Nghiên cứu kỹ thuật nhuộm Band G để lập Karyotype trong chẩn đoán các bệnh rối loạn nhiễm sắc thể

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 15, 2003 NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT NHUỘM BAND G ĐỂ LẬP KARYOTYPE TRONG CHẨN ĐOÁN CÁC BỆNH RỐI LOẠN NHIỄM SẮC THỂ Hà Thị Minh Thi Đoàn Thị Duyên Anh, Nguyễn Viết Nhân Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bất thường nhiễm sắc thể (NST) là một trong những nguyên nhân quan trọng gây ra các bệnh lý di truyền, được gặp với tỷ lệ 1/150 trẻ sinh sống và trongû 50% trường hợp sẩy thai ngẫu nhiên ở ba tháng đầu thai kỳ [6]. Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả các trường hợp trên lâm sàng nghi ngờ có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST [2]. Kết quả không những phục vụ việc chẩn đoán xác định mà còn có ý nghĩa quyết định trongû công tác tư vấn di truyền. Từ năm 1970, người ta đã không công nhận những Karyotype được lập với kỹ thuật nhuộm Giemsa thường (không có band) vì với kỹ thuật nhuộm này khó nhận dạng chính xác từng NST cũng như không thể phát hiện được những bất thường cấu trúc kiểu đảo đoạn, nhân đôi đoạn,...[6]. Từ đó đến nay, tất cả các karyotype thông thường được lập tại các phòng xét nghiệm di truyền trên thế giới chỉ sử dụng các kỹ thuật nhuộm band, trong đó thông dụng nhất là kỹ thuật nhuộm band G. Để việc nhuộm band G đạt được kết quả tối ưu làm cơ sở cho việc lập karyotype, cần phải hoàn thiện hai bước quan trọng đó là (1) làm được tiêu bản với các cụm NST phân tán tốt, không bị biến dạng (sau khi đã nuôi cấy mẫu); (2) xử lý tiêu bản và nhuộm đúng kỹ thuật với kết quả các band trên NST đạt tiêu chuẩn. Việc lập karyotype có thể tiến hành đối với các mẫu nghiệm như tế bào máu ngoại vi (tế bào lympho), tế bào nước ối, tủy xương, tế bào da... nhưng tế bào máu ngoại vi được sử dụng nhiều nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn nuôi cấy tế bào máu ngoại vi để nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhuộm band G các cụm NST. Tuy nhiên, việc nhuộm NST bằng kỹ thuật nhuộm band đòi hỏi phải có hoá chất đặc biệt, thao tác kỹ thuật tinh tế cũng như điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm) thích hợp cho việc làm tiêu bản [1]. Vì vậy, hiện nay một số phòng xét nghiệm di truyền trong toàn quốc vẫn phải lập karyotype với kỹ thuật nhuộm Giemsa thường. Để phục vụ nhu cầu chẩn đoán và tư vấn di truyền tại địa phương, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm hai mục tiêu sau: Cải tiến và hoàn thiện việc làm tiêu bản NST tế bào máu ngoại vi. Cải tiến và hoàn thiện quy trình nhuộm nhiễm sắc thể bằng kỹ thuật nhuộm band G. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu: Chúng tôi nghiên cứu lập Karyotype tế bào máu ngoại vi người. Các mẫu máu được nghiên cứu lấy từ những người bình thường tình nguyện cũng như những bệnh nhân với lâm sàng có chỉ định lập Karyotype được giới thiệu từ khoa Nhi và Khoa Sản Bệnh viện Trung ương Huế. Nghiên cứu thiết kế tủ làm tiêu bản, giá gác tiêu bản khi nhuộm. Nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nhỏ tiêu bản nhằm tăng chất lượng tiêu bản Nghiên cứu hoàn thiện các bước làm già, xử lý và nhuộm tiêu bản 2.2. Phương pháp nghiên cứu: Tất cả các nghiên cứu cải tiến cũng như hoàn thiện quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G của chúng tôi đều dựa