Nghiên cứu xử lý và bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 459 NGHIÊN CỨU XỬ LÝ VÀ BẢO QUẢN DÀI NGÀY TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU Nguyễn Quang Tùng* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tế bào gốc tạo máu được thu gom từ dịch tủy xương, máu ngoại vi sau huy động bằng G-CSF và máu dây rốn. Các mẫu thu gom sẽ được xử lý loại bỏ hồng cầu và huyết tương để tiến hành bảo quản dài ngày. Mục tiêu: Đánh giá kết quả xử lý và bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máu. Đối tượng và phương pháp: Áp dụng kỹ thuật xử lý có dung dịch cao phân tử HES 6% để loại bỏ hồng cầu và huyết tương của 40 mẫu tế bào gốc, gồm 10 mẫu dịch tủy xương, 10 mẫu máu ngoại vi sau huy động và 20 mẫu máu dây rốn. Sau đó bảo quản các mẫu dài ngày trong nitơ lỏng và đếm tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản 3 tháng. Kết quả: Đã loại bỏ được 86,4% hồng cầu từ dịch hút tủy, 88,5% từ máu dây rốn, đồng thời tỷ lệ mất bạch cầu lần lượt là 13,5% và 8,3%. Hiệu quả thu hồi tế bào CD34 đạt 99,2% từ máu ngoại vi, 91,3% từ dịch tủy và 85,4% từ máu dây rốn. Tỷ lệ tế bào sống sau rã đông đạt cao trên 90% và tỷ lệ này giảm dần theo thời gian khi tiếp tục bảo quản sau rã đông ở 4 độ C. Kết luận: Quy trình xử lý và bảo quản dài ngày tế bào gốc tạo máu có hiệu quả cao, có thể ứng dụng tốt trên lâm sàng. Từ khóa: Tế bào gốc tạo máu, thu gom, xử lý, bảo quản, rã đông. ABSTRACT SAVE PROCESSING RESOURCES AND LONG – TERM PRESERVATION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS Nguyen Quang Tung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 4 - 2011: 459- 464 Introduction: Hematopoietic stem cell were collected from bone marrow (BMSC), G-CSF mobilizied peripheral blood (PBSC) and cord blood (CBSC). Stem cell products could be storaged for long term after processing for elimination red blood cell and plasma, which is remained in collected components. Purpose: To evaluate(1) the result of processing technics for eliminate RBC and plasma in the components, and(2) the result of long-term storage of those component in nitrogen liquid. Material and methods: Using centrifugation with hydroxyethyl starch (HES) 6% to eliminate RBC and plasma of 40 samples: 10 BMSC, 10 PBSC and 20 CBSC. Processed samples have been storaged for 3 months in nitrogen liquid, then the percentage of alive cells has been counted after thawing. Results: The percentage of red blood cell was removed from bone marrow, peripheral blood and cord blood products is 86.4% and 88.5%, simutanously, white blood cell loss is 13.5% and 8.3%. CD34 recovery is 99.2%, 91.3% and 85.4% from PBSC, bone marrow and cord blood components. After thawing, more than 90% of cells survived in the storaged products, however, the percentage of cell death is incrising gradually in 4oC. Conclusions: The tecnical protocol has been shown a very high efficiancy for processing samples after colletion, and