KẾT LUẬN
Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ
đã phân lập và nuôi cấy sau lần cấy chuyền thứ
hai. Chúng tôi đã đánh giá các chỉ tiêu để xác
định cho MSC, kết quả cho thấy các tế bào nuôi
cấy đều là các tế bào bám dính trên chai nuôi, có
hình dạng thon dài đặc trưng cho tế bào gốc
trung mô. Thứ hai, quần thể tế bào này có khả
năng biệt hóa được thành 2 dòng tế bào khác
nhau thuộc nguồn gốc trung mô đó là nguyên
bào xương và tế bào mỡ với phương pháp xác
định đáng tin cậy chứng tỏ tế bào có khả năng
biệt hóa được thành các dòng tế bào khác. Thứ
ba, chúng tôi đã khảo sát sự biểu hiện của các
marker dùng để xác định cho quần thể MSC từ
mô mỡ, kết quả cho thấy tế bào dương tính khá
cao (trên 95%) với các marker được CD73, CD90
và CD105. Đây là ba marker phổ biến được chấp
thuận để xác định cho các MSC. Các tế bào này
biểu hiện rất thấp dưới 2% các marker CD45 và
HLA-DR. Như vậy, với kết quả khảo sát khả
năng bám dính, tiềm năng biệt hóa và sự biểu
hiện các marker bề mặt cho thấy quần thể tế bào
nuôi cấy chính là các MSC. Đây là nguồn tế bào
gốc rất quan trọng và tiềm năng cho các ứng
dụng lâm sàng. Tuy nhiên, để có thể ứng dụng
các tế bào này một cách an toàn và hiệu quả, cần
thực hiện thêm các thí nghiệm khác để khảo sát
sự an toàn về mặt di truyền khi thực hiện các
nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng như tiềm năng
biệt hóa của tế bào theo thời gian nuôi cấy và số
lần nhân đôi thế hệ, để từ đó có thể sử dụng các
tế bào này trong các điều trị góp phần nâng cao
chất lượng điều trị cho người bệnh.
8 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 09/02/2022 | Lượt xem: 23 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Nghiên cứu quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từmô mỡngười hướng đếnứng dụng trong lĩnh vực y học, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 459
NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
TỪ MÔ MỠ NGƯỜI HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC Y HỌC
Huỳnh Duy Thảo*, Trần Lê Bảo Hà**, Lê Thanh Hùng***, Võ Quốc Vũ*, Hoàng Kc Hương*,
Thái Trúc Quỳnh*, Trần Công Toại*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Tế bào gốc ngày nay được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều đặc biệt trong y học tái tạo và công
nghệ mô. Do đó, để thu nhận, phân lập và ứng dụng hiệu quả cần có những quy trình hiệu quả cho tế bào gốc.
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình thu nhận, phân lập và xác định nguồn tế bào gốc trung mô từ
mô mỡ người để hướng đến các ứng dụng trong y học và công nghệ mô.
Phương pháp nghiên cứu: Thí nghiệm thực nghiệm mô tả. Mô mỡ người được thu nhận trong điều kiện vô
trùng phòng mổ và phân lập tế bào gốc bằng hỗn hợp enzyme Collagenase-Dispase. Sau đó, tế bào được nuôi
trong môi trường cơ bản để bám dính và phát triển. Các tế bào này sẽ được định danh để xác định là tế bào gốc
trung mô bằng cách dựa vào khả năng bám dính trên chai nuôi, khả năng biệt hóa và sự biểu hiện của các marker
cho dòng tế bào gốc trung mô.
Kết quả: Quần thể tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai được đem đi định danh tế bào gốc trung mô. Đó là các
tế bào bám dính vào chai nuôi, có hình thái giống với nguyên bào sợi. Các tế bào này biệt hóa được thành nguyên
bào xương và tế bào mỡ trong điều kiện in vitro. Các tế bào này dương tính rất cao với các marker CD44, CD73,
CD90 và CD105 và biểu hiện rất thấp các marker CD45 và HLA-DR.