trên những tiêu chuẩn kỹ thuật của Hội kỹ thuật Di truyền thế giới (AGT). Đối với mỗi bước kỹ thuật đều có nhiều cách làm khác nhau tuỳ theo từng phòng xét nghiệm. Vì vậy, đối với mỗi mẫu nuôi cấy thu hoạch từ mỗi người được nghiên cứu, chúng tôi chia nhiều lô để thử nghiệm. Tế bào máu ngoại vi sau khi được nuôi cấy bằng môi trường F10 và phytohemagglutinin trong 3 ngày sẽ được thu hoạch với colcemide, sốc nhược trương bằng dung dịch KCl và sodium citrate, cố định trong Carnoy (3 methanol: 1 acid acetic). Sau đó tiến hành các bước làm tiêu bản và nhuộm như sau: 2.2.1. Làm tiêu bản: Chúng tôi nghiên cứu để tiêu bản đạt chất lượng chuẩn là: các NST phân tán tốt, tối đa chỉ 3 NST có biểu hiện chồng chéo và không có NST bị biến dạng hoặc đứt gãy. Để đạt được kết quả này, quá trình làm tiêu bản phải được thực hiện với các điều kiện sau: Điều kiện nhiệt độ, độ ẩm khu vực nhỏ tiêu bản thích hợp nhằm giúp tiêu bản khô trong khoảng thời gian 30-45 giây : Hầu hết các phòng xét nghiệm di truyền tế bào trên thế giới đều sử dụng Thermotron để ổn định nhiệt độ, độ ẩm. Trong điều kiện độ ẩm Thừa Thiên Huế cao (80-90%), lại không có Thermotron, chúng tôi thiết kế một tủ làm tiêu bản bằng cách nối máy hút ẩm thông thường với một tủ kính có cửa sổ. Lam kính được chuẩn bị tốt : chúng tôi sử dụng các loại lam ướt như sau: Lam ngâm trong nước 10-20oC Lam ngâm trong nước 50-60oC Lam ngâm nước 30-40oC Sau khi nhỏ, lượng nước trên tiêu bản được làm ráo bằng giấy Kimwipes. Tư thế lam kính khi nhỏ dịch treo tế bào phù hợp: chúng tôi lần lượt thử nghiệm với các tư thế như sau: Lam kính được đặt nằm ngang Lam kính được đặt nằm nghiêng 20-30o. 2.2.2. Làm già tiêu bản: Có các cách như sau: Để ở nhiệt độ phòng trong 3-4 ngày Để trong tủ sấy 90-95oC, trong 20 phút Để trong tủ sấy 60oC, trong 12-24 giờ 2.2.3. Xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025%: Tác dụng của trypsin lên NST nhằm tạo band khi nhuộm phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc với tiêu bản, độ pH của trypsin. Chúng tôi chỉnh pH = 8 bằng Na2HPO4. Thời gian ngâm tiêu bản trong trypsin được thử nghiệm ở 10, 15, 20 giây. Sau khi ngâm trypsin, tiêu bản được rửa 2 lần trong dịch muối đẳng trương. 2.2.4. Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright: Sử dụng thuốc nhuộm Wright mẹ pha với dung dịch đệm Gurr tỷ lệ 1: 4 Thời gian nhuộm là 3 phút Vì thuốc nhuộm Wright rất dễ kết tủa nên thay vì ngâm nhiều tiêu bản trong cốc nhuộm, chúng tôi cải tiến bằng cách tạo 1 giá nhuộm ở la-va-bô. Trên giá này chúng tôi gác các tiêu bản đã xử lý trypsin và đổ thuốc nhuộm sử dụng lên mỗi tiêu bản. Tiêu bản được rửa và làm khô bằng không khí ép. 3. KẾT QUẢ 3.1. Thiết bị tự thiết kế: 3.1.1. Tủ làm tiêu bản: Chúng tôi đã thiết kế thành công tủ làm tiêu bản bằng cách nối máy hút ẩm với một tủ kính có 2 cửa sổ. Sau khi bật máy hút ẩm 30-60 phút, độ ẩm trong tủ còn khoảng 50-60%. Người kỹ thuật viên dễ dàng luồn tay qua cửa sổ để thao tác việc làm tiêu bản. 3.1.2. Giá gác tiêu bản để nhuộm: Chúng tôi đã thiết kế một giá để gác các tiêu bản khi nhuộm ngay tại la-va-bô. Để nhuộm 1 tiêu bản, chỉ cần trộn 1 ml dung dịch Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi phủ lên tiêu bản đã gác trên giá. Sau 3 phút, rửa ngay tiêu bản tại la-va-bô. 3.2. Chất lượng tiêu bản: Bảng 1: Chất lượng tiêu bản theo tư thế và điều kiện nhiệt độ của lam kính khi nhỏ tiêu bản Nhiệt độ nước ngâm lam kính Thời gian khô Lam kính nằm ngang Lam kính nghiêng 20-30oC 10-20oC > 60 giây Có hiện tượng 2 cụm NST trộn lẫn nhau; hoặc các cụm không phân tán Hiện tượng 2 hoặc nhiều cụm NST trộn lẫn nhau rất nhiều. 