those protocols could be useful also for storage of HSC components. Key words: Hematopoietic stem cell: HSC, BMSC, PBSC, CBSC, collection, processing, storage, thawing. * Trường Đại Học Y Hà Nội Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Quang Tùng ĐT: 0912.015.997 Email: bsquangtung@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 460 ĐẶT VẤN ĐỀ Ghép tế bào gốc tạo máu là phương pháp điều trị hiện đại, được sử dụng để điều trị cho các bệnh lý tạo máu và hiện đang mở rộng chỉ định cho các bệnh lý chuyên khoa khác: tim mạch, tiêu hóa, thần kinh, mắt và cơ xương khớp... Các tế bào gốc được thu gom chủ yếu từ tủy xương, từ máu ngoại vi sau huy động bằng yếu tố kích thích tạo máu (phổ biến nhất đến nay là yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt: Granulocyte-colony stimulating factor G- CSF) và từ máu dây rốn(2). Khi thu gom với mục đích ghép đồng loại, trong nhiều trường hợp, các chế phẩm cần phải được bảo quản dài hạn, như trong điều kiện –1960C, đến khi sử dụng. Để đảm bảo chất lượng bảo quản, các mẫu tế bào gốc cần được loại bỏ hồng cầu và huyết tương nhằm tránh ảnh hưởng đến chất lượng các tế bào được bảo quản, đồng thời giảm thể tích chất bảo quản cần phải sử dụng. Mặc dù máy tách tự động có thể được sử dụng để xử lý các mẫu sau thu gom, nhưng phương pháp thủ công rất phù hợp khi tiến hành xử lý các mẫu thể tích nhỏ mà không đòi hỏi các trang bị phức tạp, kỹ thuật tiến hành khá đơn giản và rất kinh tế, có thể triển khai được ở nhiều cơ sở để tạo điều kiện mở rộng ứng dụng tế bào gốc vào điều trị lâm sàng. Để đánh giá quá trình bảo quản dài ngày, các mẫu tế bào gốc cần phải được xác định chỉ số tế bào sống sót sau bảo quản và tỷ lệ các tế bào chết theo thời gian sau bảo quản. Thông tin này sẽ giúp ích cho việc sử dụng hợp lý các chế phẩm tế bào gốc trên lâm sàng. Hiện nay, nhu cầu sử dụng tế bào gốc trong điều trị ngày càng cao, phạm vi ứng dụng tế bào gốc đang được mở rộng nhanh chóng trong nhiều chuyên ngành. Chính vì vậy, việc nghiên cứu áp dụng thành công quy trình kỹ thuật phù hợp để xử lý các mẫu tế bào gốc cũng như xác định hiệu quả quá trình bảo quản dài hạn sẽ rất có giá trị để các cơ sở nghiên cứu, điều trị mạnh dạn triển khai các kỹ thuật này trên thực tế. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi - 10 đơn vị tế bào thu gom từ máu ngoại vi có huy động bằng Filgrastime (Leukokin, Hàn Quốc). Thu gom bằng máy tế bào tự động trên máy COBE-Spectra với bộ kít và quy trình chuẩn của hãng sản xuất (Gambro, Mỹ), theo quy trình đã mô tả(4). Các mẫu tuỷ xương và máu dây rốn: - 10 mẫu dịch hút tuỷ xương có thể tích trung bình 30 ml, thu gom từ gai chậu sau trên của những người cho tình nguyện, khoẻ mạnh, tuổi từ 22 đến 41. - 20 mẫu máu dây rốn có thể tích  90 ml, thu gom theo quy trình đã mô tả(8). Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ngang, mô tả hàng loạt trường hợp. Các kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu - Khảo sát thành phần và các chỉ số tế bào máu, số lượng tế bào CD34 của các mẫu nghiên cứu sau khi thu gom: + Các chỉ số tế bào máu được xác định trên máy đếm tế bào laser XT-2000i (Sysmex, Nhật Bản) tại Labo Tế bào-Tổ chức học, Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương. + Tế bào CD34 được xác định trên máy FACS Callibur (Becton-Dickinson, Mỹ) taị Khoa Huyết học, bệnh viện TW Quân đội 108. - Xử lý loại hồng cầu và huyết tương bằng kỹ thuật ly tâm, thực hiện tại Labo Miễn dịch-Di truyền, Viện Huyết học-Truyền máu Trung ương, theo quy trình đã mô tả. - Bảo quản các mẫu tế bào gốc ở điều kiện – 1960C (trong nitơ lỏng, sử dụng hệ thống bình bảo quản MVE, Mỹ) trong 3 tháng, sử dụng kỹ thuật hạ nhiệt độ theo chương trình có kiểm soát trên máy Krypton (Anh). - Rã đông, đánh giá tỷ lệ tế bào sống ngay tại thời điểm sau rã đông và theo thời gian kể từ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 461 khi rã đông trong điều kiện 4oC bằng phương pháp nhuộm với dung dịch xanh Trypan 0,4%. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kết quả loại hồng cầu và thu hồi bạch cầu Các mẫu tế bào gốc huy đông từ máu ngoại vi có số lượng hồng cầu rất thấp do đó chỉ cần ly tâm cô đặc và chuẩn bị dịch tế bào cho bảo quản. Sử dụng phương pháp ly tâm có dung dịch HES 6% loại hồng cầu và huyết tương với 10 mẫu dịch tuỷ xương và 20 mẫu máu dây rốn, kết quả như sau: Bảng 1. Kết quả xử lý mẫu dịch tủy xương và máu dây rốn Chỉ số Dịch tủy (n=10) Máu dây rốn (n=20) Tỷ lệ loại hồng cầu (%) 86,4 ± 7,1 88,5 ± 4,9 Tỷ lệ mất bạch cầu (%) 13,5 ± 8,6 8,3 ± 6,4 Tỷ lệ mất lymphô (%) 11,2 ± 5,7 5,1 ± 2,3 Tỷ lệ mất TBCN khác (%) 8,9 ± 7,2 6,3 ± 3,1 Tỷ lệ loại BCTT (%) 12,3 ± 6,8 14,6 ± 8,5 TBCN/ml sau xử lý 4,87 4,51 Nhận xét: Kết quả loại hồng cầu đạt cao trên 85% ở tất cả các mẫu dịch hút tủy và máu dây rốn, đồng thời, tỷ lệ mất bạch cầu thấp dưới 15%. Nồng độ tế bào có nhân sau xử lý đạt yêu cầu để bảo quản dài ngày. Hiệu quả thu hồi tế bào gốc Bảng 2. Tổng hợp kết quả thu hồi CD34 sau quá trình xử lý Chỉ tiêu Đơn vị Tủy xương (n = 10) Máu huy động (n = 10) Máu dây rốn (n = 20) % 0,29± 0,07 0,36 ± 0,07 0,12 ± 0,04 Trước xử lý 106/ml 7,29 ± 2,90 317,56 ± 57,4 1,45 ± 0,43 % 0,3 ± 0,12 0,84 ± 0,11 0,13 ± 0,05 Sau xử lý 106/ml 6,66 ± 2,31 316,24± 64,2 1,23± 0,46 Hiệu suất thu hồi CD34 % 91,3 ± 0,5 99,2 ± 0,2 85,4 ± 0,8 Nhận xét: Hiệu suất thu hồi CD34 đạt cao nhất ở các mẫu máu dây rốn (99,2%) và thấp nhất ở mẫu máu dây rốn (85,4%). Hiệu quả bảo quản dài ngày các mẫu tế bào gốc Tỷ lệ tế bào sống ngay sau rã đông Xác định kết quả bảo quản dài ngày các tế bào gốc từ các nguồn khác nhau trong điều kiện -1960 C, sử dụng phương pháp nhuộm màu bằng dung dịch xanh trypan 0,4%, thu được kết quả ngay khi rã đông tế bào như sau: Bảng 3. Tỷ lệ tế bào sống của các đơn vị tế bào gốc ngay sau rã đông Nguồn tế bào gốc n Giá trị trung bình Khoảng giá trị Từ tuỷ xương 10 91,5 ± 2,6 87 – 94 Từ máu ngoại