Nghiên cứu sự biểu hiện CD64 trên quần thể Neutrophil của nhóm người bình thường và nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 63 NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN CD64 TRÊN QUẦN THỂ NEUTROPHIL CỦA NHÓM NGƯỜI BÌNH THƯỜNG VÀ NHÓM BỆNH NHÂN CÓ BỆNH CẢNH NHIỄM TRÙNG Hà Thị Thu*, Trần Thị Mỹ Hạnh**, Nguyễn Văn Lộc**, Nguyễn Phương Liên*** TÓM TẮT Mục tiêu ngiên cứu: Phân tích sự biểu hiện của CD64 trên quần thể neutrophil của nhóm người bình thường và nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng để đánh giá ý nghĩa của dấu ấn này trong việc chẩn đoán nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả hàng loạt ca. Sử dụng panel CD14 – FITC, CD64 – PE và CD45 – PerCP và quy trình ly giải – không rửa để nhuộm và xử lý 123 mẫu máu toàn phần của 2 nhóm đối tượng nghiên cứu: nhóm người bình thường và nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng, được chỉ định cấy máu. Sau đó thực hiện phân tích mẫu trên hệ thống máy Flow Cytometry – BD FACSCanto II để thu nhận giá trị CD64 – MFI. Kết quả nghiên cứu: Trong cả 2 nhóm đối tượng nghiên cứu thì chỉ số CD64 – MFI trên neutrophil luôn cao hơn so với lympho và thấp hơn so với trên mono. CD64 – MFI trên neutrophil của nhóm 73 bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng (Median: 1012; IQR: 651 – 1543) cao hơn một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,001) so với nhóm 50 người bình thường (Median: 385; IQR: 329 – 452). Mặt khác, giá trị MFI – CD64 trên neutrophil của nhóm cấy máu dương (Median: 892; IQR = 703 – 1269) và cấy máu âm (Median: 1118; IQR: 635 – 1642) không có sự khác biệt ý nghĩa. Với giá trị ngưỡng cut-off là bách phân vị thứ 90 của CD64 – MFI trên neutrophil của nhóm người bình thường là 482, 90,9% mẫu trong nhóm cấy máu dương và 92,2% mẫu trong nhóm cấy máu âm có giá trị cao hơn ngưỡng cut-off. Kết luận: Trong panel phân tích thì quần thể mono được xem là nội chứng dương còn lympho là nội chứng âm. CD64 trên neutrophil của nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng đã tăng đáng kể so với nhóm bình thường. Điều này chứng tỏ CD64 trên neutrophil là một dấu ấn tiềm năng để chẩn đoán nhiễm trùng hay nhiễm trùng huyết. Tuy nhiên, cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá đồng thời giá trị CD64 trên neutrophil và các xét nghiệm khác như tổng bạch cầu, CRP, procalcitonin cũng như các dấu hiệu lâm sàng để xác định được ngưỡng cut-off tối ưu của CD64 trên neutrophil và đánh giá việc sử dụng dấu ấn này để chẩn đoán sớm nhiễm trùng hay nhiễm trùng huyết. Từ khóa: nhiễm trùng, nhiễm trùng huyết, CD64, MFI, neutrophil, flow cytometry ABSTRACT CD64 EXPRESSION ON NEUTROPHILS OF NORMAL HEALTHY AND SUSPECTED INFECTION SUBJECTS Ha Thi Thu, Tran Thi My Hanh, Nguyen Van Loc, Nguyen Phuong Lien * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - No 2 - 2014: 63 - 70 Objective: Study the expression of surface marker CD64 on neutrophil in healthy and infection or sepsis suspected subjects and determine the utility of neutrophil CD64 as a diagnostic marker for sepsis or infection. Materials and methods: Case series. Whole blood of 123 subjects in 2 study groups, healthy and infection * Trường ĐH Quốc Tế - ĐH Quốc Gia Tp.HCM, ** BV Nhân Dân 115, *** BV. Truyền Máu - Huyết Học Tác giả liên lạc: Hà Thị Thu ĐT: 0985 339 661 Email: hathu.546@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 64 suspected group were stained with 3-color reagent panel: CD14 – FITC, CD64 – PE and CD45 – PerCP and processed by Lyse – No Wash procedure. Prepared samples were then analyzed on Flow