Kết luận: Quần thể tế bào nuôi cấy từ mô mỡ là các tế bào gốc trung mô. Từ đó, có thể ứng dụng các tế bào
gốc này trong các nghiên cứu ứng dụng trong y học và công nghệ mô.
Từ khóa: Tế bào gốc trung mô, mô mỡ người, sự biệt hóa, marker tế bào gốc trung mô.
ABSTRACT
RESEARCH PROCESS TO COLLECT MESENCHYMAL STEM CELLS FROM HUMAN ADIPOSE
TISSUE TOWARDS APPLICATIONS IN THE MEDICAL FIELD
Huynh Duy Thao, Tran Le Bao Ha, Le Thanh Hung, Vo Quoc Vu, Hoang Kc Huong, Thai Truc Quynh,
Tran Cong Toai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 1 - 2013: 459 - 466
Background: Stem cells research and use a lot especially in regenerative medicine and tissue engineering
today. Therefore, to capture, isolate and performance applications need to have efficient protocol suitable for stem
cell.
Objectives: Set up the acquisition process, the isolation and identification of mesenchymal stem cells from
human adipose tissue toward applications in medicine and tissue engineering
Methods: The experiment was arranged as described experiments. Human adipose tissue were collected
in a sterile operating room conditions and isolation of stem cells with a mixture of enzyme collagenase-
Dispase. Then, the cells were cultured in a basic medium for cell adhesion and growth. These cells will be
* Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch
** Phòng Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM
*** Khoa Răng – Hàm – Mặt, ĐH Y Dược TP.HCM
Tác giả liên lạc: BS Lê Thanh Hùng, ĐT: 0918.686.151, Email: ranghammat@gmail.com
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 460
identified to determine whether mesenchymal stem cells by relying on the ability to stick on the surface of culture
flask, based on their ability to differentiate into other cell lines and the expression of specific markers signal for
mesenchymal stem cell lines.
Results: Cell populations in the second subculture are identified mesenchymal stem cells. It is the cell
adhesion to the surface of culture bottles, with morphology similar to fibroblasts. These cells differentiate into
osteoblasts and adipocytes in vitro conditions. These cells highly positive for the markers CD44, CD73, CD90
and CD105 and low expression of markers CD45 and HLA-DR.
Conclusion: Populations of cultured cells from the adipose tissue are mesenchymal stem cells. Since then,
the possible application of stem cells in research applications in medicine and tissue engineering.
Keywords: Mesenchymal stem cells, human adipose tissue, differentiation, mesenchymal stem cell markers
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc hiện nay
đang rất phát triển và đi vào nhiều lĩnh vực
nghiên cứu, từ các nghiên cứu khoa học cơ bản
cho đến các ứng dụng lâm sàng trong y học.
