of standard palmatin. Purity of palmatil was checked by HPLC observed concentration of 97,31%. Conclusions: Palmatin from Caulis et Radix Fibraureae was extracted, isolated and purified. Data of purified palmatin was established, that potential to apply in quality control of materials and finished products in pharmaceuticals. * Key words: Palmatin; Caulis et Radix Fibraureae; Reference substance; Isolation; Purify. * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Minh Chính (minhphar8@gmail.com) Ngày nhận bài: 20/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 01/09/2016 Ngày bài báo được đăng: 12/09/2016 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 81 ĐẶT VẤN ĐỀ Hoàng đằng (Caulis et Radix Fibraureae), họ Tiết dê (Menispermaceae) là dược liệu quý chứa hoạt chất chính là palmatin [1, 2, 3]. Tiêu chuẩn của dược liệu này đã có trong dược điển, nhưng việc định lượng mới chỉ dừng lại ở mức xác định tổng alcaloid toàn phần [4]. Để góp phần phục vụ công tác kiểm tra, đánh giá và bảo đảm chất lượng dược liệu này, xây dựng chỉ tiêu định lượng palmatin là một yêu cầu quan trọng. Để thực hiện được điều đó, cần phải có chất chuẩn palmatin đối chiếu. Ở nước ta hiện nay, chuẩn palmatin chưa sản xuất được và phải nhập ngoại với giá thành khá cao [5, 6]. Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn, chúng tôi chiết xuất và phân lập palmatin với hàm lượng cao, bước đầu xây dựng cơ sở dữ liệu của hợp chất này phục vụ thiết lập chất chuẩn trong đánh giá chất lượng dược liệu và các chế phẩm đông dược chứa palmatin. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu và thiết bị. - Dược liệu Hoàng đằng do Công ty Cổ phần Dược phẩm và Trang Thiết bị Y tế Hòa Bình cung cấp, đạt tiêu chuẩn DĐVN IV. - Palmatin chuẩn phòng thí nghiệm (Trung Quốc) do Công ty Bioscope cung cấp: số lô 2013825, hạn sử dụng 14 - 8 - 2015, hàm lượng 98,56%. - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Water 2695E, bơm mẫu tự động, 4 kênh dung môi. Detector PDA Water 996 quét phổ rộng. Cột sắc ký Gemini Phenomenex C18 250 x 4,6 mm, 5 µm, máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart, SMP-10 (Đức), máy khối phổ MS 5989 B (Hewlett Pakard), phổ NMR được ghi trên máy Bruker Advance 500 MHz. Hóa chất dung môi, thiết bị phân tích khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm. 2. Phương pháp nghiên cứu. * Khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid: Chúng tôi tiến hành khảo sát với 2 phương pháp chiết xuất bằng axít loãng và cồn. - Chiết xuất bằng axít loãng: Cân khoảng 100 g bột dược liệu, thấm ẩm và chiết ngấm kiệt bằng dung dịch H2SO4 1% trong 24 giờ (600 ml x 4). Gạn lấy dịch chiết và lọc. Gộp các dịch lọc. Kiềm hóa dịch lọc bằng Na2CO3 2% đến pH = 7 - 8, để lắng và gạn. Bỏ phần dịch trong ở trên, phần còn lại lọc qua giấy lọc. Hòa tan phần rắn bằng cồn nóng thu được dịch trong và để lắng trong 12 giờ. Lọc tủa, thu được alcaloid toàn phần. - Chiết bằng cồn: Cân khoảng 100 g bột dược liệu. Thấm ẩm và chiết ngâm lạnh bột dược liệu bằng ethanol 90% trong 24 giờ (600 ml x 4 lần x 24 giờ/lần). Rút dịch chiết và lọc. Gộp các dịch chiết thu được, lọc. Cất thu hồi cồn, cô dưới áp suất giảm đến cắn nhão. Hoà tan cắn nhão trong khoảng 50 ml dung dịch HCl 10%. Khuấy kỹ và ngâm trong 24 giờ. Gạn dịch axít và tiếp tục hoà tan bằng dung dịch HCl 10% như vậy 2 lần nữa. Lọc dịch axít, kiềm hoá bằng amoniac đặc đến pH = 7 - 8. Chiết alcaloid base bằng cloroform, cất thu hồi dung môi và cô cách thủy thu cắn. Chỉ tiêu đánh giá: dựa vào khối lượng cắn alcaloid thô thu được. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 82 * Phân lập palmatin từ cắn alcaloid thô: Cắn alcaloid toàn phần được chiết 4 lần với ether dầu hoả (200 ml x 4 lần). Lọc và gộp các dịch chiết ether dầu hoả. Lắc với dung dịch H2SO4 1% (150 ml x 3 lần). Gạn thu lấy dịch chiết axít. Kiềm hoá dịch chiết nước bằng dung dịch Na2CO3 đến pH = 7 - 8. Chiết palmatin base trong dịch chiết này với ether dầu hỏa (200 ml x 4 lần). Làm khan, cất thu hồi ether dầu hỏa đến cắn. Cắn thu được hòa tan với dung dịch axít oxalic 17,5% trong ethanol. Để yên ở nhiệt độ thường, thu được tinh thể palmatin hydrooxalat. Hòa tan tinh thể palmatin hydrooxalat trong nước, cho thêm từ từ dung dịch Na2CO3 vào để kiềm hóa đến pH = 7 - 8. Chiết palmatin base bằng ether dầu hỏa (30 ml x 4 lần). Cất thu hồi ether dầu hỏa được cắn palmatin. Kết tinh cắn palmatin trong aceton, thu được palmatin tinh khiết. * Tinh chế palmatin: Tinh chế bằng sắc ký cột nhồi silicagel. Hoạt hóa silicagel ở 100oC trong 3 giờ, sau đó ngâm trong toluen 1 giờ và nhồi cột. Để ổn định trong 3 giờ, xả bỏ toluen. Hòa tan khoảng 2 mg palmatin trong 5 ml benzen tải lên cột. Rửa giải bằng hỗn hợp toluen - ethyl acetat theo tỷ lệ tăng dần ethylacetat (từ tỷ lệ 98:2 sang tỷ lệ 93:7). Xác định sự có mặt của palmatin trong các phân đoạn bằng TLC. Tập trung các phân đoạn chứa hoạt chất, cất thu hồi dung môi đến cắn. Kết tinh lại cắn trong aceton. Lọc thu tinh thể, sấy dưới áp suất giảm ở 600C trong 4 giờ, sử dụng chất hút ẩm là phosphor pentaoxyt. * Nhận dạng và kiểm tra chất tinh chế: - Đo điểm chảy: phụ lục 6.7 DĐVN IV, phương pháp 1. - Đo phổ: xác định phổ UV-Vis, MS, NMR. - Độ tinh khiết và định lượng: bằng phương pháp HPLC. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp chiết. Bảng 1: Kết quả khảo sát lựa chọn phương pháp chiết xuất alcaloid toàn phần từ dược liệu Hoàng đằng. Số thứ tự Chiết xuất với axít Chiết xuất với cồn Alcaloid toàn phần (g) Tỷ lệ lượng chiết được (%) Alcaloid toàn phần (g) Tỷ lệ lượng chiết được (%) 1 3,35 3,35 2,56 2,56 2 3,17 3,17 2,32 2,32 3 3.26 3,26 2,65 2,65 4 3,22 3,22 2,59 2,59 5 3,40 3,40 2,45 2,45 X (%) 3,28 2,51 Trong 2 phương pháp chiết đã khảo sát ở phần phương pháp nghiên cứu, kết quả cho thấy: chiết xuất với dung môi là axít loãng cho hiệu suất cao hơn (3,28%) so với phương pháp chiết xuất với cồn (2,51%), dễ thực hiện, dung môi dễ kiếm, giá thành thấp. Với kết quả này, chúng tôi lựa chọn dung môi chiết là axít loãng. 2. Kết quả nhận dạng kiểm tra hợp chất tinh chế được. * Kết quả đo điểm chảy: Tiến hành đo điểm chảy của các hợp chất nghiên cứu theo DĐVN IV (Phụ lục 6.7, phương pháp 1: đo trong ống mao quản). Hợp chất tinh chế được có nhiệt độ nóng chảy 237 - 2380C, phù hợp với điểm chảy của palmatin chuẩn. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 83 2. Kết quả nhận dạng kiểm tra hợp chất tinh chế được. * Kết quả đo điểm chảy: Tiến hành đo điểm chảy của các hợp chất nghiên cứu theo DĐVN IV (Phụ lục 6.7, phương pháp 1: đo trong ống mao quản). Hợp chất tinh chế được có nhiệt độ nóng chảy 237 - 2380C, phù hợp với điểm chảy của palmatin chuẩn. * Kết quả đo phổ UV: Tiến hành đo phổ tử (UV). Hòa tan mẫu thử và mẫu đối chiếu trong MeOH, nồng độ 0,01 mg/ml. 10.951 Extracted 240.3 261.6 345.1 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 nm 220.00 240.00 260.00 280.00 300.00 320.00 340.00 360.00 380.00 400.00 Hình 1: Phổ UV của hợp chất tinh chế được trong MeOH. Kết quả xác định phổ UV-Vis cho thấy hợp chất thu được trong MeOH có 3 cực đại hấp thụ là 240,3; 261,6 và 345,1 nm. * Kết quả đo phổ MS: Phân tích phổ MS trên máy MS 5989 B (Hewlett Pakard) ion hóa bằng phun điện tử. Hình 2: Phổ MS của hợp chất tinh chế được. Kết quả cho thấy các chất phân tích đều cho mảnh ion phân tử phù hợp với khối lượng phân tử tương ứng, phổ đồ xuất hiện píc 337 [M-CH3], 336 [M-CH4]-, 322 [M-2(CH3)]-, 308 [M-CH4 -CO]-. T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 84 * Kết quả đo phổ NMR: Hình 3: Phổ NMR 1H-NMR (a), 13C-NMR (b), DEPT (c). Phổ cộng hưởng từ 1 chiều cho thấy: phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu 2 proton của một vòng thơm bị thế ở 4 vị trí cộng hưởng tại δH (ppm) 7,05 và 7,61 là hai tín hiệu singlet. Tín hiệu tại δH (ppm) 8,02 (d, J = 9 Hz) và 8,09 (d, J = 9 Hz) xác nhận vị trí ortho của 2 proton ở vòng thơm thứ 2. 