Cytometer system – BD FACSCanto II to get results of CD64 – MFI. Results: In both 2 study groups, CD64 – MFI on neutrophils was always higher than on lymphocytes but lower than on monocytes. The CD64 expression on neutrophil between 50 subjects of no - infection and 73 subjects of suspected - infection groups was proven to have a statistically significant change with the interquatile range of 329 – 452 (median 385) and 651 – 1543 (mean 1012) accordingly (P < 0.001). On the other hand, there is no significant difference between MFI – CD64 on neutrophil of positive blood culture patient group (Median: 892; IQR = 703 – 1269) and negative blood culture patient group (Median: 1118; IQR: 635 – 1642). As compared to cut off value, 482, determined from 90th percentile of MFI – CD64 on neutrophil of healthy group, 90.9% of samples in positive blood culture group and 92.2 of samples in negative blood culture group presented MFI – CD64 higher than cut-off value. Conclusion: In panel analyzed, monocyte population is considered as positive internal control whereas lymphocyte works as negative internal control. For CD64 expression on neutrophil, infection group presented statically significant increase in comparison to healthy group. This result might prove that neutrophil CD64 will be a very promising infection biomarker. However, validation in large studies to define strict cut-off value and to see the correlation between CD64 assay and other infection tests is required before neutrophil CD64 can be recommended as an infection biomarker for routine use for infection or sepsis diagnosis. Keywords: infection, sepsis, CD64, flow cytometry, neutrophil ĐẶT VẤN ĐỀ Cho đến nay, kết quả của các nhà điều tra dịch tễ học cho thấy nhiễm trùng hoặc nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn vẫn là những nguyên nhân chính gây tử vong tại các khoa điều trị tích cực (11,15,11). Phương pháp nuôi cấy vi sinh vẫn được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong chuẩn đoán nhiễm trùng nhưng xét nghiệm này thường có kết quả âm tính giả khi bệnh nhân đã được sử dụng kháng sinh từ trước(6,9,11,16). Mặt khác, thời gian có kết quả vi sinh thường khá dài, trung bình 48 – 72 giờ(1,1,17). Những xét nghiệm khác như tổng số bạch cầu và định lượng CRP (C – reactive protein) thường được sử dụng trong chẩn đoán nhiễm trùng cũng có độ đặc hiệu không cao(1,15,1). Ngoài ra, CRP còn được xem như là một dấu ấn “muộn” vì chỉ số này thường tăng chậm và đạt giá trị cao nhất ở khoảng thời điểm 36 giờ sau khi tiếp xúc với nội độc tố(17). Mặc dù, trong những năm gần đây, Procalcitonin (PCT), được đánh giá cao trong chẩn đoán phân biệt các trường hợp viêm nhiễm do vi khuẩn hay do các tác nhân khác nhưng nhiều tác giả trên thế giới vẫn còn tranh cãi về giá trị của trị số này(15,16). Vì vậy, việc tìm kiếm các dấu ấn khác có độ nhạy, độ đặc hiệu cao để chẩn đoán sớm nhiễm trùng là rất cần thiết và quan trọng để bảo đảm hiệu quả cho việc điều trị. Trong những năm gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới tập trung vào việc đánh giá việc sử dụng kháng nguyên CD64 trên bề mặt tế bào neutrophil để chẩn đoán nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết. Riêng tại Việt Nam thì theo chúng tôi được biết chưa có công trình nghiên cứu nào liên quan đến giá trị của dấu ấn này trong mối tương quan với bệnh nhiễm trùng hoặc nhiễm trùng huyết được công bố. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài này để khảo sát sự biểu hiện của CD64 trên quần thể tế bào neutrophil của nhóm người bình thường và nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng nhằm đánh giá ý nghĩa của chỉ số này trong việc chẩn đoán nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 65 Mục tiêu chuyên biệt - Xác định giá trị CD64 – MFI trên các quần thể Lympho, mono để đánh giá vai trò của 2 quần thể này trong panel nghiên cứu và phân tích. - Xác định giá trị CD64 – MFI trên neutrophil của nhóm người bình thường. Qua đó, xác định được giá trị ngưỡng cut-off của chỉ số này. - So sánh sự biểu hiện của CD64 trên neutrophil trong nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng với nhóm người bình thường. - Đánh giá mối tương quan của chỉ số CD64 trên neutrophil với việc chẩn đoán nhiễm trùng hoặc nhiễm trùng huyết dựa trên giá trị cut-off đã xác định. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Gồm 2 nhóm - Nhóm 01: người bình thường, không có bệnh cảnh nhiễm trùng. - Nhóm 02: bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng như sốt và/ hoặc có ổ nhiễm trùng, được chỉ định cấy máu và được theo dõi điều trị tại BV 115. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mô tả hàng loạt ca. Phương pháp tiến hành: Lấy máu Mẫu máu toàn phần sử dụng cho nghiên cứu đánh giá CD64 được lấy cùng thời điểm lấy máu làm xét nghiệm cấy máu và được lưu trữ trong ống có chứa chất chống đông EDTA. Cấy máu Mẫu máu được cấy trên hệ thống BD Bactec 9120 (Becton and Dickinson Company, USA). Hình 1: Khoanh vùng phân tích các quần thể tế bào bạch cầu. a) Đồ thị FSC – SSC: loại bỏ nhiễu và quần thể tế bào eosinophil tự phát quang. b) Đồ thị SSC – CD14 FITC: khoanh vùng quẩn thể mono, dương tính với CD14 FITC. c) Đồ thị SSC – CD45 PerCP sau khi đã loại bỏ quần thể mono: khoanh vùng quần thể neutrophil (SSC cao và CD45 dương) và quần thể lympho (SSC thấp và CD45 dương tính mạnh). d) Đồ thị SSC – CD64 PE: sự biểu hiện của CD64 trên cả 3 quần thể mono, neutrophil và lympho và giá trị MFI trên kênh màu PE tương ứng. Xử lý mẫu phân tích trên hệ thống máy Flow Cytometry + Mẫu người bình thường hoặc bệnh nhân: ủ 50 µl mẫu máu người bình thường hoặc bệnh Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 66 nhân được chống đông bằng EDTA với 10 µl mỗi loại thuốc thử có bản chất là các kháng thể đơn dòng có đánh dấu huỳnh quang gồm CD14 – FITC, CD64 – PE và CD45 – PerCP (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) trong điều kiện tránh ánh sáng ở nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. Sau thời gian 15 phút ủ mẫu với thuốc thử, thực hiện ly giải hồng cầu với 450 µl dung dịch BD FACSLysing 1X (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) trong 15 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng. Sau đó thực hiện chạy mẫu trên hệ thống máy Flow Cytometry. + Mẫu chứng âm để xác định tín hiệu nền của kênh PE khi không nhuộm với CD64 – PE: chuẩn bị tương tự như quy trình trên nhưng chỉ sử dụng 2 thuốc nhuộm CD14 – FITC và CD45 – PerCP để ủ mẫu. Thu thập và phân tích mẫu trên hệ thống Flow Cytometry Thu thập và phân tích trên phần mềm FACSDiva 6.0 của hệ thống máy Flow Cytometry BD FACSCanto II 06 màu (Becton and Dickinson Company, USA) tại phòng Dấu Ấn Miễn Dịch của BV Truyền Máu Huyết Học TP.HCM. Quần thể tế bào Mono được xác định dựa trên kết quả dương tính với CD14 – FITC trên đồ thị CD14 – FITC và SSC (tín hiệu tán xạ bên tương ứng độ phức tạp của tế bào). Sau đó, khoanh vùng 02 quần thể Neutrophil và Lympho dựa trên đồ thị CD45 – PerCP và SSC. Cuối cùng, vẽ đồ thị SSC và CD64 – PE và thể hiện cả 03 quần thể Mono, Lympho và Neutrophil trên đồ thị và trên bảng dữ liệu thống kê tương ứng để xác định giá trị MFI của từng quần thể tế bào trên kênh màu PE. Phương pháp thống kê Thực hiện phân tích dữ liệu trên phần mềm SPSS 16.0. Tất cả các dữ liệu được thể hiện dưới dạng giá trị trung vị và khoảng tứ phân vị (IQR). Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình giữa các nhóm và với ống chứng âm (không nhuộm CD64 – PE) được đánh giá thông qua phép kiểm định thống kê Student và χ2 với giá trị P < 0,05. Định nghĩa biến số - MFI (median Fluorescence intensity): giá trị trung vị của cường độ huỳnh quang. Giá trị MFI càng lớn khi tín hiệu huỳnh quang trên kênh màu huỳnh quang đó càng lớn và ngược lại. - IQR (interquartile range): khoảng tứ phân vị từ tứ phân vị thứ 1 đến tứ phân vị thứ 3 (khoảng cách từ bách phân vị thứ 25 đến bách phân vị thứ 75). KẾT QUẢ Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu Bảng 1: Đặc điểm chung về tuổi và giới tính của quần thể nghiên cứu Nhóm bình thường Nhóm bệnh cảnh nhiễm trùng N 50 73 Tỉ số Nam/Nữ 1:1,17 1,08:1 Tuổi trung bình 41 ± 26 46 ± 34 - Tổng số lượng mẫu trong nghiên cứu thực hiện: 123 mẫu, trong đó: + Nhóm người bình thường: 50 mẫu. + Nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng 73 mẫu được chỉ định cấy máu, gồm: Nhóm cấy máu dương tính: 22/73 mẫu. Nhóm cấy máu âm tính: 51/73 mẫu. - Tỉ số nam/nữ ở cả 2 nhóm tương đương nhau và không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê (~1:1). - Đối tượng nghiên cứu là người trưởng thành có độ tuổi trong khoảng 15 – 84 tuổi, với độ tuổi trung bình là 41 ± 26 tuổi (nhóm 01) và 46 ± 34 tuổi (nhóm 02). Độ tuổi khảo sát trên 2 nhóm quần thể nghiên cứu không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê. Kết quả giá trị MFI nền trên kênh huỳnh quang PE của các ống chứng âm Bảng 2: Giá trị MFI kênh PE trên 20 ống chứng âm (không nhuộm hóa chất CD64 – PE) Quần thể MFI – Trung vị IQR Mono 182 162 – 203 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 67 Neutro 168 151 – 179 Lympho 141 117 – 165 Giá trị MFI của kênh màu huỳnh quang PE trên cả 3 quần thể Mono, Neutrophil và Lympho trong 20 ống chứng âm (mẫu chỉ nhuộm với CD45 – PerCP và CD14 – FITC, không nhuộm với CD64 – PE) không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê ( P > 0,05). Kết quả MFI của CD64-PE trên nhóm người bình thường Bảng 3: Giá trị CD64 – MFI trên Lympho, Neutrophil và Mono nhóm bình thường (n =50) CD64 MFI – trung vị IQR Mono_CD64 2218 1968 - 2626 Neutro_CD64 385 329 - 452 Lympho_CD64 198 168 - 215 Giá trị CD64 – MFI trên mono luôn đạt giá trị cao nhất, tiếp đến là neutrophil và cuối cùng, CD64 – MFI trên lympho là thấp nhất. Giá trị cut-off của CD64 trên neutrophil trong phạm vi đề tài được xác định dựa trên giá trị bách phân vị thứ 90 của CD64 – MFI trên neutrophil của nhóm người bình thường và bằng 482. Kết quả MFI của CD64-PE trên nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng Bảng 4: Giá trị MFI của CD64 - PE trên Lympho, Neutrophil và Mono nhóm bệnh (n=73). CD64 MFI - Trung vị IQR P (so sánh nhóm 01) Mono_CD64 4094 2988 – 6473 0,018 Neutro_CD64 1012 651 – 1543 < 0,001 Lympho_CD64 233 200 – 263 0,082 - Tương tự nhóm người bình thường, nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng cũng có kết quả CD64 – MFI trên mono đạt giá trị cao nhất, tiếp đến là neutrophil và cuối cùng trên lympho thì chỉ số này có giá trị thấp nhất. - Giá trị MFI của CD64 trên lympho không có sự khác biệt ý nghĩa trong cả 2 nhóm (P > 0,05) nhưng đối với quần thể mono và neutrophil thì chỉ số CD64 – MFI của nhóm bệnh cao hơn nhóm bình thường (P < 0,05). So sánh MFI của CD64 – PE trên neutrophil giữa nhóm cấy máu dương và nhóm cấy máu âm so với