Phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá chùm ngây (Moringa Oleifera Lam., Moringaceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 175 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TRONG LÁ CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA LAM., MORINGACEAE) Trần Công Luận*, Trần Thị Thúy Quỳnh**, Salihah** TÓM TẮT Mục tiêu: Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây hiện đang rất được quan tâm về hoạt tính chống oxy hóa. Để tìm hiểu sâu hơn về khả năng chống oxy của Chùm ngây, nhằm sử dụng loài cây này hiệu quả hơn, góp phần cho mục đích phát triển Chùm ngây như một loại thuốc hay thực phẩm chức năng chống oxy hóa, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam., Moringaceae)”. Đối tượng và phương pháp: Lá Chùm ngây thu tại Tri Tôn, An Giang. Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu. Phân lập và xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh trong lá Chùm ngây. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các chất phân lập được. Kết quả: Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu lá Chùm ngây. Phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa là vitexin (25 mg) và isoquercitrin (200 mg). Cả 2 chất phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat của lá Chùm ngây đều có khả năng chống oxy hóa theo những cơ chế khác nhau. Kết luận: Những kết quả nghiên cứu này cho thấy Chùm ngây có tiềm năng làm thuốc hay thực phẩm chức năng chống oxy hóa. Từ khóa: Moringa oleifera, vitexin, isoquercitrin, chống oxy hóa. ABSTRACT ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ANTIOXIDANT COMPOUNDS FROM LEAVES OF MORINGA OLEIFERA LAM., MORINGACEAE Tran Cong Luan, Tran Thi Thuy Quynh, Salihal * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 1 – 2014: 175 - 179 Objective: Chum ngay (Moringa oleifera Lam.) is well interested in antioxidant activity. In order to use the plant more effectively and contribute to developing antioxidant production of Chum ngay, this study was conducted with the aim of isolating and identifying the antioxidant compounds from leaves of Moringa oleifera Lam. Methods: Leaves of “Chum ngay” were collected at Tri Ton district, An Giang province. Isolation and structure determination of compounds having strong antioxidant activity in leaves. Isolated compounds were tested on antioxidant activities . Results: Purity standard of Chum ngay leaves was determined. Two antioxidant compounds vitexin (25 mg) and isoquercitrin (200 mg) were isolated and structural identification by means of 1D and 2D NMR techniques . Two isolated compounds had antioxidant effects with different mechanisms of action. Conclusion: The results of this study showed potential antioxidant drug or functional food from Chum ngay leaves. Keywords: Moringa oleifera, vitexin, isoquercitrin, antioxidant ∗ Trung tâm sâm và dược liệu Tp. HCM ∗∗ Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược Tp. HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Công Luận. ĐT: 0903671323. Email: congluan53@gmail.com. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 176 ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống hiện nay con người càng đối mặt với nhiều căn bệnh nguy hiểm do tác động của các chất oxy hóa: Đái tháo đường, xơ vữa động mạch, đục nhân mắt, cao huyết áp, ung thư Do đó, chất chống oxy hóa có vai trò quan trọng và không thể thiếu trong phác đồ điều trị cũng như liệu pháp dự phòng các bệnh thoái hóa và ác tính. Chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) là loài cây hiện đang rất được quan tâm về hoạt tính chống oxy hóa. Để tìm hiểu sâu hơn về khả năng chống oxy của Chùm ngây, nhằm sử dụng loài cây này hiệu quả hơn, góp phần cho mục đích phát triển Chùm ngây như một loại thuốc hay thực phẩm chức năng chống oxy hóa, chúng tôi thục hiện đề tài “Phân lập và xác định các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa trong lá Chùm ngây (Moringa oleifera Lam., Moringaceae)”. NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Lá Chùm ngây thu tại Tri Tôn, An Giang vào ngày 1/8/2010. Mẫu sử dụng bao gồm cuống và lá chét. Mẫu được thu hái, loại bỏ bụi bẩn, lá hư, sâu Một phần được phơi khô ở 50 0C – 60 0C rồi xay nhỏ thành bột. Một phần lá tươi được dùng để chiết etanol thu cao toàn phần. Mẫu được định danh và lưu trữ tại Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh. Phương pháp nghiên cứu Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu Xác định độ ẩm bột dược liệu, xác định độ tro toàn phần, xác định độ tro không tan trong acid hydrocloric theo DĐVN IV (1) Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật có trong lá Chùm ngây. Nghiên