vi 10 93,4 ± 1,7 92 – 97 Từ máu dây rốn 20 93,6 ± 1,4 91 – 96 Nhận xét: Ngay sau khi rã đông, tỷ lệ tế bào sống rất cao (trên 90%) trong tất cả các mẫu nghiên cứu và cả ba nguồn cung cấp tế bào gốc. Tỷ lệ tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông Xác định tỷ lệ tế bào sống sót theo thời gian kể từ sau khi rã đông ở nhiệt độ 4oC, kết quả cho thấy tỷ lệ này giảm chậm trong 15 phút đầu và giảm nhanh sau 30 phút (còn trung bình 82%) ở các mẫu nghiên cứu. Biểu đồ 1 cho thấy tỷ lệ tế bào sống sót ngay sau rã đông đạt cao trên 90% và giảm dần khi giữ ở điều kiện 4oC. Sau 1h, tỷ lệ tế bào sống sót vẫn còn đạt khoảng 80%. BÀN LUẬN Về kết quả loại hồng cầu, thu bạch cầu Quá trình xử lý các mẫu nghiên cứu sau thu gom, phương pháp ly tâm có kết hợp dung dịch cao phân tử lần đầu tiên được Rubinstein và cs(6) tiến hành và thu hồi được 91% bạch cầu. Nguyên lý của kỹ thuật dựa vào đặc tính của dung dịch HES 6% làm thay đổi điện thế xung quanh hồng cầu và làm các hồng cầu dính với nhau dạng “chuỗi tiền” do đó hằng số lắng tăng cao, hồng cầu lắng nhanh hơn, đặc biệt khi được ly tâm nhẹ. Quy trình này được một số tác giả nghiên cứu và thay đổi để có hiệu quả cao hơn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 462 Biểu đồ 1: Tỷ lệ % tế bào sống theo thời gian sau khi rã đông ở 40C Perutelli trộn HES 6% vào mẫu máu dây rốn cho đến 450 ml rồi để hồng cầu trong mẫu máu lắng tự nhiên trong 30 phút thay vì tiến hành ly tâm nhẹ, đồng thời so sánh kết quả xử lý máu dây rốn với một số dung dịch cao phân tử khác nhau như HES 6%, Poligeline 3,5% và Gelatine 3%. Kết quả loại hồng cầu trong nghiên cứu đạt rất cao, đặc biệt khi sử dụng gelatine 3% và tỷ lệ thu hồi bạch cầu đạt tương đối cao(5). Tsang và cộng sự (2001) trộn dung dịch Dextran để làm lắng hồng cầu tự nhiên trong 30 phút, đồng thời so sánh hiệu quả của các dung dịch cao phân tử khác như HES hay ficoll-hypaque(7). Gần đây, Madkaikar và cộng sự (2007) xác định lại một lần nữa hiệu quả xử lý các mẫu máu dây rốn bằng cách so sánh hiệu quả của các loại dung dịch cao phân tử: Gelatine, Dextran, HES 6% trộn trực tiếp hoặc HES 6% trộn với mẫu máu dây rốn được pha loãng từ trước bằng dung dịch đệm phosphat với tỷ lệ 1:1 về thể tích. Kết quả thu hồi được 99% tế bào có nhân và loại được trên 80% hồng cầu(3). Nghiên cứu này đã ứng dụng quy trình của Rubinstein nhưng một số thông số đã được thay đổi cho phù hợp với điều kiện thực tế: - Trộn HES 6% với tỷ lệ 1:1, vì máu dây rốn thu gom được trung bình 90ml và tối đa là 150 ml được đựng trong túi máu 250 ml, nên thêm một thể tích tương đương dung dịch HES là vừa đủ thể tích của túi máu. - Sau khi để lắng 30 phút, ly tâm nhẹ với lực ly tâm 90g trong 5 phút. Quy trình áp dụng đã loại bỏ được trên 86% hồng cầu và thu hồi khoảng 90% bạch cầu. Hiện nay, có nhiều thiết bị xử lý máu dây rốn chuyên dụng được áp dụng với hiệu quả xử lý cao, quy trình tự động, khép kín. Tuy nhiên đòi hỏi trang thiết