Nhiều loại tế bào gốc trong cơ thể đã được
nghiên cứu và triển khai ứng dụng. Hiện tại có
bốn nhóm tế bào gốc được quan tâm nghiên cứu:
tế bào gốc phôi, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc
tạo máu và tế bào gốc thần kinh. Mỗi nhóm tế
bào gốc có những ưu và nhược điểm riêng. Tế
bào gốc phôi được thu nhận từ khối tế bào bên
trong của phôi nang, có khả năng biệt hóa thành
mọi loại tế bào của cơ thể nhưng vấp phải các
rào cản về mặt đạo đức và luật pháp khi nghiên
cứu làm cho chúng trở thành đối tượng ít được
nghiên cứu mặc dù là loại tế bào gốc tiềm năng
nhất. Tế bào gốc tạo máu đã được nghiên cứu và
ứng dụng từ rất sớm nhưng chỉ có khả năng biệt
hóa thành các dòng tế bào máu cũng như tế bào
cơ trơn và nội mô, làm cho nguồn tế bào gốc này
hạn chế khi tiến hành nghiên cứu. Tế bào gốc
thần kinh cũng tương tự tế bào gốc tạo máu vì
chỉ có khả năng biệt hóa thành các tế bào thần
kinh. Do đó, chỉ còn có tế bào gốc trung mô
(Mesenchymal Stem Cells – MSC) thu nhận từ
mô trưởng thành như tủy xương, mô liên kết,
tuyến tiêu hóa hoặc các phần phụ của thai
như máu cuống rốn, cuống rốn(11)
MSC là các tế bào gốc đa tiềm năng, có khả
năng tự đổi mới với khả năng biệt hóa thành
các tế bào thuộc dòng trung mô bao gồm
nguyên bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn
trong điều kiện in vitro và phát triển thành mô
xương, mỡ và sụn trong in vivo(5,11). Do có tiềm
năng biệt hóa kết hợp với việc dễ dàng phân
lập và nuôi cấy làm cho các MSC trở thành
nguồn tế bào gốc ứng dụng rất quan trọng
trong công nghệ mô và y học tái tạo. Mặc dù
các MSC có rất nhiều tiềm năng ứng dụng
nhưng chúng là quần thể tế bào rất hiếm,
chiếm khoảng 0.001%-0.01% của toàn bộ tế bào
đơn nhân tủy xương(5,11). Do đó, MSC cần phải
có một quy trình thu nhận phù hợp để phát
triển in vitro trước khi có những ứng dụng(4).
Trong số các nguồn mô dùng để thu nhận
MSC, nổi bật nhất là mô mỡ vì đây là loại mô
có các đặc điểm thuận lợi khi tiến hành thu
nhận, nghiên cứu và ứng dụng: thứ nhất, việc
thu nhận mô mỡ là đơn giản, ít xâm lấn nên ít
gây đau đớn cho bệnh nhân so với việc thu
nhận tủy xương. Thứ hai, mô mỡ có chứa các
tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào nội mô,
nguyên bào sợi và đặc biệt là các MSC(3).
Các MSC này dễ dàng phân lập, nuôi cấy và
tăng sinh in vitro và có thể cảm ứng biệt hóa
thành các tế bào của các dòng tế bào khác(1,10).
Thứ bà, mô mỡ chứa các MSC với tỉ lệ khá cáo,
mỗi gam mô mỡ chứa 105 MSC(6). Thứ tư, khả
năng đặc biệt lưu ý của các MSC thu từ mô mỡ
là tiềm năng biệt hóa của các tế bào này ít chịu
ảnh hưởng của người hiến mô(7).
Do đó, để có thể thu nhận và ứng dụng các
MSC từ mô mỡ một cách hiệu quả nên chúng tôi
tiến hành thực hiện nghiên cứu quy trình phân
lập, nuôi cấy và xác định các MSC từ mô mỡ
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 461
người. Từ đó, có thể sử dụng các MSC cho các
nghiên cứu tiếp theo và triển khai ứng dụng
trong các liệu pháp tế bào, y học tái tạo và công
nghệ mô.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Sỏi được tán với Holmium: YAG LASER
200micron: SPHINX 30, tán nát sỏi hoàn toàn.
Sau đó bơm rửa sỏi với quan sát máy soi và C-
Arm. Cuối cùng đánh giá tỉ lệ sạch sỏi dưới C-
Arm và siêu âm. Rút kim và đặt thông mono- J
vào bể thận.
Đối tượng nghiên cứu
Mô mỡ người được thu nhận từ việc chọc
hút mỡ hoặc các mô mỡ thừa được thu nhận từ
các quy trình phẫu thuật. Mẫu mô được thu
nhận từ các người hiến khỏe mạnh, đồng ý hiến
mô để tiến hành nghiên cứu và có các xét
nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và VDRL.
Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm được thực hiện là phương pháp
thực nghiệm mô tả
Thu nhận mô mỡ
Mẫu mô được thu nhận trong điều kiện vô
trùng của phòng mổ. Sau đó giữ mẫu trong môi
trường vận chuyển gồm: Môi trường
DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml)
và nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm.
Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ
Mô mỡ được đặt trong đĩa petri sạch và rửa
với dung dịch PBS có chứa penicillin
/Streptomycin. Bổ sung môi trường nuôi cơ bản
(môi trường DMEM/F12, FBS (10%),
Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm),
NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D-Panto (17
μm), penicillin (100U/ml) and streptomycin (0.1
mg/ml)) vào đĩa, loại bỏ phần mô liên kết thừa
và rửa sạch máu.
Cắt nhỏ mẫu mô và chuyển tất cả vào tube
50 ml có nắp đậy, bổ sung hỗn hợp enzyme
Dispase-Collagenase (với tỉ lệ 3:1, v/v), mẫu mô
được ủ ở nhiệt độ 370C, trong thời gian 90 phút.
Sau đó, ly tâm thu nhận phần cặn lắng ở đáy
chai. Bổ sung môi trường nuôi cơ bản vào tube
và huyền phù phần cặn lắng ở đáy chai. Lọc
phần dịch tế bào qua phễu lọc tế bào (cell strainer,
BD FalconTM) với đường kính 70 μM.
Quay li tâm phần dịch tế bào và thu phần
cặn lắng ở đáy chai. Sau đó, bổ sung dung dịch
ly giải hồng cầu để loại bỏ hồng còn lẫn tạp
trong dịch tế bào, để yên trong khoảng 10 phút
để loại bỏ hồng cầu. Sau đó, quay li tâm phần
dịch tế bào và thu phần cặn lắng ở đáy chai. Bổ
sung môi trường nuôi cơ bản và huyền phù
phần cặn lắng, đánh giá mật độ tế bào bằng cách
nhuộm với dung dịch Trypan blue và đếm tế
bào bằng buồng đếm Neubauer. Tế bào được
nuôi trong chai nuôi T-25 cm2 và ở nhiệt độ 370C
và 5% CO2.
Định danh tế bào gốc trung mô
Theo tổ chức The International Society for
Cellular Therapy đưa ra các nguyên tắc chung
để xác định một loại tế bào gốc là MSC cần phải
thỏa 3 điều kiện sau: thứ nhất, các MSC phải là
các tế bào có khả năng bám dính khi tiến hành
nuôi cấy trên bề mặt chai nuôi. Thứ hai, phải có
khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương, tế
bào mỡ hoặc tế bào sụn trong điều kiện in vitro.
Thứ ba, các tế bào này phải biểu hiện được các
marker bề mặt như CD105, CD73 và CD90,
không biểu hiện các marker như CD45, CD34,
CD14 và HLA-DR(2). Dựa theo các tiêu chuẩn
trên, chúng tôi đánh giá các tế bào bào nuôi cấy
từ mô mỡ là các MSC.
Để đánh giá khả năng bám dính và phát
triển trên bề mặt chai nuôi. Quan sát tế bào dưới
kính hiển vi đảo ngược và nhuộm tế bào bằng
thuốc nhuộm Giemsa để quan sát hình thái và
khả năng bám dính của tế bào.
Để khảo sát tiềm năng biệt hóa của tế bào,
tiến hành thu nhận tế bào kể từ sau lần cấy
chuyền thứ hai. Các tế bào này sẽ được thử
nghiệm để cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào
xương và tế bào mỡ.
Quy trình biệt hóa thành nguyên bào xương
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 462
từ các tế bào gốc mô mỡ như sau: tế bào sau lần
cấy chuyền thứ hai được chuyển lên một chai
nuôi mới và sau một ngày nuôi cấy được thay
bằng môi trường cảm ứng tạo nguyên bào
xương gồm DMEM/F12, 10% FBS, 10-7M
Dexamethasone, 10mM/ml -Glycerol
phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml
FGF9, 10-7M vitamin D2 và kháng sinh(8).
Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy sẽ được quan
sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá sự
thay đổi về mặt hình thái. Tiến hành nhuộm
Alizarin Red (AR), Von Kossa (VK) để đánh giá
khả năng tạo chất nền xương và Alkaline
phosphatase (AP) để đánh giá hoạt tính enzyme
đặc trưng cho tế bào xương. Ngoài ra, thực hiện
phản ứng RT-PCR để khảo sát sự biểu hiện gien
Osteocalcin (là một trong những gien hiện tại
được sử dụng để xác định cho tế bào xương).
Quy trình biệt hóa thành tế bào mỡ từ các tế
bào gốc mô mỡ như sau: tế bào sau lần cấy
chuyền thứ hai được chuyển lên một chai nuôi
mới và sau một ngày nuôi cấy được thay bằng
môi trường cảm ứng tạo tế bào mỡ gồm
DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine
(50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM),
Biotin (33μm), D-Panto (17 μm), Human insulin
(66 nM), Triiodo-L-thyronine (1nM), Human
transferrin (10μg/ml)(9).
Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy sẽ được quan
sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá sự
thay đổi về mặt hình thái. Tiến hành nhuộm Oil
Red O để đánh giá sự tích tựu các giọt lipid bên
trong tế bào và nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh
quang Nile Red (là một trong các phương pháp
nhuộm đặc hiệu hiện tại được sử dụng để xác
định cho tế bào mỡ).
KẾT QUẢ
Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ
Hình 1: Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ. (A) Tế bào bắt đầu tăng trưởng sau 2 ngày nuôi
cấy. (B) Tế bào tăng trưởng sau 7 ngày nuôi cấy. (C) Tế bào được nhuộm với thuốc nhuộm giemsa sau
10 ngày nuôi cấy.
Các tế bào sau khi phân lập từ mô mỡ bắt
đầu xuất hiện và bám dính sau hai ngày nuôi cấy
trong môi trường nuôi cơ bản. Các tế bào ở
dạng riêng lẻ, có hình dạng thon, dài giống
với hình thái của nguyên bào sợi. Những tế
bào này bám dính trên đáy chai nuôi. Sau
một tuần nuôi cấy, các tế bào này tăng
trưởng và phát triển mạnh, tạo thành các
cụm (CFU) trên chai nuôi. Sau 14 ngày nuôi
cấy, các tế bào này đạt đến mật độ phù hợp
để cấy chuyền (chiếm khoảng 75-80% diện
tích bề mặt chai nuôi).
Định danh tế bào gốc mô mỡ
Dựa vào khả năng biệt hóa của tế bào gốc từ
mô mỡ
Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành nguyên
bào xương
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 463
Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào
bằng môi trường tạo xương, tế bào bắt đầu
thay hình thái từ hình dạng thon dài giống
với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt đầu
xuất hiện dạng hình thái đa diện và chế tiết
chất nền xương. Trong chai nuôi xuất hiện
các nốt xương là dạng kết tựu chất nền
xương đặc trưng trong in vitro. Sau 14 ngày
nuôi cấy, các tế bào này biểu hiện được
protein của chất nền xương là Osteocalcin
cũng như biểu hiện được enzyme đặc trưng
là AP.
Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành tế bào mỡ
Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào
bằng môi trường tạo tế bào mỡ, tế bào bắt
đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài
giống với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt
đầu xuất hiện dạng hình tròn, bên trong bào
tương bắt đầu xuất hiện các hạt lipid nhỏ.
Sau đó, bên trong bào tương tế bào các hạt
lipid tiếp tục kết tựu vào nhau để tạo thành
các hạt lipid lớn hơn và chiếm gần hết bào
tương tế bào, nhân tế bào bị đẩy ra phía
ngoại vi. Tiến hành nhuộm Oil Red O, các tế
bào dương tính xuất hiện với bên trong chứa
rất nhiều hạt lipid màu đỏ và nhuộm Nile
Red cho thấy các hạt lipid hình thành bên
trong bào tương của tế bào rất nhiều khi so
sánh với tế bào đối chứng không cảm ứng
biệt hóa tạo tế bào mỡ (hình 3).