cứu hóa học Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp ngấm kiệt và cô thu hồi để được cao cồn toàn phần. Cao cồn toàn phần được chiết phân bố lỏng – lỏng qua các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được các cao phân đoạn. Cao cồn toàn phần và các cao phân đoạn được tiến hành định lượng phenolic tổng bằng phương pháp Folin – Ciocalteu theo Waterman và Mole (1994)(5) và được sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa bằng phản ứng quét gốc tự do DPPH. Phân lập các chất trong các cao có hoạt tính chống oxy hóa cao bằng sắc kí cột nhanh – cột khô và sắc kí cột cổ điển với hệ dung môi đã thăm dò trên SKLM. Tinh chế các chất phân lập được bằng cách lọc qua phễu thủy tinh xốp và kết tinh lại với dung môi phù hợp. Khảo sát cấu trúc hóa học các chất phân lập được bằng các phương pháp phổ UV, phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR. Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa các chất phân lập được Phương pháp quét gốc tự do DPPH(4) Dựa vào phương trình hồi quy, tính được giá trị IC50 là nồng độ quét được 50% gốc tự do DPPH. Các mẫu có giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính chống oxy hóa càng cao. Phương pháp xác định năng lực khử: Theo phương pháp của Yen và Duh (1993) (6) Phương pháp thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do: Được xác định theo phương pháp của Li và cộng sự (2007) (3) KẾT QUẢ Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu Xác định giảm khối lượng do sấy khô là 78,13 %. Độ ẩm bột dược liệu là 8,857 %. Độ tro toàn phần là 13,30 %. Tro không tan trong HCl là 0,36 %. Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật, trong là Chùm ngây có các hợp chất tinh dầu, acid béo, carotenoid, triterpenoid, alkaloid, anthraquinon, coumarin, tanin, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu cơ và polyuronic. Chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn Từ 10 kg nguyên liệu lá tươi thu được 600 g cao toàn phần. Bằng phương pháp chiết lỏng – Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 177 lỏng, thu được 4 cao phân đoạn: Cao eter 168 g, cao cloroform 2,63 g, cao etyl acetat 28,40g, cao nước 120 g. Định lượng phenolic toàn phần và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn Định lượng phenolic toàn phần - Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao cồn toàn phần là 108,011 µg GAE/mg (µg đương lượng acid gallic/ml), chiếm khoảng 8,6 % khối lượng cao. Kết quả cho thấy lá Chùm ngây có chứa hàm lượng phenolic khá cao, vì vậy có tiềm năng là nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên dồi dào. - Hàm lượng phenolic toàn phần trong cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 µg GAE/mg, 110,914 µg GAE/mg, 271,822 µg GAE/mg, 90,881µg GAE/mg. Hàm lượng phenolic toàn phần tập trung nhiều nhất trong phân đoạn etyl acetat. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thông qua cơ chế quét gốc tự do DPPH. Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của cao cồn toàn phần, cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 95,26 µg/ml, 287,79 µg/ml, 148,35 µg/ml, 24,59 µg/ml và 206,69 µg/ml. Kết quả cho thấy phân đoạn etyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao nhất. Phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa Tiến hành khai triển các cao phân đoạn trên SKLM với hệ dung môi etyl acetat – metanol – nước (100: 17: 13) sử dụng thuốc thử DPPH. Kết quả cho thấy các chất có hoạt tính chống oxy hóa tập trung trong phân đoạn etyl acetat chủ yếu là các hợp chất phenolic. Tiến hành sắc kí cột nhanh – cột khô phân đoạn etyl acetat với hệ dung môi rửa giải: Cloroform 100% thu được 2 phân đoạn, etyl acetat 100% thu được 4 phân đoạn (E1-E4), etyl acetat – metanol (50 : 50) thu được 1 phân đoạn (EM). Kiểm tra trên SKLM phân đoạn E4 và EM có chứa nhiều thành phần có hoạt tính chống oxy hóa và khối lượng cao lớn. Phân đoạn E4 được tiến hành sắc ký cột cổ điển phân lập các hợp chất tinh khiết. Hệ dung môi giải ly là etyl acetat : metanol, thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 3, xuất hiện tủa màu vàng lắng dưới đáy. Tách riêng tủa và rửa tủa bằng metanol, thu được chất I. Từ phân đoạn 5, 6 xuất hiện kết tinh hình kim màu vàng. Tách riêng kết tinh, làm sạch bằng cách cho tái kết tinh trong dung môi etyl acetat, thu được chất II. Chất I và chất II được đo và giải phổ NMR (phổ H, phổ C, DEPT, HSQC, COSY, HMBC) và khối phổ MS. Chất I: 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δc163,85; 102,37; 181,97; 155,90; 98,08;162,49; 104,55; 160,32; 103,96; 121,54; 128,81; 115,73; 161,03; 115,73; 128.81; 73,31; 70,82; 78,62; 70,54; 81,71; 61,26. 