bị cao cấp và giá thành của các bộ sinh phẩm khá cao. Áp dụng quy trình tương tự để xử lý mẫu dịch hút tủy xương, những mẫu tủy đã được pha loãng từ trước với thể tích RMPI 1640 tương đương, sau đó trộn với HES và ly tâm 90g trong 5 phút. Kết quả loại hồng cầu đạt 86,4 ± 7,1% và tỷ lệ mất bạch cầu trung bình là 13,5 ± 8,6%. Kết quả cho thấy quy trình có khả năng ứng dụng tốt trong việc xử lý các mẫu tủy với thể tích nhỏ vài chục ml để áp dụng cho các mục đích điều trị khác nhau trên lâm sàng. Về hiệu suất thu hồi tế bào CD34 Với các mẫu máu dây rốn, khi ly tâm có sử dụng dung dịch HES đã thu được kết quả tốt. Tỷ lệ thu hồi bạch cầu đơn nhân đạt 80,1% và tỷ lệ thu hồi tế bào CD34 đạt 85,4%. Kết quả thu 76 80 82 84 85 93 92 70 75 80 85 90 95 100 1 2 3 4 5 6 7 Tỷ lệ tế bào sống (%) Tỷ lệ (%) 0’ 5’ 10’ 15’ 30’ 45’ 60’ Thời gian Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 463 hồi tế bào CD34 đạt tương tự các tác giả khác khi sử dụng ly tâm có dung dịch HES, nhưng cao hơn so với phương pháp tách có sử dụng poligeline của Perutelli(5) hay ly tâm phân lớp thông thường của Zingsem(10). Áp dụng quy trình kỹ thuật tương tự cho các mẫu tủy xương, hiệu suất thu hồi tế bào CD34 đạt 91,3%. Trong khi đó, với quy trình ly tâm loại huyết tương đơn thuần đã thu hồi được gần như toàn bộ các tế bào CD34 trong mẫu tế bào gốc thu từ máu ngoại vi sau huy động (99,2%). Như vậy bằng phương pháp ly tâm có sử dụng HES 6% để loại hồng cầu, kết quả thu hồi được lượng hầu hết các tế bào CD34 trong các mẫu tế bào gốc từ tủy xương, từ máu ngoại vi sau huy động và từ máu dây rốn. Về kết quả bảo quản dài ngày các mẫu tế bào gốc Tỷ lệ tế bào sống tại thời điểm ngay sau khi phá đông đạt trung bình trên 90%. Beaujour và cộng sự (1998) cũng thu được tỷ lệ tế bào có nhân sống sau bảo quản đạt trung bình 92,2%. Tỷ lệ này tiếp tục được đánh giá khi để các mẫu nghiên cứu ở 4oC. Kết quả trình bày trong biểu đồ 3.1 cho thấy tỷ lệ tế bào chết tăng dần theo thời gian. Cho đến 30 phút kể từ khi phá đông, tỷ lệ tế bào sống vẫn còn đạt gần 85%. Khoảng thời gian này đủ để vận chuyển mẫu tế bào gốc trong phạm vi bệnh viện. Tiếp tục theo dõi sau 60 phút, tỷ lệ tế bào sống sót thu được đạt gần 80%. Kết quả này có ý nghĩa thực tiễn, sau khi tan đông cần nhanh chóng truyền cho bệnh nhân, càng để lâu, tỷ lệ tế bào chết càng cao và hiệu quả ghép sẽ giảm dần. Yang và cộng sự(9) đã tiến hành khảo sát tỷ lệ tế bào sống sót sau phá đông trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 0oC, 22oC và 37oC. Kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào sống giảm dần theo thời gian và giảm thấp nhất ở điều kiện 0oC và chết nhiều nhất ở điều kiện 22oC. Ngoài việc ảnh hưởng đến tình trạng sống của tế bào có nhân, quá trình bảo quản còn ảnh hưởng đến chức năng, khả năng tăng sinh và biệt hóa, các biến đổi về màng tế bào hay các đặc điểm về khả năng kết dính, di chuyển và homing về tủy xương của các tế bào gốc. Vấn đề này vẫn