giá trị ngưỡng cut-off Ở cả 2 phân nhóm của nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng là nhóm cấy máu dương và nhóm cấy máu âm thì giá trị CD64 – MFI trên neutrophil đều cao hơn rõ rệt so với giá trị này của nhóm người khỏe mạnh. Tuy nhiên, giữa 2 phân nhóm thì không thấy sự khác biệt ý nghĩa (P = 0,082). Bảng 5: Kết quả MFI CD64 – PE trên neutrophil giữa 2 nhóm cấy máu dương và âm MFI trung vị IQR Nhóm cấy máu dương 892 703 – 1269 Nhóm cấy máu âm 1118 635 – 1642 Bảng 6: kết quả CD64 – MFI trên neutrophil so với giá trị ngưỡng ≥ Cut - off < cut-off Nhóm cấy máu dương (n = 22) 20/22 (90,9%) 02/22 (9,1%) Nhóm cấy máu âm (n = 51) 47/51 (92,2%) 04/51 (7,8%) BÀN LUẬN Theo một số báo cáo trên thế giới, sự biểu hiện của CD64 trên neutrophil của trẻ em và trẻ sơ sinh khỏe mạnh cũng như trẻ bị nhiễm trùng thường cao hơn so với nhóm người trưởng thành(8,18). Mặt khác, Hoffman và cộng sự cũng đã nhận định chỉ số CD64 nên được khảo sát riêng biệt giữa nhóm đối tượng trưởng thành và trẻ em để tránh sự dao động nhiều trong kết quả phân tích(8). Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tập trung khảo sát đối tượng người trưởng thành, trong đó bao gồm 50 người bình thường và 73 người có bệnh cảnh nhiễm trùng được chỉ định cấy máu. Độ tuổi trung bình của nhóm khảo sát là 44 tuổi, dao động trong khoảng 15 – 84 tuổi với tỉ lệ nam và nữ tương đương nhau. Ngoài ra, trong nhóm 73 bệnh nhân nghi ngờ có bệnh cảnh nhiễm trùng thì có 22 người có kết quả cấy máu dương tính và 51 người có kết quả cấy máu âm tính. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 68 Kết quả giá trị CD64 – MFI của quần thể lympho và mono trên 2 nhóm nghiên cứu Dựa vào bảng kết quả 3.3 và 3.4, chúng tôi nhận thấy: - CD64 trên lympho trong nhóm chứng khỏe mạnh và nhóm có bệnh cảnh nhiễm trùng đều có giá trị MFI rất thấp và không có sự khác biệt mang ý nghĩa thống kê của chỉ số này trong cả 2 nhóm với IQR của nhóm bình thường và nhóm bệnh nhân lần lượt là: 168 – 215 và 200 – 263 (P = 0,082). Mặt khác, giá trị của CD64 – MFI trên lympho ở 2 nhóm cũng không khác biệt so với giá trị nền của ống chứng âm (kết quả bảng 3.2). Do vậy, CD64 được coi là âm tính trên lympho và nhận định này hoàn toàn phù hợp với các nghiên cứu khác (3,8,7,11,15,18). - Ngược lại, trong cả 2 nhóm khảo sát, giá trị MFI của CD64 – PE trên quần thể mono đều luôn đạt giá trị cao nhất và cao hơn 10 – 20 lần so với giá trị MFI của CD64 – PE trên lympho cũng như so với giá trị nền (kết quả bảng 3.3). Điều này cho thấy CD64 luôn thể hiện dương tính mạnh trên quần thể mono và kết quả này tương thích với các nhận định của Hoffman (2010) và Hiesmayr MJ (1999). Ngoài ra, giá trị CD64 –MFI trên mono của nhóm bệnh nhân (IQR: 1968 – 2626) cao hơn so với nhóm chứng khỏe mạnh (IQR: 2988 - 6473) với P = 0,018. Kết quả này cho thấy, CD64 trên mono cũng được kích hoạt trong các trường hợp nhiễm trùng hay nhiễm trùng huyết. Tuy nhiên, theo Hiesmayr MJ cùng cộng sự(7), CD64 trên tế bào mono cũng tăng rất mạnh trong một số trường hợp sau phẫu thuật, do vậy theo các tác giả này, sự tăng biểu hiện của CD64 trên mono không đặc hiệu so với trên neutrophil và CD64-Mono thường chỉ được xem như là chứng dương trong khi CD64-Lympho được coi là chứng âm. Kết quả giá trị CD64 – MFI của quần thể neutrophil trên 2 nhóm nghiên cứu Theo kết quả bảng 3.3 và bảng 3.4, đối với quần thể neutrophil thì trên nhóm người bình thường, giá trị MFI của CD64 – PE trung vị là 385 (IQR: 329 - 452) nhưng giá trị này đã tăng đáng kể trên nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng với trị số trung vị của