30-40oC 30-50 giây Cụm NST có phân tán nhưng số NST có sự chồng chéo nhiều (> 3) Cụm NST phân tán tốt 50-60oC < 20 giây Cụm NST không phân tán Cụm NST không phân tán 3.3. Hình ảnh NST sau khi nhuộm band G : Bảng 2: Sự thay đổi chất lượng hình ảnh NST được nhuộm band G theo các chế độ làm già tiêu bản và thời gian xử lý bằng trypsin Kiểu làm già tiêu bản Chất lượng hình ảnh NST Trypsin 10 giây Trypsin 15 giây Trypsin 20 giây Nhiệt độ phòng 3-4 ngày NST sắc nét, bắt màu đậm, không hiện band NST sắc nét, bắt màu tốt, band hiện rõ NST phồng lên, trong lòng có những chỗ trống 60oC 12-24 giờ NST sắc nét, bắt màu đậm, không hiện band NST sắc nét, bắt màu tốt, band hiện rõ NST phồng lên, trong lòng có những chỗ trống 90-95oC 20 phút NST không sắc nét, bắt màu đậm không hiện band NST không sắc nét, nhưng bắt màu tốt và hiện band NST nhoè, phồng lên, trong lòng có những chỗ trống 4. BÀN LUẬN 4.1. Về những trang thiết bị tự thiết kế: Tủ làm tiêu bản tự thiết kế: trong điều kiện độ ẩm của Thừa Thiên-Huế cao, thường đến 80-90%, tủ làm tiêu bản tự thiết kế tỏ ra rất hữu hiệu vì đã đưa độ ẩm xuống còn 50-60% trong vòng 30-60 phút. Đồng thời, việc thao tác trong tủ kín giúp tránh được sự thay đổi của luồng không khí lưu thông, điều này giúp ổn định thời gian khô của tiêu bản. Ngoài ra, nhờ tủ làm tiêu bản này, người kỹ thuật viên tránh được tác hại do hơi methanol và acid acetic bay lên trong quá trình phun tiêu bản. Giá gác tiêu bản để nhuộm: trước đây, với phương pháp ngâm tiêu bản trong cốc nhuộm, mỗi cốc chứa 50 ml thuốc nhuộm đã pha (tương đương 10 ml Wright mẹ) chỉ ngâm được 4 tiêu bản. Sau đó, nếu muốn nhuộm thêm phải hòa thuốc nhuộm mới vì thuốc vừa ngâm đã bị kết tủa. Như vậy, kiểu nhuộm cũ rất tốn thuốc nhuộm và khó rửa sạch thuốc nhuộm trên các tiêu bản trong cốc cùng một lần. Nhờ giá gác tiêu bản này, chúng tôi có thể nhuộm lần lượt từng tiêu bản mà không xảy ra hiện tượngû kết tủa thuốc nhuộm. Việc nhuộm sẽ dừng khi nào đủ số cụm NST đạt chất lượng để đánh giá. Thông thường, mỗi bệnh nhân chỉ cần nhuộm tối đa 5 tiêu bản nên lượng thuốc nhuộm Wright mẹ cần dùng không quá 5 ml. 4.2. Chất lượng tiêu bản: Theo Hội kỹ thuật di truyền thế giới, có thể nhỏ dịch treo tế bào lên lam kính khô hoặc ướt. Tuy nhiên, lam kính khô thường chỉ áp dụng cho các vùng có điều kiện nhiệt độ, độ ẩm lý tưởng. Các lam ướt làm cụm NST dễ phân tán vì các “thấu kính” nước trên lam kính sẽ rút lại ngay lập tức khi Carnoy trong dịch treo tế bào chạm vào nó [1]. Theo Holmquist và Motara, năng lượng khử nước từ dung dịch Carnoy đã đóng vai trò quan trọng trong việc giúp phân tán cụm NST [4]. Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp lam kính ướt. Chúng tôi kiểm soát thời gian khô tiêu bản nhờ vào việc thay đổi nhiệt độ của nước ngâm. Thời gian khô tiêu bản rất quan trọng vì nó quyết định chất lượng phân tán của cụm NST. Theo phần lớn các nhà kỹ thuật di truyền, thời gian khô lý tưởng là 30-45 giây [1]. Nhiệt độ nước ngâm lam kính cũng có sự thay đổi tương đối tuỳ theo từng tác giả, tuy nhiên Hansen cho rằng nên sử dụng nước ngâm ở nhiệt độ từ 20-48oC [3]. Nghiên cứu của chúng tôi ở bảng 1 cho thấy chỉ khi làm tiêu bản với những lam kính ngâm trong nước 30-40oC thì thời gian khô mới đạt 30-50 giây. Ở các nhiệt độ nước ngâm khác trong nghiên cứu của chúng tôi chất lượng tiêu bản đều không tốt dù tư thế lam kính khi nhỏ là nằm ngang hay nằm nghiêng. Với nhiệt độ nước ngâm lam kính 30-40oC, chúng tôi nhận thấy với lam kính đặt nghiêng 20-30oC theo trục ngắn thì chất lượng tiêu bản tốt hơn. Một số nhà kỹ thuật di truyền vẫn làm tiêu bản với lam kính nằm ngang, nhưng theo Hội kỹ thuật di truyền thế giới, hiện nay đa số các phòng xét nghiệm áp dụng tư thế lam kính nằm nghiêng 20-30o theo trục ngắn [1]. Ngoài ra, theo kinh nghiệm của chúng tôi, nếu dùng những lam kính có sự phân bố nước đồng đều khi lấy ra khỏi nước ngâm sẽ tạo được tiêu bản có NST phân tán tốt hơn. 4.3. Chất lượng hình ảnh NST sau khi nhuộm band G: Kết quả ở bảng 2 cho thấy chế độ làm già tiêu bản ở 90-95oC trong 20 phút không đảm bảo chất lượng hình ảnh sau khi nhuộm band G. Ở chế độ làm già tiêu bản này, hình ảnh NST có thể đem phân tích được nếu xử lý bằng trypsin đúng 15 giây, nhưng chúng tôi không chọn vì NST tuy có bắt màu và hiện band tốt nhưng không được sắc nét. Tuy nhiên, một số tác giả vẫn sử dụng khi cần có kết quả karyotype nhanh [1]. Có lẽ phòng xét nghiệm của các tác giả này nằm trong khu vực có độ ẩm thích hợp hơn chúng tôi nên kết quả nhuộm đạt chất lượng hơn. Cả 2 chế độ làm già tiêu bản là để ở nhiệt độ phòng 3-4 ngày và 60oC trong 12-24 giờ đều cho kết quả giống nhau. Qua kết quả này, chúng tôi đã chọn chế độ làm già tiêu bản là 60oC trong 12-24 giờ để tiết kiệm thời gian trả kết quả. Thông thường chúng tôi làm tiêu bản vào buổi chiều và để tiêu bản trong tủ sấy 60oC qua đêm. Quá trình làm già tiêu bản rất quan trọng trong việc tạo nên hình ảnh NST đạt chất lượng sau nhuộm. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa thực sự hiểu rõ tác dụng của nó, có lẽ là do quá trình này đã làm khô hết lượng nước trên tiêu bản mà có thể ảnh hưởng đến việc nhuộm band [1]. Bảng 2 còn cho thấy chỉ bằng cách xử lý 15 giây với trypsin thì mới cho hình ảnh NST đạt chất lượng. Theo Wang và Federoff, trypsin đã thủy phân protein của nhiễm sắc chất làm cho thuốc nhuộm có thể phản ứng với DNA được bộc lộ [7]. Về sau, Hsu cho rằng trypsin tác động bằng sự chelat hóa (tạo phức hợp “càng cua” có tính hoà tan) hơn là tiêu hủy protein [5]. Tóm lại, qua việc thử nghiệm các kiểu tiến hành làm tiêu bản và nhuộm, chúng tôi đưa ra quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G như sau: Quá trình làm tiêu bản thực hiện trong tủ làm tiêu bản sau khi bật máy hút ẩm 30-60 phút để đạt độ ẩm 50-60% (có kiểm tra bằng ẩm kế). Nhỏ dịch treo tế bào lên lam kính đã được ngâm trong nước 30-40oC với lam kính nằm nghiêng 20-30o theo trục ngắn. Sau khi tiêu bản khô, làm già tiêu bản trong tủ sấy 60oC để qua đêm. Sáng hôm sau, xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025% pH = 8 trong 15 giây. Rửa sạch trypsin 2 lần trong dung dịch muối đẳng trương. Nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright: gác tiêu bản lên giá, trộn 1 ml dung dịch Wright mẹ với 4 ml đệm Gurr rồi phủ lên tiêu bản trong 3 phút. Sau đó rửa sạch tiêu bản và làm khô bằng không khí ép. 5. KẾT LUẬN Qua quá trình nghiên cứu và cải tiến quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: Việc thiết kế tủ làm tiêu bản đã giúp ổn định độ ẩm và sự lưu thông không khí ở khu vực làm tiêu bản, tạo điều kiện đảm bảo chất lượng tiêu bản (có nhiều cụm nhiễm sắc thể đạt tiêu chuẩn). Việc thiết kế giá gác tiêu bản giúp đảm bảo chất lượng thuốc nhuộm khi cần nhuộm nhiều tiêu bản, đồng thời tiết kiệm được lượng thuốc nhuộm Wright mẹ. Chúng tôi đã thiết lập được quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G đạt chất lượng cao với các cụm NST phân tán tốt, hình ảnh NST sắc nét, bắt màu thuốc nhuộm tốt và hiện band rõ. TÀI LIỆU THAM KHẢO Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual.. 3rd edition. Lippincott - Raven (1997) Geleherter T.D., Collins F.S., Ginsburg D. Principles of Medical Genetics. 2nd edition. William & Wilkins (1998) Hansen S. Slide preparation. Karyogram, 1980. In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual... 3rd edition. Lippincott - Raven (1997) Holmquist G.P., Motara M.A., The magic of cytogenetic technology. In: Obe G, Basler A., Cytogenetics. Springer-Verlag (1987) Hsu T.C., Longitudinal differentiation of chromosomes. Annu Rev Genet, 1973. In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual.. 3rd edition. Lippincott - Raven (1997) Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J., White R.L.Medical Genetics. 2nd edition, Mosby (2000) Wang H.C., Federoff S. Banding in human chromosomes treated with trypsin. Nature New Biol, 1972. In: Barch M.J., Knutsen T., Spurbeck J.L The AGT Cytogentics Laboratory Manual. 3rd edition. Lippincott - Raven (1997) TÓM TẮT Lập karyotype là một xét nghiệm cần thiết cho tất cả các trường hợp trên lâm sàng nghi ngờ có bất thường số lượng hoặc cấu trúc NST. Để lập Karyotype đạt tiêu chuẩn cần phải nhuộm NST với kỹ thuật nhuộm band, trong đó thông dụng nhất là nhuộm band G. Nhóm nghiên cứu đã thiết kế được tủ làm tiêu bản và giá gác tiêu bản để nhuộm. Đồng thời, thiết lập được quy trình làm tiêu bản và nhuộm band G với một số đặc điểm kỹ thuật như sau: lam kính được ngâm trong nước 30-40oC tư thế lam kính khi nhỏ tiêu bản: nghiêng 20-30o theo trục ngắn. làm già tiêu bản trong tủ sấy 60oC để qua đêm. xử lý tiêu bản bằng trypsin 0,025% pH = 8 trong 15 giây. nhuộm bằng thuốc nhuộm Wright trong 3 phút Kết quả: các cụm NST phân tán tốt, hình ảnh sắc nét, bắt màu thuốc nhuộm tốt và hiện band rõ. G-BANDING TECHNIQUE FOR MAKING KARYOTYPE USED IN THE DIAGNOSIS OF CHROMOSOMAL DISORDERS Ha Thi Minh Thi Đoan Thi Duyen Anh, Nguyen Viet Nhan Collge of Medicine, Hue University SUMMARY Making karyotype is very necessary for all the clinical cases doubted to have abnormal number or structure. To make karyotype get the standard required, chromosomes ought to be dyed using banding techniques, of which G-banding id the most common. The authors of the study designed successfully a cabinet for slide preparation and a rack for staining. The procedure for slide making and G-banding was established with the following technical properties: The slides are rinsed in the water of 30-400C. The slides are held at an angle of 20-300C during the time of dropping cells. Slide aging at 600C Slide treating with tripsin of 0.025pH=8 for 15 seconds Staining with Wright for 3 minutes Result: The chromosomes in each metaphase is well separated, the pictures of chromosomes are clear, the color good, and the bands visible.