A B
C D
E
Hình 2: Biệt hóa tế bào gốc từ
mô mỡ thành nguyên bào
xương. (A) mẫu tế bào chưa biệt
hóa. (B) nhuộm VK. (C) nhuộm
AP. (D). Nhuộm AR. Tất cả
nhuộm đều dương tính với thuốc
nhuộm (vật kính X10). (E) Thực
hiện phản ứng RT-PCR với gien
Osteocalcin (khung màu trắng)
biểu hiện trong cả hai mẫu
nghiên cứu (OST1; OST2) khi so
sánh với mẫu chứng (MSC).
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 464
Dựa vào khả năng biểu hiện các marker bề
mặt
Tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai, sẽ
được thu nhận bằng enzyme Trypsin-EDTA
(0.25% - 0.02%). Sau đó, tế bào sẽ được thu
nhận bằng cách quay ly tâm ở tốc độ 3000
vòng/phút trong 5 phút. Tế bào sẽ được rửa
2 lần với dung dịch PBS để tinh sạch và để
tách tế bào thành các tế bào đơn nhằm phục
vụ cho đánh giá tế bào kỹ thuật Flow
Cytometry (đếm tế bào dòng chảy). Kết quả
cho thấy, quần thể tế bào khảo sát biểu hiện
một số marker gồm CD105, CD73, CD90,
CD45, CD34, CD14 và HLA-DR. Trong đó, các tế
bào này được thực hiện phản ứng lặp lại 3 lần
với kết quả cho trong bảng 1. Sự biểu hiện của
các marker được thực hiện trong hình 4.
Bảng 1: Kết quả khảo sát sự biểu hiện của các marker
từ quần thể tế bào gốc mô mỡ
STT Loại CD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị
trung bình
(%)
Độ lệch
chuẩn (%)
1 CD73 97.70 97.33 97.44 97.49 0.19
2 CD90 99.46 99.64 99.66 99.59 0.11
3 CD105 99.36 99.31 99.24 99.30 0.06
4 CD44 99.46 99.46 99.6 99.51 0.08
5 HLA-DR 0.31 0.31 0.23 0.28 0.05
6 CD45 0.26 0.25 0.22 0.24 0.02
Hình 3: Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ
thành tế bào mỡ. (A). Tế bào đối
chứng. (B). Sau 7 ngày nuôi trong môi
trường biệt hóa, tế bào thay đổi hình
dạng và bào tương bắt đầu tích trữ
lipid. (C). Sau 14 ngày, càng nhiều tế
bào chuyển dạng thành tế bào mỡ và
giọt lipid kết tựu vào nhau nhiều hơn.
(D). Tế bào nhuộm Oil Red, trong bào
tương giọt lipid nhuộm màu đỏ của
thuốc nhuộm. (E). Các giọt lipid xuất
hiện đầy trong bào tương và có xu
hướng kết tựu vào nhau.
A
E
C B
D
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 465
Hình 4: Kết quả nhuộm Nile Red để xác định tế bào mỡ sau khi biệt hóa. (A). Mẫu tế bào đối chứng. (B).
Mẫu MSC sau khi cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ, kết quả cho thấy bên trong bào tương tế bào xuất hiện rất
nhiều các giọt lipid bắt màu đỏ cam, các giọt lipid này hiện diện trong hầu hết bào tương tế bào, nhân tế bào bị đẩy
lệch về một phía do sự tích tựu giọt lipid.
Hình 5: Kết quả phân tích marker cho quần thể tế bào
gốc từ mô mỡ. Kết quả phân tích cho thấy, quần thể tế bào
âm tính hoàn toàn với các marker CD45 và HLA-DR (biểu
hiện dương tính không quá 2%). Tế bào dương tính hoàn
toàn với các marker CD44, CD73, CD90 và CD105 (biểu
hiện dương tính trên 95%).