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH 4,93 (1H,d, J = 9,8 Hz, H-1’’); 6,77 (1H, s, H-3); 6,88 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-5’); 6,90 (2H, d, J= 8,7 Hz, H-3’); 8,01(2H, d, J = 8,7 Hz, H-6’); 8,03 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2’); 13,16 (1H, s, 5-OH). Chất II: 13C-NMR (125 MHz, DMSO) δc 156,16; 133,35; 177,39; 161,18; 98,58; 164,03; 93,42; 156,27; 103,95; 121,15; 115,15; 144,72; 148,37; 116,19; 121,51; 100,96; 74,06; 76,49; 69,94; 77,42; 60,97. 1H-NMR (500 MHz, DMSO) δH 5,45 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-1″);6,20 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-6); 6,40 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-8); 6,83 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-5′); 7,56 (1H, br s, H-2′); 7,58 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-6′). Phổ H và phổ C của chất I và chất II được đối chiếu với phổ của chất chuẩn đã được công bố ta thấy chất I đúng là vitexin (C21H20O10 : (1S)-1,5- anhydro-1-[5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)- 4-oxo-4H-chromen-8-yl]-D-glucitol)(7) và chất II là isoquercitrin (C21H20O12: 2-(3,4- dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4-oxo-4H- chromen-3-yl β-D-glucopyranosid) (2). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 178 (I) (II) Hình 1. Cấu trúc của vitexin (I) và isoquercitrin (II) Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các chất phân lập Hoạt tính quét gốc tự do DPPH Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin là 85,18 µg/ml và 6,64 µg/ml. Isoquercitrin có hoạt tính cao hơn vitexin và cao hơn chứng dương vitamin C. Hình 2. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin Hình 3. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của Isoquercitrin. Khảo sát năng lực khử Ở nồng độ 1000 µg/ml, vitexin đạt được 21,66 % năng lực khử của vitamin C và isoquercitrin đạt được 70% năng lực khử của Vitamin C. Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin và vitamin C lần lượt là 248,152‡g/ml, 394‡g/ml và 2183‡g/ml. Kết quả cho thấy vitexin có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do cao nhất, cao hơn vitamin C. Hình 4. Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và Vitamin C. Hình 5. Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 179 BÀN LUẬN Chùm ngây là đối tượng đang được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như trong nước. Kết quả cho thấy các hợp chất trong lá Chùm ngây có tiềm năng làm thuốc hay thực phẩm chức năng chống oxy hóa. KẾT LUẬN Đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước được công bố đã phân lập được 2 hợp chất flavonoid là vitexin (25mg) và isoquercitrin (200mg) có hoạt tính chống oxi hóa từ phân đoạn etyl acetat trong lá Chùm ngây. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa các chất phân lập được cho thấy: - Isoquercitrin có hoạt tính quyét gốc tự do DPPH cao hơn vitexin và cao hơn chứng dương vitamin C. - Vitexin đạt được 21,66 % năng lực khử của vitamin C và isoquercitrin đạt được 70% năng lực khử của Vitamin C - Vitexin có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do cao nhất, cao hơn vitamin C. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr.PL – 182, PL – 183, PL – 239. 2. Deepralard K., Kazuko K., Masataka M., Thitima P., Rutt S. (2009). Flavonoid glycosides from the leave of Uvaria rufa with advanced glycation end – products inhibitory activity. Thai J. Pharm. Sci., 33, pp. 84 – 90 3. Li TR, Yang ZY, Wang BD (2007). Synthesis, characterization and antioxidant of naringenin schiff base and its Cu (II), Ni(II), Zn (II) complexes. Chem Pharm Bull, 55, pp. 26 – 28. 4. Nguyễn Thị Thu Hương (2010). Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum. Tạp chí Y học TP. HCM, tập 14 số 2, tr. 131 - 132 5. Pilaipark C., Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M (2008). The in vitro and ex vitro antioxidant properties, hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water extract of Moringa oleifera Lam. Leave. Journal of Ethnopharmacology, 119, pp. 439 – 436. 6. Zhang Z., Jin J., Shi L. (2008). Antioxidant activities of derivative of polysacchride extracted from a Chinese medical herb (Ramulus mori). Food Sci. Technol. Res., 14, pp. 160 -1 68. 7. Zhou X., Peng J., Guorong F. (2005). Isolation and purification of flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed counter-current chromatography by stepwise increasing the flow-rate of the mobile phase. J Chromatoqr A., 1092 (2), pp. 216 – 221. Ngày nhận bài báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/10/2013, 20/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014