còn đang tiếp tục được nghiên cứu. KẾT LUẬN Các mẫu tế bào gốc tạo máu sau quá trình thu gom đã được tiến hành xử lý theo quy trình kỹ thuật phù hợp cho từng loại chế phẩm bằng phương pháp ly tâm có sử dụng dung dịch HES 6%. Kết quả đã loại bỏ hồng cầu trong máu dây rốn và dịch hút tủy với tỷ lệ cao lần lượt là 86,4% và 88,5%, tỷ lệ mất bạch cầu thấp (dưới 13,5%). Các tế bào CD34 cũng được thu hồi với hiệu quả rất cao (thấp nhất đạt 85,4%). Các mẫu đạt tiêu chuẩn về nồng độ tế bào để tiến hành bảo quản. Quá trình bảo quản trong nitơ lỏng cũng cho phép duy trì tỷ lệ sống sót của tế bào rất cao trên 90%. Đồng thời, nghiên cứu đã đánh giá được tỷ lệ tế bào tiếp tục chết theo thời gian sau khi rã đông và bảo quản ở điều kiện 4oC. Hiệu quả xử lý và bảo quản tế bào có tỷ lệ sống cao cũng góp thêm thông tin có ý nghĩa để sử dụng hợp lý hơn các chế phẩm tế bào gốc trên lâm sàng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Beaujean F., Bourhir J.H., Bayle C., et al (1998), “Successful cryopreservation of purified autologous CD34 cells: influence of freezing parameters on cell recovery and engraftment”. Bone Marrow Transplant, 22: 1091-1096. 2. Đỗ Trung Phấn, (2009). Tế bào gốc và bệnh lý tế bào gốc tạo máu. NXB Y học. 3. Madkaikar M., Gupta M., Ghosh K. et al (2007), ”Optimizing methods of red cell sedimentation from cord blood to maximize nucleated cell recovery prior to cryopreservation”. Br.J.Biomed Sci. 64 (4): 157-159. 4. Nguyễn Quang Tùng, Nguyễn Anh Trí, Đỗ Trung Phấn, (2006), “Kết quả thu hoạch tế bào CD34 máu ngoại vi của người trưởng thành khoẻ mạnh sau huy động bằng G-CSF sử dụng cho ghép tuỷ đồng loài”. Tạp chí nghiên cứu Y học (47):13-19. 5. Perutelli P., Catellani S., Scarso L., et al (1998), “Processing of Human cord blood by three different procedures for red blood cell depletion and mononuclear cell recovery”. Vox Sanguinis, 76: 237-240. 6. Rubinstein P., Dobrila L., Rosenfield R.E., et al (1995), “Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution”. Proc.Natl. Acad.Sci., 92: 10119-10122. 7. Tsang K.S., Li K., Huang D.P. et al, (2001) ”Dextran sedimentation in a semi-closed system for the clinical banking of umbilical cord blood”. Transfusion 41 (3): 344-352. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 4 * 2011 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học 464 8. Trần Thị Mỹ Dung, Nguyễn Quang Tùng, Đỗ Trung Phấn, (2007), “Nghiên cứu xây dựng quy trình thu gom tế bào gốc tạo máu từ máu rốn đạt hiệu quả cao”, Tạp chí nghiên cứu Y học (49): 69-72. 9. Yang H., Packer J., Cabuhat M. et al (2003), “Effects of incubation temperature and time after thawing on viability assessment of peripheral hematopoietic progenitor cells cryopreserved for transplantation”. Bone Marrow Transplantation 32: 1021–1026. 10. Zingsem J., Strasser E., Weisbach V. (2003), “Cord blood processing with an automated and functionally closed system” Transfusion 43: 86-813.