nhóm là 1012 (IQR: 651 - 1543). Như vậy, giữa nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng và nhóm chứng khỏe mạnh thì sự biểu hiện của CD64 trên quần thể tế bào neutrophil đã có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,001). Nhận định này tương thích với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới (3,6,9,9,10,111,13, 18). Kết quả này được giải thích dựa trên bản chất của CD64 – một trong những thụ thể Fc của IgG, đóng vai trò quan trọng trong các cơ chế gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể, xóa bỏ các phức hợp miễn dịch, trong hoạt động thực bào các kháng nguyên đã được opsonin hóa và điều hòa sự giải phóng các loại cytokine như IL-1, IL-6 và TNF-α. CD64 thường biểu hiện mạnh trên các tế bào mono và các đại thực bào, và hiện diện rất ít trên các tế bào neutrophil. Tuy nhiên, trong những trường hợp nhiễm trùng hay nhiễm trùng huyết thì neutrophil sẽ được kích hoạt vì đây là một trong những tế bào đầu tiên trong hệ thống miễn dịch tham gia vào quá trình chống các tác nhân lạ xâm nhiễm cơ thể và số lượng thụ thể CD64 sẽ tăng lên đáng kể để hỗ trợ neutrophil thực hiện hoạt động sinh lý quan trọng: thực bào(6,8,12). Theo nhiều tác giả trên thế giới thì sự biểu hiện của CD64 trên neutrophil sẽ tăng lên nhanh trong vòng 4 – 6 giờ sau khi tiếp xúc với một số thành phần vách tế bào vi khuẩn như lipopolysaccharide (LPS) và một số cytokine như interferon-γ (IFN-γ) hay tác nhân kích thích cụm tế bào bạch cầu hạt (Granulocyte colony- stimulating factor =G-CSF)(10,15,28,18). Giá trị ngưỡng cut-off của CD64 – MFI trên neutrophil dựa trên nhóm người bình thường Giá trị cut-off của CD64 trên neutrophil dựa trên đơn vị MFI đã được nhiều tác giả trên thế giới sử dụng như Dankilas (2008) và Dilli (2010). Ngoài ra, để thu nhận được chỉ số MFI này không đòi hỏi sử dụng các hạt bead chuẩn hay Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học 69 các phần mềm và hóa chất chuyên biệt khá đắt tiền như một số đơn vị khác, ví dụ số lượng phân tử/tế bào (8,13) và “CD64 index”(4,8). Mặt khác, để tính được giá trị cut-off tối ưu thì chúng tôi nên xây dựng đường cong ROC (Receiver operating characteristic) thể hiện độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm CD64 này đối với từng giá trị cut-off. Tuy nhiên, do đề tài nghiên cứu này chỉ giới hạn ở việc khảo sát giá trị CD64 dựa trên kết quả cấy máu và bệnh cảnh lâm sàng ban đầu mà chưa đánh giá và so sánh tương quan với các xét nghiệm khác và các chỉ tiêu lâm sàng khác để chẩn đoán nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết nên chúng tôi chưa xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm CD64 và vẽ ROC để xác định giá trị cut-off tối ưu. Do vậy, trong phạm vi đề tài, chúng tôi đã xác định giá trị cut-off dựa trên giá trị bách phân vị thứ 90 của CD64 – MFI trên neutrophil của nhóm người bình thường là 482. Tuy nhiên, giá trị cut-off này không tương ứng với giá trị cut-off mà Dankilas (2008) và Dilli (2010) đã đưa ra trong nghiên cứu của mình với trị số lần lượt là 2.8 và 87.7. Điều này được giải thích là do sự khác biệt về hệ thống máy phân tích (các loại máy Flow cytometer khác nhau) với độ phân giải tín hiệu tương ứng số kênh tín hiệu huỳnh quang khác nhau, thông số cài đặt ứng dụng và hóa chất sử dụng khác nhau. Do vậy, như Hoffman (2011) và G. Fjaertoft (2007) đã nhận định, giá trị ngưỡng trong nghiên cứu của các phòng Lab khác nhau sẽ do phòng Lab tự thiết lập, tối ưu và đánh giá. Giá trị CD64 – MFI trên neutrophil và mối tương quan với việc chẩn đoán nhiễm trùng hoặc nhiễm trùng huyết Theo kết quả bảng 