2 tín hiệu singlet tại δH (ppm) 8,80 và 9,76 xác nhận sự có mặt lần lượt của proton H-13 và H-8. Tín hiệu proton tại δH (ppm) 3,32 (2H, m) và 4,96 (2H, J = 6,25 Hz) xác nhận sự có mặt của proton H-5 và H-6 ở vòng B. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của hợp chất M2Pal còn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm methoxy tại δH (ppm) 4,00; 3,94; 4,22 và 4,10 lần lượt ở các vị trí OMe-2, OMe-3, OMe-9 và OMe-10. Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon, trong đó có 9 carbon bậc 4; 6 carbon CH; 2 carbon CH2 và 4 carbon CH3 được xác định bằng phổ DEPT 90 và DEPT135. Xác định sự có mặt của 3 vòng thơm với 15 tín hiệu của carbon olefin có độ dịch chuyển hóa học trong vùng từ 109,9 đến 153,6; 1 carbon methylen nối với nguyên tử nitơ tại δC (ppm) 57,3; 1 carbon CH nối với nguyên tử nitơ tại δC (ppm) 146,3 và 1 carbon bậc bốn nối với nguyên tử nitơ tại δC (ppm) 139,5. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu của 4 nhóm methoxy được xác định tại δC (ppm) 57,1; 57,3; 62,6 và 57,7. Các dữ liệu phổ nêu trên cho thấy đây là một hợp chất có khung protoberberin. Đối chiếu với cơ sở dữ liệu đã công bố nhận thấy hợp chất M2Pal chính là palmatin. * Kết quả phân tích HPLC: Thực hiện phương pháp phân tích palmatin bằng HPLC để định lượng palmatin. (a) (b) (c) T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 85 Phương pháp đã được thẩm định đáp ứng yêu cầu về tính tương thích hệ thống, chọn lọc đặc hiệu, độ đúng cao (98,03 - 99,89%) và lặp lại (RSD từ 0,27 - 0,96%). Hàm lượng palmatin trong sản phẩm tinh chế được có hàm lượng 97,3 ± 0,67%. Pa lma tin - 10 .83 3 A U 0. 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Mi nutes0. 0.5 1.0 01. 50 2.0 2.50 3.0 3.50 4. 04 .50 5.0 5.0 6.0 6. 507 .0 7.50 8.0 8.50 9.0 09 .50 10. 10.5 1.0 1. 5012 .0 12.50 13.0 Pa lm at in - 10 . 83 3 AU 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 11.00 11.50 12.00 12.50 13.00 Hình 4: Sắc ký đồ HPLC palmatin. Kết quả xác định độ tinh khiết của hợp chất tinh chế được cho thấy: tạp chất trong nguyên trạng < 3%. Trong đó, tổng diện tích các píc tạp < 0,05%. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã chiết xuất, phân lập và tinh chế được palmatin từ dược liệu Hoàng đằng. Sử dụng phương pháp chiết với axít loãng cho hiệu suất cao hơn (3,28%) so với phương pháp chiết bằng cồn. Hợp chất tinh chế đã được nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học bằng kết quả phân tích phổ UV-Vis, MS và phổ NMR. Các dữ liệu thu được đều khẳng định hợp chất tinh chế được là palmatin. Xác định độ tinh khiết và hàm lượng của palmatin tinh chế dựa vào đo điểm chảy và sắc ký HPLC với hàm lượng > 97%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội. Bài giảng Dược liệu tập 1 và tập 2. NXB Y học. 1998. 2. Bộ môn Dược học Cổ truyền, Trường Đại học Dược Hà Nội. Dược học Cổ truyền. Nhà xuất bản Y học. 2000. 3. Bộ môn Hóa phân tích, Trường Đại học Dược Hà Nội. Kiểm nghiệm thuốc. Trung tâm Thông tin - Thư viện Đại học Dược Hà Nội. 4. Bộ Y tế. Dược điển Việt Nam IV. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2009 5. Committee on Asean Reference Substances. Guidelines for the establishment, handling, storage and use of Asean reference substances. Thailand. 2005, pp.2-12. 6. Committee on Asean Reference Substances. SOP for the production of Asean reference substances. Thailand. 2009, pp.1-6. 7. Gao JM et al. One-step purification of palmatine and its derivative dl-tetrahydropalmatine from Enantia chlorantha using high-performance displacement chromatography. Journal of Chromatography A. 2008, 1208 (1+2), pp.47-53. 8. International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) G1. Guidelines for the requirements for the competence of reference materials producers. 2008, pp.6-7. 9. International Laboratory Accreditation Cooperation (ILAC) G9. Guidelines for the selection and use of reference materials. 2005, pp.4-15. 10. International Organisation for Standardization. ISO Guide 30: 1992 Terms and definitions used in connection with reference materials. 1992.