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 466
KẾT LUẬN
Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ
đã phân lập và nuôi cấy sau lần cấy chuyền thứ
hai. Chúng tôi đã đánh giá các chỉ tiêu để xác
định cho MSC, kết quả cho thấy các tế bào nuôi
cấy đều là các tế bào bám dính trên chai nuôi, có
hình dạng thon dài đặc trưng cho tế bào gốc
trung mô. Thứ hai, quần thể tế bào này có khả
năng biệt hóa được thành 2 dòng tế bào khác
nhau thuộc nguồn gốc trung mô đó là nguyên
bào xương và tế bào mỡ với phương pháp xác
định đáng tin cậy chứng tỏ tế bào có khả năng
biệt hóa được thành các dòng tế bào khác. Thứ
ba, chúng tôi đã khảo sát sự biểu hiện của các
marker dùng để xác định cho quần thể MSC từ
mô mỡ, kết quả cho thấy tế bào dương tính khá
cao (trên 95%) với các marker được CD73, CD90
và CD105. Đây là ba marker phổ biến được chấp
thuận để xác định cho các MSC. Các tế bào này
biểu hiện rất thấp dưới 2% các marker CD45 và
HLA-DR. Như vậy, với kết quả khảo sát khả
năng bám dính, tiềm năng biệt hóa và sự biểu
hiện các marker bề mặt cho thấy quần thể tế bào
nuôi cấy chính là các MSC. Đây là nguồn tế bào
gốc rất quan trọng và tiềm năng cho các ứng
dụng lâm sàng. Tuy nhiên, để có thể ứng dụng
các tế bào này một cách an toàn và hiệu quả, cần
thực hiện thêm các thí nghiệm khác để khảo sát
sự an toàn về mặt di truyền khi thực hiện các
nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng như tiềm năng
biệt hóa của tế bào theo thời gian nuôi cấy và số
lần nhân đôi thế hệ, để từ đó có thể sử dụng các
tế bào này trong các điều trị góp phần nâng cao
chất lượng điều trị cho người bệnh.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Coleman SR (2006). Structural fat grafting: more than a
permanent filler. Plast Reconstr Surg. 118:108S-120S.
2. Dominici M et al (2006). Minimal criteria for defining
multipotent mesenchymal stromal cells. The international
Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy.
8:315-317.
3. Katz AJ, Mesenchymal cell culture: Adipose tissue. In: Atala
A, Lanza R (2002) Method of Tissue Engineering. Academic
Press San Diego.
4. Locke M, Windsor J, Dunbar PR (2009), Human adipose-
derived stem cell: isolation, characterization and application
in surgrey, ANZ Surgrey Journal, 79:235-244.
5. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al (1999). Multilineage
potential of adult human mesenchymal stem cell. Science;
284:143-147.
6. Sen A et al (2001). Adipogenic potential of human adipose
derived stromal cells from multiple donors is heterogenous. J
Cell biochem. 81:312-319.
7. Strem BM et al (2005). Multipotential differentiation of
adipose tissue-derived stem cells. The Keio journal of medicine,
54:132-141.
8. Tran CT, Gargiulo C, Huynh DT, Huynh MT, Filgueira L and
Strong DM (2011). Culture and differentiation of osteoblasts
on coral scafford from human bone marrow mesenchymal
stem cells. Cell and Tissue Banking. 12:247-261.
9. Tran CT, Huynh DT, Nguyen PT, C Gargiulo C and Phan KN,
et al (2010). In vitro culture and differentiation of osteoblasts
from human umbilical cord blood. Cell and Tissue Banking.
11:269-280.
10. Wolter TP, Von Heimburg D, Stoffels I et al (2005).
Cryopreservation of mature human adipocytes: In vitro
measurement of viability. Ann Plast Surg. 55:408-413.
11. Zuk P.A, Zhu M, Ashjian P. et al (2002), Human adipose tissue
is a source of multipotent stem cells, Molecular Biological Cell,
13:4279-4295.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- nghien_cuu_quy_trinh_thu_nhan_te_bao_goc_trung_mo_tumo_mongu.pdf