3.3 và 3.5, cả 2 phân nhóm cấy máu dương và cấy máu âm trong nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng đều có giá trị CD64 – MFI trên neutrophil tăng một cách có ý nghĩa thống kê (P < 0,05) so với nhóm bình thường. Mặt khác, giữa 2 nhóm cấy máu dương và cấy máu âm, chúng tôi cũng không nhận thấy có sự khác biệt ý nghĩa về sự biểu hiện của CD64 trên quần thể neutrophil khi so sánh chỉ số CD64 – MFI. Kết quả này có thể được giải thích dựa theo nhiều yếu tố khác nhau. Thứ nhất, kết quả cấy máu có thể bị âm tính giả do bệnh nhân đã có sử dụng thuốc kháng sinh từ trước. Thứ hai, như một số tác giả nhận định, CD64 không chỉ bị kích hoạt đặc hiệu bởi vi khuẩn mà còn có thể vì virut, nấm, ký sinh trùng(8,9,13) mà kết quả cấy máu lại không phát hiện được các trường hợp nhiễm virut hay ký sinh trùng. Ngoài ra, CD64 trên neutrophil cũng đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nhận định là không chỉ trong những trường hợp nhiễm trùng huyết mà các trường hợp nhiễm trùng khu trú thì dấu ấn này cũng được kích hoạt đáng kể(8,13,10,15). Tuy trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa tính được độ nhạy, độ đặc hiệu cũng như chưa được xác định được ngưỡng cut-off tối ưu nhưng dựa vào kết quả bảng 3.6, chúng tôi cho rằng CD64 là một dấu ấn sinh học rất tiềm năng để chẩn đoán nhiễm trùng hay nhiễm trùng huyết. Mặt khác, có nhiều báo cáo với nhiều tác giả khác nhau trên thế giới cũng đưa ra nhận định tương tự trên và độ nhạy/ độ đặc hiệu của CD64 trên neutrophil mà họ xác định được trong chẩn đoán nhiễm trùng hoặc nhiễm trùng huyết có giá trị rất cao, ví dụ Hsu và cộng sự (89%/ 96%); Livaditi và cộng sự (95%/ 100%); Cardelli và cộng sự (96%/ 95%); Lobreglio và cộng sự (92%/ 100%). Do vậy, chúng tôi đề nghị cần thực hiện thêm các nghiên cứu tiếp theo trong đó có khảo sát đầy đủ các yếu tố về lâm sàng và các xét nghiệm thường quy khác như xác định tổng bạch cầu, CRP, Procalcitonin và kết hợp cùng chỉ số CD64 để có cơ sở kết luận chính xác và đánh giá hiệu quả của việc sử dụng dấu ấn này, dùng riêng lẻ hoặc dùng kết hợp với một xét nghiệm khác để tìm ra bộ dấu ấn có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, có giá trị chẩn đoán tốt, nhanh. KẾT LUẬN Trên cả nhóm người bình thường và nhóm bệnh nhân, CD64 âm tính trên quần thể lympho và dương tính mạnh trên mono nên lympho sẽ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Số 2 * 2014 70 được xem như là nội chứng âm còn mono là nội chứng dương. - Kết quả nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện CD64 trên quần thể tế bào neutrophil của nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh nhiễm trùng tăng một cách có ý nghĩa so với nhóm người bình thường: giá trị trung vị 1012 (IQR: 651 - 1543) so với 385 (IQR: 329 - 452) của nhóm chứng bình thường. - Với giá trị ngưỡng cut-off của CD64 trên neutrophil được xác định dựa trên giá trị phân vị thứ 90 là 482, trong nhóm bệnh nhân có bệnh cảnh lâm sàng, 90,9% mẫu trong nhóm cấy máu dương tính và 92,2% mẫu trong nhóm cấy máu âm tính có giá trị CD64 – MFI trên neutrophil vượt trên giá trị ngưỡng cut-off. Điều này cho thấy CD64 là một dấu ấn tiềm năng trong việc chẩn đoán sớm nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết. - Cần thực hiện các nghiên cứu tiếp theo để đánh giá đồng thời giá trị CD64 trên neutrophil và các xét nghiệm thường quy khác cũng như các yếu tố lâm sàng nhằm xác định được ngưỡng cut-off tối ưu, độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán âm và tiên đoán dương của CD64 riêng lẻ hoặy kết hợp với một xét nghiệm khác để tìm ra bộ dấu ấn hỗ trợ chẩn đoán nhanh, chính xác nhiễm trùng và nhiễm trùng huyết. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Adams SKK, Barlow G (2011). Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. J Antimicrob Chemother; 66 Suppl 2: 33 – 40. 2. Cardelli P, Ferraironi M, Amodeo R, Tabacco F, de Blasi RA, Nicoletti M, et al (2008). Evaluation of neutrophil CD64 expression and procalcitonin as useful markers in early diagnosis of sepsis. Int J Immunopathol Pharmacol; 21:43-9. 3. Danikas DD, Karakantza M, Theodorou GL, Sakellaropoulos GC, Gogos CA (2008). Prognostic value of phagocytic activity of neutrophils and monocytes in sepsis Correlation to CD64 and CD14 antigen expression. Clin Exp Immunol; 154:87-97. 4. Dilli D, Oguz ŞS, Dilmen Uu, et al. (2010). Predictive values of neutrophil CD64 expression compared with interleukin-6 and C-reactive protein in early diagnosis of neonatal sepsis. J Clin Lab Anal; 24:363-70. 5. Fjaertoft G, Håkansson L, Foucard T, Ewald U, Venge P (2005). CD64 Fcgamma receptor I cell surface expression on maturing neutrophils from preterm and term newborn infants. Acta Paediatr; 94:295-302. 6. Gerrits JH, McLaughlin PMJ, Nienhuis BN, Smit JW and Loef B (2013). Polymorphic mononuclear neutrophils CD64 index for diagnosis of sepsis in postoperative surgical patients and critically ill patients. Clin Chem Lab Med; 51(4): 897–905 7. Hiesmayr MJ, Spittler A, Lassnigg A, Berger R, Laufer G, Kocher A, et al (1999). Alterations in the number of circulating leucocytes, phenotype of monocyte and cytokine production in patients undergoing cardiothoracic surgery. Clin Exp Immunol 115: 315_23. 8. Hoffmann JJML (2011). Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemia Medica;21(3):282-90 9. Hsu KH, Chan MC, Wang JM, Lin LY, Wu CL (2011). Comparison of Fcgamma receptor expression on neutrophils with procalcitonin for the diagnosis of sepsis in critically ill patients. Respirol; 16:152-60. 10. Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al (2009) CD64 Index provides simple and predictive testing for detection and monitoring of sepsis and bacterial infection in hospital patients. Journal of Clinical Microbiology, p. 3914–3919 11. Lever A, Mackenzie I. (2007). “Sepsis: definition, epidemiology, and diagnosis”. BMJ, 335:879-883. 12. Livaditi O, Kotanidou A, Psarra A, Dimopoulou I, Sotiropoulou C, Augustatou K, et al (2006). Neutrophil CD64 expression and serum IL-8: sensitive early markers of severity and outcome in sepsis. Cytokine; 36:283-90. 13. Lobreglio GB, d’Aversa P, Leo L, Scolozzi S, Fiore G (2008). Quantitative expression of CD64 on neutrophil granulocytes as early marker of sepsis or severe infection. Haematologica; 93:21. 14. Marshall JC, Reinhart K. (2009). “Biomarkers of sepsis”. Critical Care Med. 37:2290-2298. 15. Nuutila J et al (2010). The novel applications of the quantitative analysis of neutrophil cell surface FcgammaRI CD64 to the diagnosis of infectious and inflammatory diseases. Curr Opin Infect Dis; 23:268-74. 16. Pierrakos C, Vincent JL (2010). Sepsis biomarkers: a review. Critical care. 14:R15. 17. Schmit X, Vincent JL (2008): The time course of blood C- reactive protein concentrations in relation to the response to initial antimicrobial therapy in patients with sepsis. Infection 2008, 36:213-219. 18. Vineet B, Chao W, et al (2008). “Hematologic Profile of Sepsis in Neonates: Neutrophil CD64 as a Diagnostic Marker”. America Academy of Pediatrics. 121:129-134. Ngày nhận bài báo: 02/01/2014 Ngày phản biện đánh giá bài báo: 07/03/2014 Ngày bài báo được đăng: 20/03/2014